Page 138 - 《广西植物》2020年第6期
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８ ８ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
ＧＧＰＰＳ 基因的特异性引物ꎮ 伸 ５ ｍｉｎ(朱畇昊等ꎬ２０１６)ꎮ １％ 琼脂糖凝胶电泳
以夏枯草叶片 ｃＤＮＡ 为模板进行扩增:ｃＤＮＡ 检测 ＰＣＲ 产物ꎬ将扩增的目的条带切胶回收纯化ꎬ
２.０ μＬꎬ２ × Ｅｓ Ｔａｑ ｍｉｘ １０ μＬꎬ１０ μｍｏｌＬ 正反向 并连接到 ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体上ꎬ蓝白斑筛选ꎬ菌落经
￣１
引物各 １ μＬꎬｄｄ Ｈ Ｏ ６ μＬ 至体积为 ２０.０ μＬꎮ 反 ＰＣＲ 检测后的阳性克隆送往上海生工生物技术有
２
应程序: ９５ ℃ 预变性 １ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ６０ ℃ 限公司进行双向测序ꎮ 夏枯草中 ＧＧＰＰＳ 基因的特
退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 １.５ ｍｉｎꎬ３５ 个循环ꎻ７２ ℃ 延 异性引物见表 １ꎮ
表 １ 引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
基因名称 引物序列 (５′￣３′) 用途
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) Ｕｓｅ
ＧＧＰＰＳ￣Ｆ ５′￣ＣＴＣＧＡＣＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧＴＴＣＡＡＴＴＴＣ￣３′ 基因克隆
Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ
ＧＧＰＰＳ￣Ｒ ５′￣ＧＡＧＧＴＴＡＧＧＴＣＡＴＴＡＡＴＧＧＣＴＴＴＣＣＴ￣３′
ｅＧＧＰＰＳ￣Ｆ ５′￣ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＡＴＴＧＡＡＴＣＴＡ￣３′ 基因表达
Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｅＧＧＰＰＳ￣Ｒ ５′￣ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＴＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡＧＣＡ￣３′
ｑＧＧＰＰＳ￣Ｆ ５′￣ＴＣＣＴＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＡＡＡＴＣＣ￣３′ ｑＰＣＲ
ｑＧＧＰＰＳ￣Ｒ ５′￣ＴＴＣＴＣＣＧＣＣＡＣＧＴＡＧＧＣＡＴＴ￣３′
ｑａｃｔｉｎ￣Ｆ ５′￣ＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＡ￣３′ 内参
Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
ｑａｃｔｉｎ￣Ｒ ５′￣ＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＣＡＧ￣３′
注: 划线部分为 Ｘｈｏ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ 的酶切位点ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ ｐａｒｔ ｉｓ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｘｈｏ Ｉ ａｎｄ ＢａｍＨ Ｉ.
１.２.３ 生物信息学分析 运用多种在线工具对夏 份)ꎬ对生长状态一致的夏枯草果穗进行处理ꎬ分
枯草中 ＧＧＰＰＳ 基因及编码蛋白进行生物信息学分 别喷洒 ５０ μｍｏｌＬ 茉莉酸甲酯( ＭｅＪＡ)、１７. １４
￣１
析ꎮ 利用 ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ 在线软件分析开放阅读框ꎻ运 μｍｏｌＬ 吲哚乙酸( ＩＡＡ)、１００ μｍｏｌＬ 乙烯利
￣１
￣１
用 ＤＮＡＭＡＮ 软件翻译目的基因氨基酸序列ꎬ比对 (ＥＴＨ)、１００ μｍｏｌＬ 硝普钠( ＳＮＰ)、１ ｍｍｏｌＬ ￣１
￣１
￣１
同源 蛋 白 的 序 列ꎻ 利 用 ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ 无水 氯 化 钙、 １０ μｍｏｌ Ｌ 水 杨 酸 ( ＳＡ)、 ２. ８８
￣１
Ｐｒｏｔｐａｒａｍ 在线软件分析目的蛋白的理化性质ꎻ在 μｍｏｌＬ 赤霉素( ＧＡ３)ꎮ 以喷洒前(０ ｈ) 的果穗
线软件 ＳｉｎａｌＰ４.１ Ｓｅｒｖｅｒ 用于预测信号肽ꎻ运用软 为对照ꎬ２４ ｈ 后采集处理组样品ꎮ
件 ＳＭＡＲＴ 分析目的蛋白功能域ꎮ 在线软件 ＮＰＳＡ 对夏枯草果穗、茎、叶及喷施 ７ 种外源物质的
ｓｅｒｖｅｒ 和 Ｓｗｉｓｓ￣Ｍｏｄｅｌ 分别用于预测蛋白质的二级 果穗中 ＧＧＰＰＳ 基因相对表达量进行实时荧光定量
和三级结构ꎻ运用在线工具 ＢａＣｅＩｌｏ 和 ＣｈｌｏｒｏＰ 预 ＰＣＲ ( ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲꎬ ｑＰＣＲ ) 检 测ꎬ
测细胞 定 位 和 叶 绿 体 转 运 肽 切 割 位 点ꎮ 运 用 ｑＰＣＲ 检 测 的 反 应 体 系: ２ × ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ
ＭＥＧＡ ７ 软件对目的基因及同源基因的氨基酸序 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ１０ μＬꎬＱＮ Ｒｏｘ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ ０.１ μＬꎬ正
列构建进化树分析ꎮ 反向引 物 均 为 ０. ４ μＬꎬ 模 板 ｃＤＮＡ ２ μＬꎬ ＲＮａｓｅ￣
１.２.４ 夏枯草 ＧＧＰＰＳ 基因的表达特性分析 采集 Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ７.１ μＬ 至终体积为 ２０ μＬꎮ 反应程序:
新鲜的夏枯草叶片、果穗和茎ꎬ用自来水清洗干 ９５ ℃ 预变性 ２０ ｓ 后ꎬ进行 ４０ 个循环(９５ ℃ ꎬ１ ｓꎻ
净ꎬ滤纸吸干水分ꎬ置液氮中冷冻后ꎬ放 － ８０ ℃ 超 ５６ ℃ ꎬ２０ ｓꎻ９５ ℃ ꎬ１ ｓ)ꎬ６０ ℃ ꎬ２０ ｓꎻ９５ ℃ ꎬ１ ｓꎮ 夏
低温冰箱备用ꎮ 在夏枯草生长旺盛的时期(６ 月 枯草 ａｃｔｉｎ 基因作为内参ꎬ扩增完成后进行溶解曲
