Page 141 - 《广西植物》2020年第1期

１ 期 朱家红等: 海南龙血树 ＷＤ４０ 转录因子基因 ＤｃＷＤ４０￣１ 的克隆和表达分析 １ ３ ７

ｍａｔｉｏｎ ｒｅｍａｉｎ ｕｎｋｎｏｗｎ. ＷＤ４０ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ａ
ＷＤ４０ ｇｅｎｅ ｎａｍｅｄ ＤｃＷＤ４０￣１ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ Ｄｒａｃａｅｎａ ｃａｍｂｏｄｉａｎａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｄａｔａ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏ￣
ｌｏｇｙ. Ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｃＤＮＡ ｏｆ ＤｃＷＤ４０￣１ ｗａｓ １ ５５０ ｂｐꎬ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １ ３５３ ｂｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ (ＯＲＦ)ꎬ ａｎｄ
ｅｎｃｏｄｉｎｇ ４５０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ５０.７７ ｋＤ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｐＩ ５.７１. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤｃＷＤ４０￣１ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ＷＤ４０ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙꎬ ｈａｄ ｆｉｖｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＷＤ４０ ｄｏｍａｉｎｓꎬ ａｎｄ
ｓｈａｒｅｄ ｈｉｇｈ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｔｏ ＷＤ４０ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ. Ａ １ ５０３ ｂｐ￣ｌｅｎｇｔｈ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＤｃＷＤ４０￣１ ｗａｓ ｉｓｏｌａ￣
ｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄꎬ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｙｐｉｃａｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ. Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅ￣
ｇｉｏｎ ｏｆ ＤｃＷＤ４０￣１ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｌｏｔｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓꎬ ｓｕｃｈ ａｓ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔꎬ ａｕｘｉｎ￣
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔꎬ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔꎻ ａｌｓｏ ｈａｄ ｍａｎｙ ｃｉｓ ａｃｔｉｎｇ
ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｌｉｇｈｔꎬ ｃｏｌｄꎬ ｈｏｔ ａｎｄ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｉｎｄｕｃｅｒ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＤｃＷＤ４０￣１ ｗａｓ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｒａｇｏｎｓ ｂｌｏｏｄ ｉｎｄｕｃｅｒｓꎬ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒａｇｏｎｓ ｂｌｏｏｄ. Ｉｎ
ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ＤｃＷＤ４０￣１ ｃａｎ ａｌｓｏ ｒｅｓｐｏｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｔｏ ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄꎬ ｃｙｔｏｋｉｎｉｎꎬ ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ ａｎｄ ＵＶ￣Ｂ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｌｌ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＤｃＷＤ４０￣１
ｉｎ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｄｒａｃａｅｎａ ｃａｍｂｏｄｉａｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｄｒａｃａｅｎａ ｃａｍｂｏｄｉａｎａꎬ ｄｒａｇｏｎｓ ｂｌｏｏｄꎬ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓꎬ ＷＤ４０ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎬ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

血竭是一种传统名贵中药ꎬ具有活血化瘀、消 ２０１６)、石榴 ＰｇＷＤ４０ (Ｂｅｎｓｉｍｈｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)、苦
炎镇 痛 和 止 血 生 肌 等 功 效 ( Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００８ꎻ 荞麦 ＦｔＷＤ４０ ( Ｙａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)、西红柿 ＳｌＡＮ１１
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)ꎮ 海南龙血树 ( Ｄｒａｃａｅｎａ ｃａｍ￣ ( Ｇａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎬ 但 在 海 南 龙 血 树 中 还 未 见
ｂｏｄｉａｎａ) 是 国 产 血 竭 的 基 源 植 物 ( 郑 道 君 等ꎬ ＷＤ４０ 类转录因子的报道ꎮ
２００９ꎻ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ 前期研究表明海南龙 在先前的研究中ꎬ项目组采用“ 无机盐诱导剂
血树血竭中的主要化学成分以类黄酮化合物为主 输液法”专利技术对海南龙血树进行诱导产生了
(Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ Ｗａｎｇ ｅｔ 血竭ꎬ并对血竭的成分及诱导前后的转录组数据
ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 海南龙血树及其血竭中的类黄酮化 进行了分析ꎬ推导出类黄酮生物合成途径ꎬ并筛选

合物具有多种生物学活性ꎬ如抗癌、抗肿瘤、抗炎、 获得一条编码 ＷＤ４０ 的基因ꎬ推测其可能在类黄
抗真菌、凝血酶抑制和抗增殖活性等( Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ 酮生 物 合 成 过 程 中 具 有 调 控 作 用 ( Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ
２０１１ꎻ Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３ꎻ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 目 ２０１６)ꎮ 本研究将在此基础上对该基因进行克隆ꎬ
前ꎬ人们对血竭的化学成分、药理活性及临床应用 并分析其时空表达特征ꎬ为研究其在类黄酮生物
的研究较多ꎬ但对类黄酮积累和血竭形成机制并 合成中的潜在功能和作用机制奠定基础ꎮ

不了解 (Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ
植物类黄酮生物合成主要受结构基因( 编码 １ 材料与方法
类黄酮生物合成的各种酶类) 和调节基因(转录因
子)的控制 (Ｔｏｈｇｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ ＷＤ４０ 转录因子 １.１ 材料
可与 ＭＹＢ 和 ｂＨＬＨ 转录因子互作形成 ＭＢＷ 复合 实验所需的植物材料海南龙血树种植于中国
体协同调控多个结构基因的表达ꎬ参与类黄酮的 热带农业科学院生物技术研究所内ꎮ 使用 １０％血
生物合成(Ｘｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ ＷＤ４０ 蛋白是真核生 竭诱导剂通过输液的方法注射海南龙血树茎部ꎬ
物中普遍存在的蛋白家族之一ꎬ 在进化中高度保 处理后 ０、３、６ ｄ 取样ꎬ具体参考 Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ.(２０１６)ꎻ
守ꎬ通常含有多个由 ４０ ~ ６０ 个氨基酸残基组成的 选取生长一致的组培苗移置于液体培养基中 ７ ｄ
ＷＤ４０ 重复基序 (Ｘｕ ＆ Ｍｉｎꎬ ２０１１)ꎮ 目前参与类 后进行胁迫紫外辐射胁迫( ＵＶ￣Ｂ) 处理和叶片喷
黄酮合成相关的 ＷＤ４０ 基因已在多种植物中得到 施 ２００ μｍＬ 茉莉酸(ＭｅＪＡ)、脱落酸( ＡＢＡ)、细
￣１
分离与鉴定ꎬ如拟南 ＴＴＧ１ ( Ｂａｕｄｒｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４)、 胞分裂素(ＣＴＫ)和油菜素内酯( ＢＲ) 处理ꎬ处理 ０、
苹果 ＭｄＴＴＧ１ ( Ａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)、杨梅 ＭｒＷＤ４０￣１ ３、１２、２４ ｈ 后取样ꎮ 所有样品采集后ꎬ液氮速冻ꎬ
(Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３ )、 柿 ＤｋＷＤＲ１ ( Ｎａｖａｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ 于－８０ ℃ 保存ꎮ