Page 142 - 《广西植物》2020年第1期
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１ ３ ８ 广 西 植 物 ４０ 卷
１.２ 核酸提取及 ｃＤＮＡ 合成 ｑＰＣＲ 反应体积 ２０ μＬ:１０ μＬ ２×ＳＹＢＲ ｍｉｘꎬ正反向
总 ＲＮＡ 和 ＤＮＡ 按照成都福际生物技术有限 引物各 １ μＬ (１０ μｍＬ )ꎬ１ μＬ ｃＤＮＡ 模板ꎬ７ μＬ
￣１
公司(ＦＯＲＥＧＥＮＥ) 的 Ｐｌａｎｔ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｄｄＨ Ｏꎮ ｑＰＣＲ 反应条件:９５ ℃ １０ ｍｉｎꎻ９５ ℃ １５ ｓꎬ
２
试剂盒和 Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 提取ꎮ 总 ＲＮＡ 按 ６０ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃ ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 采用 ２ ￣ΔΔＣｔ 法分
照江苏愚 公 生 命 科 技 有 限 公 司 ( ＮＯＶＡ Ｙｕｇｏｎｇ 析基因的相对表达量ꎮ
Ｂｉｏｌａｂｓ ) 的 Ａｌｌ￣ｉｎ￣Ｏｎｅ Ｆｉｒｓｔ￣Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ＭａｓｔｅｒＭｉｘ (ｗｉｔｈ ＤＮａｓｅ Ｉ) 试剂盒的方法反转录为 ２ 结果与分析
ｃＤＮＡꎮ
１.３ ＤｃＷＤ４０￣１ 的基因及启动子克隆 ２.１ ＤｃＷＤ４０￣１ 的克隆
根据海南龙血树转录组数据中 ＷＤ４０ 的 ＥＳＴ 根据 在 海 南 龙 血 树 转 录 组 数 据 中 获 得 的
序列ꎬ设计 ５′端特异引物 ＷＤ４０Ｆ:５′￣ＣＴＡＣＡＡＡＴ￣ ＷＤ４０ 基因的 ＥＳＴ 序列ꎬ设计特异引物对该基因的
ＴＣＡＴＧＴＧＡＧＣＧＧ￣３′和 ３′ 端 引 物 ＷＤ４０Ｒ: ５′￣ＣＧ￣ 全长序列进行扩增ꎬ获得一条 １ ５００ ｂｐ 左右的特
ＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＣＡＧ￣３′ꎬ 分 别 以 ｃＤＮＡ 为 异条带ꎮ 将目的片段连接到 Ｔ 载体上进行测序ꎬ
模板对 ＤｃＷＤ４０￣１ 进行扩增ꎮ 扩增产物经琼脂糖 测序结果与通过转录组测序得到结果一致ꎬ将该
凝胶电泳鉴定ꎬ回收目的条带与 ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体连 基因命名为 ＤｃＷＤ４０￣１ꎮ 本研究获得的 ＤｃＷＤ４０￣１
接并转化大肠杆菌 ＤＨ５αꎬ通过菌落 ＰＣＲ 鉴定阳 基因全长 １ ５５０ ｂｐꎬ包含一个 １ ３５３ ｂｐ 完整的开放
性克隆ꎬ送诺赛基因公司测序ꎮ 利用 ＥｘＰＡＳｙ 在线 阅读框ꎮ
软件(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / )分析预测蛋白的氨 ２.２ ＤｃＷＤ４０￣１ 的分子特征
基酸组成、分子式、分子量和等电点ꎻ利用 ＰＳＯＲＴ ＤｃＷＤ４０￣１ 编码蛋白由 ４５０ 个 氨 基 酸 组 成ꎬ
(ｈｔｔｐ: / / ｐｓｏｒｔ１.ｈｇｃ.ｊｐ / ｆｏｒｍ.ｈｔｍｌ)预测亚细胞定位ꎻ 其中 甘 氨 酸 ( Ｇｌｙ) 和 丝 氨 酸 ( Ｓｅｒ) 最 多ꎬ 有 ４０
利用 ＤＮＡＭＡＮ 软件进行氨基酸序列比对分析ꎮ 个ꎬ占比 达 到 ８. ９％ꎮ ＤｃＷＤ４０￣１ 蛋 白 分 子 式 为
利用 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 公司的 Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ预测分子量为 ５０.７７ ｋＤꎬ理论
２２３８ ３４１２ ６３４ ６８９ １７
２.０ Ｋｉｔ 对 ＤｃＷＤ４０￣１ 的启动子进行克隆ꎮ 将基因 等电点 ５.７１ꎮ 亚细胞定位预测显示 ＤｃＷＤ４０￣１ 定
组 ＤＮＡ 经 ＥｃｏＲＶ、ＳｔｕⅠ、ＰｖｕⅡ 和 ＤｒａⅠ４ 种内切 位于微体中可能性最大ꎬ达到 ７１.４％ꎮ 氨基酸序
酶酶切后ꎬ在 Ｔ４ 连接酶作用下与接头连接ꎮ 以连 列分析发现ꎬＤｃＷＤ４０￣１ 具有植物 ＷＤ４０ 转录因子
接产物为模板ꎬ采用接头引物( ＡＰ１ 和 ＡＰ２ꎬ试剂 的结构特征ꎬ包含 ５ 个 ＷＤ４０ 重复基序ꎮ ＤｃＷＤ４０￣１
盒提供) 和基因特异引物( ＰＷＤ:５′￣ＴＧＧＡＧＧＴＧ￣ 的氨基 酸 序 列 与 海 枣 ( Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ)、 油 棕
ＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣＧ￣３′ꎻＰＷＤ２:５′￣ＧＡＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＴ￣ ( Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ )、 深 圳 拟 兰 ( Ａｐｏｓｔａｓｉａ
ＧＧＡＴＴＡＴＡＧＧＡ￣３′)进行两轮 ＰＣＲ 扩增ꎮ 扩增产 ｓｈｅｎｚｈｅｎｉｃａ) 和 铁 皮 石 斛 ( Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｔｅｎａｔｕｍ)
物经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴 定ꎬ 回 收 目 的 条 带 与 中相应 ＷＤ４０ 氨基酸序列的同源性分别为 ７７.１％、
ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体连接并转化大肠杆菌 ＤＨ５αꎬ通过菌 ７６.９％、７５.６％和 ７４.９％ꎮ
落 ＰＣＲ 鉴定阳性克隆ꎬ送诺赛基因公司测序ꎮ 利 ２.３ ＤｃＷＤ４０￣１ 启动子的克隆和序列分析
用 在 线 工 具 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. 利用 Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ 方法分离了 ＤｃＷＤ４０￣１
ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ/ ) 进行启动子 启动子区１ ５０３ ｂｐꎬ该区域具有典型真核生物启动
元件分析ꎮ 子结构特征ꎬ包含多个 ＴＡＴＡ￣ｂｏｘ、ＣＡＡＴ￣ｂｏｘ 等基
１.４ 基因表达分析 本元件ꎮ 此外ꎬ该启动子序列中含有细胞分裂素
利 用 ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试 剂 盒 在 响应元件 ＣＭＲｓ、脱落酸相应元件 ＡＢＲＥ、生长素响
Ｍｘ３００５Ｐ Ｒｅａｌ￣Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ 上 进 行 ｑＰＣＲ 分 应元件 ＴＧＡ￣ｂｏｘ、水杨酸响应元件 ＴＣＡ￣ｅｌｅｍｅｎｔ 和
析ꎮ 内参基因为 Ａｃｔｉｎꎬ引物序列为 ｑＤｃＡＣＴ￣Ｆ(５′￣ 茉莉酸响应元件 ＣＧＴＣＡ￣ ｍｏｔｉｆ 等激素响应元件ꎻ
ＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＧＴＡＣＴＣＡＴＴ￣３′)ꎬｑＤｃＡＣＴ￣Ｒ ( ５′￣ 还有防卫和胁迫响应元件 ＴＣ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ、厌氧诱导
ＣＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＴＡＡＴＣ￣３′)ꎻ 目 的 基 因 引 物 元件激发子响应元件 ＡＲＥ、热激响应元件 ＨＳＥ 和
ｑＷＤ１￣Ｆ ( ５′￣ＧＡＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴ￣３′) 和 低温响应元件 ＬＴＲ 以及多个光相应元件ꎬ如３￣ＡＦ１
ｑＷＤ１￣Ｒ (５′￣ＴＴＴＧＴＴＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡ￣３′)ꎮ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ、 ＡＴＣＣ￣ｍｏｔｉｆ、 ＡＴＣＴ￣ｍｏｔｉｆ、 Ｂｏｘ Ｉ、 ＧＡ￣
