Page 157 - 《广西植物》2022年第9期
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ँ 期 王 宏 鹏 等 ᧥ 西藏大花红景天 ቴዞࣷዛ௴ 与 ቴዞ᧣ᦵ 基因克隆及功能分析 ϟ ጢ ँ ሕ
ϟᤃ 酵母表达载体构建和胁迫分析জ 利用无缝克 ʐᓣ Ⴅᅳצᅳ 拼接技术获得 ࣼႿᔽ੫ᔀႿᔀ༁ 序列并进行功能注
隆法构建大花红景天 ቴዞࣷዛ௴ 和 ቴዞ᧣ᦵϟ 的 ᡱɟጶ୩ԡ 释ᤥ 最终得到 条编码过氧化氢酶 ऊዶఋ 的基因分
表达载体ᖔ大肠杆菌阳性克隆经菌液 ۪ऊ 和 ୩ᑕႿ੫ᔀʢ 别命名为 ቴዞࣷዛ௴ 和 ቴዞࣷዛ௴ϟᖔ得到 ሕ 条编码超氧化
测序验证ᤥ 将空载质粒ܦ重组载体质粒按照 ᓂᔽఋጶ ᣰ 物 歧化酶 ୩ᨃ᧕ 的基因分别命名为 ቴዞ᧣ᦵϟܦ
۪ጶ᥈ 法转入酿酒酵母 ᧧શ୩ऊ᧧ 中ᤥ 分别取 ᧧શ୩ऊ᧧ ቴዞ᧣ᦵܦቴዞ᧣ᦵሕᖔϟ 条编码超氧化物歧化酶的铜伴
ྉᡱɟጶ୩ԡܦᡱɟጶ୩ԡ᥋ቴዞࣷዛ௴ܦᡱɟጶ୩ԡ᥋ቴዞ᧣ᦵϟɯ 单克 侣的基因 ቴዞࣷࣷᤥ
隆于 ԡ ቝᓂ 含 ᠮ葡萄糖的 ୩ऊ ᣰ ᥋Вʢᑕ 液体培养基中ᖔ 根据各基因 ࣼႿᔽ੫ᔀႿᔀ༁ 序列分别设计引物ᖔ以大
ሕԡ ቩ ᣰ ϟऐԡ ʢኼቝᔽႿ 培养至 ᨃ᧕ᤃԡԡ 位于 ԡጢ ጲ ԡऐ 之 花红景天叶片 ዹ᧕શዶ 为模板进行扩增ᖔ扩增产物经
᥋ϟ
间ᤥ 收集菌体重悬于含 ᠮ半乳糖的 ୩ऊ ᣰ ᥋Вʢᑕ 液体 ϟᠮ琼脂糖凝胶电泳检测ᖔ结果见图 ϟᤥ 由图 ϟ 可
培养基中ᖔ调整 ᨃ᧕ᤃԡԡ ᢉ ԡᖔሕԡ ቩ ᣰ ϟऐԡ ʢኼቝᔽႿ 诱 知ᖔቴዞࣷዛ௴ 和 ቴዞࣷዛ௴ϟ 基因长度均为ϟ ࿗Ꭾँ ᤦᡱᖔ编码
᥋ϟ
导 ࿗ ၤᤥ 将诱导后的阳性菌株按照 ϟԡ 倍梯度稀释ᖔ 为 ࿗ँ 个氨基 酸ᖔ 分子量稍有不同ᖔዹऊዶఋ 为
取 ᤃဂᓂ 分别滴于不同 ɟ۪᧕ዶ 平板中进行胁迫处理ᤥ ጢᤃ Ꭾԡϟԡ࿗ ᧕ᑕᖔዹऊዶఋϟ 为 ጢᤃ ऐϟऐँ ᧕ᑕᤥ ቴዞ᧣ᦵϟ
胁迫条件为热胁迫ྉሕᎮ ቩ处理 ϟʛɯܦ冷胁迫ྉͱԡ ቩ 和 ቴዞ᧣ᦵ 基因编码 ऊࣼ ᣰ ԻႿ ୩ᨃ᧕ᖔ核苷酸 大 小 为
处理 ᤃၤɯܦ过氧化氢胁迫ྉɟ۪᧕ዶ 平板中加入 ԡऐܦ ࿗Ꭾϟ ᣰ ᤃᤃँ ᤦᡱᖔ 编码 ϟጢᤃ ᣰ 个氨基酸ᖔ 分子 量 为
ϟᤃܦሕ ቝቝᆍኼᓂ ̀ ᨃ ɯܦ盐胁迫ྉɟ۪᧕ዶ 平板中加 ϟᤃ ԡᎮԡϟ ᣰ ϟ ऐᎮԡᎮ ᧕ᑕଫ ቴዞ᧣ᦵሕ 基因编码 èᔀ
᥋ϟ
入 ԡԡܦ࿗ԡԡܦᤃԡԡ ቝቝᆍኼᓂ શᑕऊɯܦ重金属和碱胁迫 ୩ᨃ᧕ᖔ核苷酸数量为 ऐԡ࿗ ᤦᡱᖔ可编码 ᤃᎮ 个氨基酸ᖔ
᥋ϟ
᥋ϟ ᥋ϟ 蛋白质分子量为ሕԡ ऐϟᤃሕϟ ᧕ᑕᤥ ቴዞࣷࣷ 基因大小
ྉ平板中加入 ጢܦϟԡ ቝቝᆍኼᓂ ऊᆍऊ 或 ԡ ቝቝᆍኼᓂ
શᑕ ऊᨃ ɯᤥ 将上述平板倒置于 ሕԡ ቩ培养箱中培养 ሕ 为ϟ ԡԡऐ ᤦᡱᖔ编码 ሕሕጢ 个氨基酸ᤥ
ሕ
ʛ 后拍照ྉۼᑕႿ੫ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡԡऐɯᤥ
ϟᎮ ቴዞࣷዛ௴ 和 ቴዞ᧣ᦵϟ 自激活鉴定与互作蛋白筛
选জ 酵母双杂交筛选拟南芥文库依 ऊᆍႿᡷᔀዹၤ 公司
ᥘᑕᡷዹၤቝᑕҴᔀʢ ᥈ᆍʛ ɟᔀᑕ༁ᡷ ఋऔᆍ᥋̀ᢃᤦʢᔽʛ ୩ᢃ༁ᡷᔀቝ В༁ᔀʢ
ᥘᑕႿࣼᑕ 说明书进行ᤥ 构建 ቴዞࣷዛ௴ 和 ቴዞ᧣ᦵϟ 基因
的诱饵载体ᖔ通过 ᓂᔽఋጶ ᣰ ۪ጶ᥈ 法转化 ɟ̀ ᥈ᆍʛ 菌
株ଫ经菌液 ۪ऊ 验证阳性菌并进行自激活和毒性
验证ᖔ以排除基因本身对杂交结果的影响ଫ进行文
库筛选ᖔ将诱饵载体与文库混合后涂布于 ୩᧕ ᣰ ᥋ఋʢᡱ᥋
ᓂᔀࣼ᥋̀ᔽ༁շᏇ᥋੫ᑕ 培养基进行初筛ᖔ挑选蓝斑菌落摇
菌提取质粒ଫ利用 ఋᎮ ᣰ ሕᆥ ዶ᧕ 进行扩增和测序ᖔ根
据测序结果确定基因ଫ将比对后的阳性克隆ᖔ正对 图 ϟজ 大花红景天 ऊዶఋܦ୩ᨃ᧕ܦऊऊ୩ 基因 ۪ऊ 扩增电泳图
照 ᡱ᥈ାఋᎮ᥋ጢሕշᡱ᥈ዶ᧕ఋᎮ᥋ఋᖔ负对照 ᡱ᥈ାఋᎮ᥋ ቴዞࣷዛ௴ èᔽ੫ ϟজ ۪ऊ ᑕቝᡱᔽᔽዹᑕᡷᔽᆍႿ ᔀᔀዹᡷʢᆍᡱၤᆍʢᔀ༁ᔽ༁ ʢᔀ༁ࣼᡷ ᆍ ࣷዛ௴ᖔ
᧣ᦵᖔ ࣷࣷ ੫ᔀႿᔀ༁ ᆍ ቴ၊ᅳʐᔠᅳᤀᐹ ዞʗᓣႥࣩᤀᐹᡙᐹ
ྉቴዞ᧣ᦵϟɯ շᡱ᥈ዶ᧕ఋᎮ 分别滴于 ୩᧕ ᣰ ᥋ఋʢᡱ᥋ᓂᔀࣼܦ୩᧕ ᣰ ᥋
ఋʢᡱ᥋ᓂᔀࣼ᥋̀ᔽ༁ 和 ୩᧕ ᣰ ᥋ఋʢᡱ᥋ᓂᔀࣼշᏇ᥋੫ᑕ 培养基ᖔሕԡ ቩ 培
养 ሕʛ 后拍照ྉԻၤᑕႿ੫ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡϟऐɯᤥ ԣॹԣ 大花红景天 ቴዞࣷዛ௴ܓቴዞ᧣ᦵ 和 ቴዞࣷࣷ 基因
生物信息学分析
জ 结果与分析 对大花红景天 ቴዞࣷዛ௴ܦቴዞ᧣ᦵ 和 ቴዞࣷࣷ 基因
的氨基酸序列进行分析ᖔ通过在线 ାᑕ༁ᡷ۪ 比对ᖔ获
ԣॹϓ 大花红景天 ቴዞࣷዛ௴ 和 ቴዞ᧣ᦵ 基因的鉴定与 得 શऊା᧧ 数据库中的同源基因ᖔ利用 ᧕શዶᥘዶશ 计
克隆 算各自基因与其同源基因的序列相似度ᖔ并利用
因大 花红景天没有参考 基 因 组 信 息ᖔ 同时 多个在线网站基于其氨基酸序列进行分析ᤥ 结果
શऊା᧧ 网站 公 布 的有关红景天属基因序列多为 显示ᖔᤃ 个基因与其同源基因的序列一致性在 ᤃԡᠮ
᧕શዶ 条形码ᤥ 因此ᖔ为解决其基因序列的缺乏ᖔ本 以上ᖔቴዞࣷዛ௴ 基因最高ྉँጢጢϟᠮɯᖔቴዞࣷࣷ 基因最低
实验室对西藏大花红景天进行转录组测序ᤥ 通过 ྉᤃᤃሕᎮᠮɯᖔ 各自同源基因均为双子叶植物ᖔ 且尚
