Page 150 - 《广西植物》2024年第5期

９ ３ ８ 广 西 植 物 ４４ 卷
油菜 ｍｉＲＮＡ 的研究起步较晚ꎬＳｈｅｎ 等(２０１５) (ｈｔｔｐ:/ / ｂｒａｓｓｉｃａｄｂ.ｃｎ) 下载白菜、甘蓝的 ＡＰ２ 基因
利用油菜基因组ꎬ鉴定到 ６４５ 个 ＭＩＲ 基因ꎬ大部分 和蛋白序列ꎬ经过 ＮＣＢＩ 比对ꎬ选择 Ｅ￣ｖａｌｕｅ≤１０ 的
￣１０
ｍｉＲＮＡ 具有高度保守性ꎬ调控油菜生长发育的各 序列作为目标油菜序列ꎮ 为进一步明确候选油菜
个方面ꎬ包括参与杂种优势调控、种子发育、植物 ＡＰ２ 家 族 成 员ꎬ 从 ｍｉＲＢａｓｅ ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｍｉｒｂａｓｅ.

病原互作、非生物胁迫和花发育等方面( 陈丽等ꎬ ｏｒｇ / )下载油菜 ｍｉＲ１７２ 成熟序列( ｍｉＲ１７２) 和前体
２０１８)ꎮ Ｗａｎｇ 等 ( ２０１９ ) 分 析 早、 晚 花 油 菜 中 序列(ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２)ꎬ将 ｍｉＲ１７２ 成熟序列与已获得的
ｍｉＲ１７２ 或 ＡＰ２ 类转录因子的表达模式和功能特 油菜 ＡＰ２ 序 列 通 过 ＴＡＰＩＲ ( ｈｔｔｐ:/ / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.
性ꎬ发现它们对花器官发育具有调节作用ꎬ其中 ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｔａｐｉｒ/ )网站进行预测ꎬ保留具
ＢｎａＡＰ２￣１、ＢｎａＡＰ２￣５ 和 ＢｎａＴＯＥ１￣２ 可能起到抑制 有靶向关系的 ＡＰ２ 序列ꎻ同时ꎬ基于 ｍｉＲＮＡ 和靶基
花开的作用ꎮ Ｓｈｉｖａｒａｊ 和 Ｓｉｎｇｈ(２０１６) 分析白菜型 因间高度同源ꎬ利用 ＤＮＡＭＡＮ 比对 ｍｉＲ１７２ 与油菜
油菜和芥菜中 ＡＰ２ 的表达水平ꎬ揭示其参与芸薹 ＡＰ２ 基因ꎬ保留碱基错配数小于 ３ 的 ＡＰ２ 序列作为
属植物花的发育ꎻ对 ｍｉＲ１７２ 和靶基因 ＡＰ２ 突变体 本研究的候选基因ꎮ
间杂交能进行分析ꎬ发现二者存在复杂的互作模 １.３ ｍｉＲ１７２ 家族和 ＡＰ２ 基因启动子分析
式ꎮ 突变 ｍｉＲ１７２ 获得的转基因系均显示出加速 分别截取 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 和 ＡＰ２ 基因上游 ２ ０００
开花的现象(Ｓｈｉｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 目前ꎬ关于油 ｂｐ 作 为 启 动 子 区ꎬ 通 过 Ｎｅｗ ＰＬＡＣＥ ( ｈｔｔｐｓ: / /
菜中 ｍｉＲＮＡ 的研究大多集中在 ｍｉＲＮＡ 的挖掘与 ｗｗｗ.ｄｎａ.ａｆｆｒｃ.ｇｏ.ｊｐ / ＰＬＡＣＥ / ? ａｃｔｉｏｎ ＝ ｎｅｗｐｌａｃｅ) 网
预测ꎬ而涉及 ｍｉＲＮＡ 与靶基因的调控关系ꎬ以及 站进行顺式调控元件预测ꎬ初步预测 ｍｉＲ１７２ 对于
ｐｒｅ￣ｍｉＲＮＡ 对于 ｍｉＲＮＡ 调控的报道较少ꎮ 油菜开花的作用ꎮ
本文以油菜开花基因 ＡＰ２ 的调控为研究区 １.４ ＡＰ２ 系统发育分析
域ꎬ依托白菜和甘蓝中已发现的 ＡＰ２ 基因为切入 １.４.１ 油 菜 ＡＰ２ 蛋 白 性 质 分 析 利 用 在 线 软 件
点ꎬ进行比对并获得油菜的 ＡＰ２ 基因ꎬ采用生物信 Ｅｘｐａｓｙ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 预测分
息学方法、ｑＲＴ￣ＰＣＲ 方法、相关性分析及过表达载 析候选油菜 ＡＰ２ 蛋白分子量、等电点( ＰＩ)ꎬ通过
体侵染油菜子叶的方法ꎬ通过对 ＡＰ２ 进行蛋白理 Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ 网 站 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｓｂｉｏ. ｓｊｔｕ. ｅｄｕ. ｃｎ /
化性质、系统进化关系、选择压力、基序预测和顺 ｂｉｏｉｎｆ/ Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ / )进行亚细胞定位预测分析ꎮ
式调 控 元 件 分 析ꎻ 对 ｍｉＲ１７２、 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 和 ＡＰ２ １.４.２ 系统进化和选择压力分析 利用 ＭＥＧＡ１１ 软
表达规律及 ｍｉＲ１７２ 和 ＡＰ２ 之间及 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 与 件的邻接法进行 ＡＰ２、ｍｉＲ１７２ 和 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 核苷酸
ｍｉＲ１７２ 之 间 的 相 关 性 进 行 分 析ꎻ 对 过 表 达 ｐｒｅ￣ 序 列 的 进 化 树 分 析ꎬ 检 验 方 法 为 步 长 检 验
ｍｉＲ１７２ 质粒侵染油菜子叶后 ｍｉＲ１７２ 和 ＡＰ２ 表达 (ｂｏｏｔｓｔｒａｐ)ꎬ抽样次数 １ ０００(１ ０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ)ꎮ 利
水平进行分析ꎬ拟探讨以下问题:(１) 预测 ｍｉＲ１７２ 用 ＤｎａＳｐ Ｖ６ 软件分析 ＡＰ２ 基因的非同义突变率
和 ＡＰ２ 与花发育的关系ꎻ(２) ｍｉＲ１７２ 对 ＡＰ２ 的调 (ｎｏｎ￣ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓꎬｋａ) 和同义突变率 ( ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓꎬ
控功能ꎻ(３)ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 对 ｍｉＲ１７２ 的调控功能ꎮ ｋｓ)ꎬ计算非同义突变率和同义突变率比值 ( ｋａ /
ｋｓ)ꎬｋａ / ｋｓ <１ꎬ认为有纯化选择作用ꎬｋａ / ｋｓ >１ꎬ认
１ 材料与方法 为有正选择效应ꎬｋａ / ｋｓ ＝ １ꎬ认为存在中性选择ꎮ

１.４. ３ 油 菜 ＡＰ２ 基 因 基 序 分 析 通 过 ＷｅｂＬｏｇｏ
１.１ 试验材料 (ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂｌｏｇｏ. ｂｅｒｋｅｌｅｙ. ｅｄｕ / ｌｏｇｏ. ｃｇｉ) 绘 制 油 菜
早熟油菜品种为湘油 ４２０ꎬ晚熟油菜品种为湘 ＡＰ２ 蛋白序列结构域的序列标志图ꎮ 通过 ＭＥＭＥ
油 １５ꎬ均由湖南农业大学肖钢教授提供ꎮ 将油菜 (ｈｔｔｐ: / / ｍｅｍｅ ｓｕｉｔｅ.ｏｒｇ / ) 鉴定油菜 ＡＰ２ 蛋白内部
种子种于大田ꎬ待其长至 ５ ~ ７ 叶期ꎬ选择长势一致 的保守基序ꎮ

且完整的植株ꎬ取根和叶ꎬ液氮速冻保存于－８０ ℃ １.５ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检 测 ＡＰ２、 ｍｉＲ１７２ 及 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２
冰箱中备用ꎬ待油菜生长至花期ꎬ取完整的花ꎬ液 表达规律
氮速冻保存于－８０ ℃ 冰箱中备用ꎮ 采用 ｍｉＲｃｕｔｅ 多糖多酚植物 ｍｉＲＮＡ 提取分离
１.２ 油菜中 ＡＰ２ 基因的鉴定 试剂盒[ 天根生化科技( 北京) 有限公司] 提取油
从 ＴＡＩＲ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ.ｏｒｇ) 和 ＢＲＡＤ 菜根、 叶 和 花 的 ｍｉＲＮＡꎮ 使 用 ｍｉＲｃｕｔｅ 增 强 型