Page 151 - 《广西植物》2024年第5期

５ 期 刘芳等: Ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 及 ｍｉＲ１７２ 调控油菜 ＡＰ２ 基因表达的规律分析 ９ ３ ９

ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ 第一链合成试剂盒[ 天根生化科技 表 １ 荧光定量 ＰＣＲ 所需引物
(北京)有限公司]合成 ｃＤＮＡꎬ以此 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
选择 Ｕ６ 作 为 内 参 基 因ꎬ 采 用 ｍｉＲｃｕｔｅ 增 强 型 ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
ｍｉＲＮＡ 荧光定量检测试剂盒[ 天根生化科技( 北 引物名称 引物序列(５′￣３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′)
京)有限公司] 进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎮ ｍｉＲ１７２ 家族
Ａｃｔｉｎ￣Ｆ ＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＣＡＣＡＣ
成员 的 检 测 引 物 见 表 １ꎬ 具 体 反 应 体 系 按 照
Ａｃｔｉｎ￣Ｒ ＧＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧ
ｍｉＲｃｕｔｅ 增强型 ｍｉＲＮＡ 荧光定量检测试剂盒说明
Ｕ６￣Ｆ ＣＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧＡ
书进行ꎬ每个样本 ３ 次重复ꎬ在 ＣＦＸ９６ (ＢＩＯ￣ＲＡＤ)
Ｕ６￣Ｒ ＡＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＴＴＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴ
定量 ＰＣＲ 仪 上 进 行 扩 增ꎬ 运 行 程 序 为 ９５ ℃ １５
ＤＬＡＰ２(通)￣Ｆ ＣＴＣＡＣＣＡＣＡＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＧＴＴＧ
ｍｉｎꎻ９４ ℃ ２０ ｓꎬ６０ ℃ ３４ ｓꎬ４０ 个循环ꎻ溶解曲线分
ＤＬＡＰ２(通)￣Ｒ ＧＴＣＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＡＧＧＣＴＣＡＴ
析为 ６５ ℃ ５ ｓꎬ ９５ ℃ ０.５ ｓꎮ
ＤＬｍｉＲ１７２ｄ￣Ｆ ＧＣＡＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＧ
采用 ＲＮＡ 提取试剂盒( 北京全式金生物技术
ＤＬｍｉＲ１７２ｂ￣Ｆ ＧＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴ
股份有限公司) 提取油菜根、叶和花的总 ＲＮＡꎬ并
ＤＬｍｉＲ１７２ａ￣Ｆ ＧＣＡＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴ
合成 ｃＤＮＡ 第一链ꎮ 以 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ以 Ａｃｔｉｎ 为
ＤＬｍｉＲ１７２ｃ￣Ｆ ＧＣＡＧＡＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴ
内参基因ꎬ采用 ＴａＫａＲａ 公司[ 宝生物工程( 大连)
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ｃ￣Ｆ ＧＣＣＧＧＴＡＧ ＴＴＧＣＡＧＡＴＧＣ
有限 公 司] ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ 试 剂 盒 进 行
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ｃ￣Ｒ ＧＣＴＧＡＴＧ ＣＡＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 实验ꎬ检测 ＡＰ２ 基因和 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 表达
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ｄ￣Ｆ ＣＣＧＴＡＧＡＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＣ
情况ꎬ具体所用引物见表 １ꎮ 参照说明书按照 ２５
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ｄ￣Ｒ ＧＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣ
μＬ 体系进行配液ꎬ每个样本 ３ 次重复ꎬ在 ＣＦＸ９６
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ｂ￣Ｆ ＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣＣ
(ＢＩＯ￣ＲＡＤ)定量 ＰＣＲ 仪上进行扩增ꎬ程序为 ９５ ℃
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ｂ￣Ｒ ＧＡＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＴＡＣＣ
３０ ｓꎻ９５ ℃ ５ ｓꎬ５５ ℃ ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎻ溶解曲线分
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ａ￣Ｆ ＧＧＡＴＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡ
析为 ６５ ℃ ５ ｓꎬ９５ ℃ ０.５ ｓꎮ
ＤＬ￣ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ａ￣Ｒ ＧＣＣＧＴＣＧ ＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣ
１.６ 油菜 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 家族成员二级结构分析
通过 ＲＮＡｆｏｌｄ( ｈｔｔｐ: / / ｒｎａ.ｔｂｉ.ｕｎｉｖｉｅ.ａｃ.ａｔ/ / ｃｇｉ￣
ｂｉｎ / ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ / ＲＮＡｆｏｌｄ. ｃｇｉ) 在 线 网 站 分 析 油 于 ２５ ℃条件下避光培养过夜ꎬ然后转移至 ２５ ℃ꎬ光
菜 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 家族成员ꎬ在默认参数条件下ꎬ预测 周期 １６ ｈ / ８ ｈ 条件下培养 ３ ｄ 后取样ꎬ对 ｍｉＲ１７２ 和
其二级结构和自由能ꎮ ＡＰ２ 基因进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎬ具体方法同上ꎮ
１.７ Ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 过表达对成熟 ｍｉＲ１７２ 及 ＡＰ２ 基 １.８ 数据处理
因的影响 １.８.１ 相关性分析 通过 Ｅｘｃｅｌ 软件分别对油菜
１.７.１ 构建 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 过表达载体 为鉴定 ｐｒｅ￣ ＡＰ２ 和 ｍｉＲ１７２ 家 族 以 及 ｍｉＲ１７２ 家 族 和 ｐｒｅ￣
ｍｉＲ１７２ 对 ｍｉＲ１７２ 成熟体表达水平的影响ꎬ克隆 ｍｉＲ１７２ 家族进行相关性分析ꎬ在 Ｐ<０.０５ 的条件
ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 前体序列(包含发夹区域上下游各 １００ 下ꎬ相关系数 ｒ 绝对值越接近 １ꎬ相关性越强ꎮ ０≤
ｂｐ 区域序列)ꎬ并在序列 ５′端引入酶切位点 ＸｈｏＩꎬ ｜ ｒ ｜ ≤０.５ꎬ基本不相关或低度相关ꎻ０.５< ｜ ｒ ｜ ≤０.８ꎬ
３′端引入 ＥｃｏＲＩ 酶切位点ꎮ 经过 ＸｈｏＩ 和 ＥｃｏＲＩ 双 显著相 关ꎻ０. ８ < ｜ ｒ ｜ < １ꎬ 高 度 相 关ꎻ ｜ ｒ ｜ ＝ １ꎬ 完 全

酶 切 分 别 处 理 质 粒 ｐＧｒｅｅｎ ＿ ＧＵＳ ＿ ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ 相关ꎮ
(ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ ５５２０８) 和含 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 序列的 Ｔ 载 １.８.２ 差异显著性分析 利用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０

体ꎬ将 ｐｒｅ￣ｍｉＲ１７２ 连接到 ｐＧｒｅｅｎ＿ＧＵＳ＿ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ 对实验所得数据进行单因素方差分析ꎬ计算所得 Ｐ
上ꎬ构建过表达载体ꎮ 将已构建的过表达载体( 实 值小于 ０.０５ 为差异显著ꎮ

验组) 和空载体 ｐＧｒｅｅｎ＿ＧＵＳ＿ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ( 对照组)
分别转化至农杆菌 ＧＶ３１０１(成智博等ꎬ２０１９)ꎮ ２ 结果与分析
１.７.２ 农杆菌瞬时侵染油菜子叶及体内验证实验
将实验组和对照组的农杆菌分别进行瞬时侵染油 ２.１ 油菜中 ＡＰ２ 基因的鉴定
菜子叶ꎬ 具体方法参照谭小力等 (２０１２)ꎮ 侵染后 油菜基因组来源于白菜和甘蓝的杂交ꎬ选择