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蛇含委陵菜（Potentilla kleiniana）为蔷薇科委陵菜属宿根草本植物，又名五匹风、蛇含等，广泛分布于中亚、东亚及东南亚等地，在我国主要产于华东、华南及西南地区（中国科学院中国植物志编辑委员会，1985）。蛇含委陵菜性微寒、味苦，归肝、肺经，具有祛风剔邪、清热解毒等功效，其单方或组方常用于治疗咳嗽、乳腺炎、类风湿关节炎等，是贵州省苗族地区的特色中药材之一，具有较为丰富的药藏资源及巨大的开发潜力，现收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）（贵州省中药材、民族药材质量标准编审委员会，2003；罗迎春和孙庆文，2013）。目前，对蛇含委陵菜的化学成分研究报道较少，主要成分包括三萜、酚酸、黄酮及鞣质类成分，活性研究主要集中于粗提物的抗炎、抑菌、降糖作用（李胜华等，2011，2014；张晨光等，2018；Liu et al.，2019； Xuan et al.，2020）。本课题组前期研究发现蛇含委陵菜60%乙醇提取物的50%乙醇洗脱部位兼具一定的抗炎和体外抗肿瘤活性，确定该部位为蛇含委陵菜的抗炎、抗肿瘤活性部位，并从中分离鉴定了脂肪酸、苯丙酸、蒽醌等多种类型的化合物（张宝等，2023）。为进一步丰富蛇含委陵菜的植物化学信息，初步明确其抗肿瘤活性部位的物质基础，本研究在课题组前期研究的基础上，继续以蛇含委陵菜抗炎、抗肿瘤活性部位为研究对象，依托贵州省药物制剂重点实验室研究平台，综合运用多种色谱分离技术、光谱鉴定技术及药理学技术，拟探讨：（1）蛇含委陵菜抗肿瘤活性部位的化学成分；（2）分离得到的化合物的肿瘤细胞毒活性。
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1 材料与仪器
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1.1 材料
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蛇含委陵菜药材采自贵州省贵阳市花溪区高坡乡，经贵州医科大学刘春花副教授鉴定为蔷薇科植物蛇含委陵菜（Potentilla kleiniana）全草。标本保存于贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，凭证号为No.20210416。
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肿瘤细胞株：人宫颈癌细胞株Hela（中国科学院昆明细胞库）。
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1.2 仪器
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高分辨质谱仪（Thermo Fisher Q Exactive-Plus 四级杆-静电场轨道肼，美国Themo Fisher Scientific公司）；核磁共振波谱仪（Bruker AV-600型，德国Bruker公司；JEOL-ECS-400 MHz型，日本JEOL公司）；半制备型高效液相色谱仪（LC-20AP型，日本岛津公司）；旋转蒸发仪（BUCHIR-300型，瑞士BUCHI公司）；超纯水机（KZ-20L型，上海科制环保设备有限公司）；多功能酶标仪（VARIOSKANLUX，美国 Themo Fisher Scientific 公司）；二氧化碳培养箱（HF240，上海力申科学仪器有限公司）；脱色摇床（TY-80B，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；D-101大孔树脂（天津市海光化工有限公司）； Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia Biotech公司）；Toyopearl HW 40F（日本JEOL公司）；ODS反相材料（日本Tosoh公司）；MCI（CHP20/P120，日本三菱公司）；柱层析硅胶及硅胶GF254预制板（青岛海洋化工厂）。
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1.3 试剂
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阿霉素（批号：213S027，北京索莱宝生物科技有限公司）；MTT（批号：1117X0516，北京索莱宝生物科技有限公司）；高糖DMEM培养基（批号：C11995500BT，美国Gbico公司）；胰酶消化液（0.25% EDTA）（批号：2046777，美国Gbico公司）；水为蒸馏水，甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚等化学试剂均为分析纯。
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2 实验方法
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2.1 提取和分离
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取蛇含委陵菜干燥全草15 kg，粉碎后用60%乙醇回流提取3次（分别为2、1.5、1.5 h），合并提取液，减压浓缩至浸膏（2.1 kg）。浸膏加入适量蒸馏水，超声振荡分散，经D-101大孔树脂，依次用水、50%乙醇、95%乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，减压浓缩。其中，50%乙醇洗脱部位（428 g）经正相硅胶柱层析（200~300目硅胶，洗脱剂为氯仿-甲醇 50∶1→1∶1， V/V）得到9个组分（Fr.A-Fr.I）。
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Fr.B减压浓缩后析出难溶性沉淀物，过滤分离难溶性沉淀物后取滤液，经反复正相硅胶柱层析、结晶与重结晶，得化合物2（8.9 mg）。Fr.C经正相硅胶柱层析（300~400目硅胶，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯 20∶1→1∶1，V/V）得到Fr.C1-Fr.C4，其中Fr.C2经正相硅胶柱层析（300~400目硅胶，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯 30∶1→10∶1，V/V）得到Fr.C2.1-Fr.C2.5。Fr.C2.2经正相硅胶柱层析（300~400目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇 50∶1→10∶1，V/V）、Sephadex LH-20柱层析（二氯甲烷-甲醇 1∶1，V/V）、Toyopearl HW 40F柱层析（甲醇），得化合物3（7.0 mg）。Fr.C2.4经反复正相硅胶柱层析、Toyopearl HW 40F柱层析（甲醇）、ODS柱层析（甲醇-水 7∶3，V/V），得化合物1（7.6 mg）、13（7.0 mg）。Fr.C2.5经正相硅胶柱层析（300~400目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇 20∶1，V/V）、Sephadex LH-20柱层析（二氯甲烷-甲醇 1∶1，V/V），得化合物4（8.2 mg）。Fr.D经MCI柱层析（乙醇-水 3∶7→1∶0，V/V）得到 Fr.D1-Fr.D8，其中Fr.D2减压浓缩后析出难溶性沉淀物，过滤分离难溶性沉淀物后取滤液，经正相硅胶柱层析（300~400目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇 20∶1，V/V）得到Fr.D2.1-FR.D2.6。Fr.D2.2-Fr.D2.3经反复正相硅胶柱层析、Toyopearl HW 40F柱层析（甲醇）、ODS柱层析（甲醇-水 1∶4，V/V），得化合物5（10.3 mg）、12（11.1 mg）。Fr.D2.6经Toyopearl HW 40F柱层析（甲醇）得Fr.D2.6.1-Fr.D2.6.4，其中Fr.D2.6.2经反复正相硅胶柱层析、Toyopearl HW 40F柱层析（甲醇）、ODS柱层析及半制备液相分离纯化，得化合物6（5.6 mg）、7（4.8 mg）、8（8.5 mg）、9（12.1 mg）、11（8.3 mg）。Fr.D5依次经正相硅胶柱层析（300~400目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇 20∶1→2∶1，V/V）、Sephadex LH-20柱层析（甲醇）、Toyopearl HW 40F柱层析（甲醇），得化合物10（9.5 mg）。化合物 1-13 的化学结构见图1。
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2.2 细胞毒活性测试
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细胞毒活性测试参考Zhang等（2019）中MTT法并略作修改。取对数生长期Hela细胞，调整细胞浓度为每毫升6×104个，接种于96孔板中，每孔100 μL，实验设置空白对照组、阳性对照组（阿霉素）和待测药物组（各待测化合物），每组设置4个复孔，在5% CO2、37℃条件下培养24 h给药。空白组给予等体积的PBS，阳性对照组给予浓度1 μmol·L-1的阿霉素，待测药物组给予浓度50 μmol·L-1的各待测化合物。各组继续培养24 h，每孔加20 μL MTT试剂，孵育4 h；弃去培养液后每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，在酶标仪490 nm波长下检测各孔吸光度（OD），根据OD值计算抑制率。实验重复3次。
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选择抑制率较高的化合物，设置化合物浓度梯度为0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol·L-1，参照上述抑制率测定方法测得各浓度下的抑制率，采用Prism 8计算IC50值。实验重复3次。
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3 结果与分析
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3.1 结构鉴定
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化合物1 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 357.134 5 [M-H]-（C20H21O6，理论值：357.134 4），分子式为C20H22O6。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ: 6.88（2H，s，H-2，2′），6.74（2H，d，J=8.4 Hz，H-6，6′），6.71（2H，d，J=8.4 Hz，H-5，5′），4.59（2H，d，J=3.0 Hz，H-7，7′），4.11（2H，m，H-9a，9′a），3.75（6H，s，2×-OCH3），3.71（2H，d，J=9.6 Hz，H-9b，9′b），3.02（2H，s，H-8，8′）; 13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ: 147.5（C-4，4′），145.9（C-3，3′），132.2（C-1，1′），118.6（C-6，6′），115.1（C-5，5′），110.4（C-2，2′），85.1（C-7，7′），70.9（C-9，9′），55.6（2×-OCH3），53.6（C-8，8′）。以上数据与文献（Kwak et al.，2009）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-松脂素 [（+）-pionresinol]。
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化合物2 白色无定形粉末。HR-ESI-MS m/z: 373.129 3 [M-H]-（C20H21O7，理论值：373.129 3），分子式为C20H22O7。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 7.04（2H，t，J=2.4，2.0 Hz，H-2，2′），6.86（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′），6.84（1H，dd，J=7.6，2.0 Hz，H-6），6.77（2H，dd，J=2.0，7.6 Hz，H-5，5′），4.84（1H，overlap，H-7′），4.67（1H，s，H-7），4.45（1H，t，J=9.2 Hz，H-9′a），4.03（1H，d，J=9.2 Hz，H-9a），3.86（3H，s，3-OCH3），3.85（3H，s，3′-OCH3），3.85（1H，overlap，H-9b），3.75（1H，dd，J=9.2，6.4 Hz，H-9′b），3.03（1H，m，H-8′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ: 149.1（C-3），148.7（C-3′），147.5（C-4′），147.4（C-4），133.6（C-1′），129.1（C-1），121.5（C-6），120.5（C-6′），116.0（C-5），115.7（C-5′），112.8（C-2），111.3（C-2′），92.8（C-8），89.3（C-7），87.8（C-7′），76.1（C-9），72.0（C-9′），62.4（C-8′），56.4（3，3′-OCH3）。以上数据与文献（李江玲等，2014）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-8-羟基松脂素 [（+）-8-hydroxypinoresinol]。
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化合物3 淡黄色半透明固体。HR-ESI-MS m/z: 417.155 7 [M-H]-（C22H25O8，理论值：417.155 5），分子式为C22H26O8。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 6.65（4H，s，H-2，2′，6，6′），4.71（2H，d，J=4.0 Hz，H-7，7′），4.26（2H，dd，J=8.8，6.8 Hz，H-9a，9′a），3.87（2H，m，H-9b，9′b），3.85（12H，s，3，3′，5，5′-OCH3），3.14（2H，m，H-8，8′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:149.4（C-3，3′，5，5′），136.2（C-4，4′），133.1（C-1，1′），104.5（C-2，2′，6，6′），87.6（C-7，7′），72.8（C-9，9′），56.8（3，3′，5，5′-OCH3），55.5（C-8，8′）。以上数据与文献（于洋等，2010）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-丁香脂素 [（+）-syringaresinol]。
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化合物4 无色固体。HR-ESI-MS m/z: 387.145 1 [M-H]-（C21H23O7，理论值：387.144 9），分子式为C21H24O7。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 6.95（1H，s，H-2），6.81（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），6.76（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.65（2H，s，H-2′，6′），4.70（2H，d，J=3.6 Hz，H-7，7′），4.24（2H，m，H-9a，9′a），3.85（3H，s，3-OCH3），3.84（6H，s，3′，5′-OCH3），3.83（2H，m，H-9b，9′b），3.14（2H，s，H-8，8′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ: 149.3（C-3′，5′），149.1（C-5），147.2（C-4），136.2（C-4′），133.8（C-1），133.1（C-1′），120.1（C-2），116.1（C-3），110.9（C-6），104.5（C-2′，6′），87.7（C-7），87.5（C-7′），72.5（C-9），72.6（C-9′），56.8（3′，5′-OCH3），56.4（3-OCH3），55.6（C-8′），55.3（C-8）。以上数据与文献（An et al.，2016）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-杜仲树脂酚 [（+）-medioresinol]。
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化合物5 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 519.187 0 [M-H]-（C26H31O11，理论值：519.187 2），分子式为C26H32O11。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 7.14（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），7.02（1H，d，J=1.6 Hz，H-2），6.94（1H，d，J=1.6 Hz，H-2′），6.90（1H，dd，J=8.4，1.6 Hz，H-6），6.80（1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′），6.76（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），4.87（1H，d，J=8.0 Hz，H-5″），4.75（1H，d，J=3.6 Hz，H-7），4.70（1H，d，J=4.8 Hz，H-7′），4.23（2H，m，H-9β，9′β），3.86（3H，s，-OCH3），3.85（2H，overlap，H-9α，9′α），3.84（3H，s，-OCH3），3.12（2H，m，H-8，8′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ: 151.0（C-4），149.1（C-4′），147.5（C-3），147.3（C-3′），137.5（C-1），133.8（C-1′），120.1（C-6′），119.8（C-6），118.0（C-5），116.1（C-5′），111.6（C-2），111.0（C-2′），102.8（C-1″），87.5（C-7′），87.1（C-7），78.2（C-5″），77.8（C-3″），74.9（C-2″），72.7（C-9，9′），71.3（C-4″），62.5（C-6″），56.7（3-OCH3），56.4（3′-OCH3），55.5（C-8），55.4（C8′）。以上数据与文献（祖先鹏等，2014）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 [（+）-pionresinol-4-O-β-D-glucopyranoside]。
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化合物6 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 535.182 1 [M-H]-（C26H31O12，理论值：535.182 1），分子式为C26H32O12。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ: 7.05（1H，d，J=8.8 Hz，H-5′），7.01（1H，d，J=1.6 Hz，H-2′），6.94（1H，d，J=1.6 Hz，H-2），6.89（1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′），6.75（1H，dd，J=8.8，1.6 Hz，H-6），6.69（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），4.88（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″），4.79（1H，d，J=5.2 Hz，H-7），4.50（1H，s，H-7′），4.35（1H，t，J=8.8 Hz，H-9a），3.93（1H，d，J=9.2 Hz，H-9′a），3.71（1H，d，J=9.2 Hz，H-9′b），3.63（2H，overlap，H-9b，6″a），3.43（1H，m，H-6″b），3.25（3H，overlap，H-3″，4″，5″），2.88（1H，m，H-8），3.75（3H，s，-OCH3），3.74（3H，s，-OCH3）; 13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ: 148.9（C-3），146.9（C-3′），145.9（C-4），145.8（C-4′），135.2（C-1），128.0（C-1′），120.2（C-6′），118.4（C-6），115.1（C-5），114.6（C-5′），112.2（C-2′），110.8（C-2），100.0（C-1″），91.1（C-8′），87.2（C-7′），85.1（C-7），77.0（C-5″），76.9（C-3″），74.7（C-9′），73.2（C-2″），70.4（C-9），69.7（C-4″），60.9（C-8），60.7（C-6″），55.7，55.6（2×-OCH3）。以上数据与文献（Wu et al.，2014）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-8′-羟基松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 [（+）-8′-hydroxypinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside]。
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化合物7 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 581.187 1 [M+HCOO]-（C27H33O14，理论值：581.187 6），分子式为C26H32O12。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ: 7.01（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.99（1H，d，J=1.6 Hz，H-2′），6.95（1H，d，J=1.6 Hz，H-2），6.85（1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′），6.78（1H，dd，J=8.8，1.6 Hz，H-6），6.73（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），4.85（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″），4.73（1H，d，J=5.6 Hz，H-7），4.56（1H，s，H-7′），4.35（1H，t，J=8.8 Hz，H-9a），3.94（1H，d，J=9.2 Hz，H-9′a），3.71（1H，d，J=8.8 Hz，H-9′b），3.63（1H，overlap，H-9b），2.88（1H，m，H-8），3.75（3H，s，-OCH3），3.74（3H，s，-OCH3）; 13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ: 148.2（C-3′），147.5（C-3），146.1（C-4），145.9（C-4′），132.2（C-1），130.1（C-1′），119.8（C-6′），118.9（C-6），115.2（C-5），114.5（C-5′），112.3（C-2′），110.6（C-2），100.2（C-1″），91.2（C-8′），87.0（C-7′），85.4（C-7），77.0（C-5″），76.9（C-3″），74.6（C-9′），73.2（C-2″），70.4（C-9），69.6（C-4″），60.8（C-8），60.6（C-6″），55.6（2×-OCH3）。以上数据与文献（Wu et al.，2014）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-8′-羟基松脂素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 [（+）-8′-hydroxypinoresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside]。
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化合物8 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 559.177 9 [M+Na]+（C26H32O12Na，理论值：559.178 6），分子式为C26H32O12。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ: 7.02（1H，d，J=1.6 Hz，H-2′），6.95（1H，d，J=1.6 Hz，H-2），6.79（2H，d，J=7.6 Hz，H-6，6′），6.75（H，d，J=7.6 Hz，H-5），6.66（1H，d，J=7.6 Hz，H-5′），4.68（1H，d，J=6.0 Hz，H-7），4.61（1H，s，H-7′），4.30（3H，m，H-9a，9′a，1″），3.77（3H，s，3′-OCH3），3.73（3H，s，3-OCH3），3.26（3H，m，H-8，9b，9′b）; 13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ: 147.7（C-3），146.8（C-3′），146.2（C-4，4′），131.5（C-1），127.3（C-1′），121.5（C-6′），118.6（C-6），115.3（C-5），114.3（C-5′），113.8（C-2′），109.9（C-2），98.6（C-1″），97.3（C-8′），8 7.7（C-7′），85.1（C-7），77.2（C-3″，5″），73.3（C-2″），72.5（C-9′），69.9（C-4″），69.8（C-9），60.9（C-6″），58.8（C-8），55.6（3，3′-OCH3）。以上数据与文献（姚争争等，2018）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-松脂素-8′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 [（+）-pinoresinol-8′-O-β-D-glucopyranoside]。
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化合物9 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 535.181 6 [M-H]-（C26H31O12，理论值：535.182 1），分子式为C26H32O12。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 7.10（1H，d，J=1.6 Hz，H-2′），6.95（1H，d，J=1.6 Hz，H-2），6.85（1H，dd，J=8.0，1.6 Hz，H-6′），6.80（H，d，J=8.0，1.6 Hz，H-6），6.78（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.72（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），5.23（1H，d，J=6.4 Hz，H-7），4.64（1H，d，J=8.0 Hz，H-1″），4.37（1H，s，H-7′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ: 148.9（C-3′），148.5（C-3），147.6（C-4′），146.7（C-4），131.0（C-1），128.4（C-1′），122.4（C-6′），119.3（C-6），116.1（C-5），115.2（C-5′），113.9（C-2′），110.4（C-2），100.0（C-1″），97.3（C-8′），91.4（C-7′），83.1（C-7），78.2（C-3″），77.9（C-5″），75.2（C-2″），73.1（C-9′），71.4（C-4″），69.5（C-9），62.6（C-6″），56.5（3-OCH3），56.4（3′-OCH3），54.4（C-8）。以上数据与文献（Yang et al.，2019）报道的基本一致，故鉴定该化合物为schilignan F。
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化合物10 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 681.239 7 [M-H]-（C32H41O16，理论值：681.238 9），分子式为C31H42O16。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ: 7.15（2H，d，J=8.4 Hz，H-5，5′），7.03（2H，d，J=2.4 Hz，H-2，2′），6.92（2H，dd，J=8.4，2.4 Hz，H-6，6′），4.89（2H，overlap，H-1″，1’’’），4.76（2H，d，J=3.6 Hz，H-7，7′），4.25（2H，m，H-9β，9′β），3.88（6H，overlap，3，3′-OCH3），3.88（2H，overlap，H-9α，9′α），3.12（2H，m，H-8，8′）; 13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ: 151.0（C-3，3′），147.5（C-4，4′），137.5（C-1，1′），119.8（C-6，6′），118.0（C-5，5′），111.6（C-2，2′），102.8（C-1″，1’’’），87.1（C-7，7′），78.2（C-3″，3’’’），77.8（C-5″，5’’’），74.9（C-2″，2’’’），72.8（C-9，9′），71.3（C-4″，4’’’），62.5（C-6″，6’’’），56.8（3，3′-OCH3），55.5（C-8，8′）。以上数据与文献（杨鑫等，2007）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-松脂素-4，4′-O-双吡喃葡萄糖苷 [（+）-pionresinol-4，4′-O-bisglucopyranoside]。
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化合物11 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 521.201 6 [M-H]-（C26H33O11，理论值：521.201 7），分子式为C26H34O11。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 7.13（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.97（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.87（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′），6.78（H，d，J=1.6 Hz，H-2），6.70（1H，d，J=7.6 Hz，H-5），6.63（1H，dd，J=7.6，1.6 Hz，H-6），4.87（1H，overlap，H-1″），4.82（1H，d，J=6.4 Hz，H-7′），3.99（1H，dd，J=8.0，6.4 Hz，H-9a），3.85（3H，s，-OCH3），3.84（2H，overlap，H-9′a，6″a），3.82（3H，s，-OCH3），3.73（1H，dd，J=8.0，6.4 Hz，H-9b），3.69（1H，m，H-6″b），3.65（1H，m，H-9′b），3.47（2H，m，H-2″，5″），3.40（2H，m，H-3″，4″），2.90（1H，dd，J=13.2，5.2 Hz，H-7a），2.71（1H，m，H-8），2.49（1H，dd，J=13.2，10.8 Hz，H-7b），2.34（1H，m，H-8′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ: 150.8（C-3′），149.0（C-3），147.3（C-4′），145.9（C-4），139.5（C-1′），133.5（C-1），122.1（C-6），119.6（C-6′），117.9（C-5′），116.2（C-5），113.4（C-2），111.3（C-2′），102.9（C-1″），83.8（C-7′），78.2（C-3″），77.8（C-5″），74.9（C-2″），73.7（C-9），71.3（C-4″），62.5（C-6″），60.5（C-9′），56.7（3′-OCH3），56.4（3-OCH3），54.1（C-8′），43.8（C-8），33.6（C-7）。以上数据与文献（Park et al.，2010）报道的基本一致，故鉴定该化合物为（+）-落叶松脂素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 [（+）-lariciresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside]。
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化合物12 白色粉末。HR-ESI-MS m/z: 539.231 3 [M+H] +（C26H35O12，理论值：539.231 3），分子式为C26H34O12。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ: 7.14（1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-6），7.02（1H，d，J=2.4 Hz，H-2），6.96（1H，d，J=2.4 Hz，H-2′），6.91（H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.80（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.76（1H，dd，J=8.0，2.4 Hz，H-6′），4.87（1H，d，J=6.8 Hz，H-1″），4.75（1H，d，J=3.6 Hz，H-7），4.70（1H，d，J=3.2 Hz，H-7′），4.23（2H，m，H-9a，9′a），3.85（6H，overlap，2×-OCH3），3.39~3.87（6H，m，H-2″-6″），3.12（2H，m，H-8，8′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ: 150.9（C-3），149.1（C-3′），147.5（C-4），147.3（C-4′），137.4（C-1），133.7（C-1′），120.0（C-6′），119.8（C-6），117.9（C-5），116.0（C-5′），111.5（C-2），110.9（C-2′），102.8（C-1″），87.5（C-7′），87.1（C-7），78.2（C-3″），77.8（C-5″），74.9（C-2″），72.7（C-9，9′），71.3（C-4″），62.4（C-6″），56.7（3-OCH3），56.3（3′-OCH3），55.5（C-8），55.4（C-8′）。以上数据与文献（Wu et al.，2013）报道的基本一致，故鉴定该化合物为neoolivil-4-O-β-D-glucopyranoside。
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化合物13 透明胶状物。HR-ESI-MS m/z: 357.134 5 [M-H]-（C20H21O6，理论值：357.134 4），分子式为C20H22O6。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ: 6.88（2H，d，J=1.2 Hz，H-5，5′），6.87（2H，d，J=9.0 Hz，H-8，8′），6.80（2H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-7，7′），4.72（2H，d，J=4.8，H-4，4′），4.23（2H，dd，J=9.0，7.2 Hz，H-2a，2′a），3.89（6H，s，2×-OCH3），3.86（2H，dd，J=9.0，3.6 Hz，H-2b，2′b），3.08（2H，m，H-3，3′）; 13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ: 146.7（C-6，6′），145.2（C-9，9′），132.9（C-10，10′），119.0（C-7，7′），114.3（C-5，5′），108.6（C-8，8′），85.9（C-4，4′），71.7（C-2，2′），55.9（2×-OCH3），54.2（C-3，3′）。以上数据与文献（Saleem et al.，1997）报道的基本一致，故鉴定该化合物为3，3′-bis [3，4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran]。
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图1 化合物 1-13的化学结构式
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Fig.1 Chemical structures of compounds 1-13
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3.2 细胞毒活性测试结果
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由表1 可知，化合物1、3-5在50 μmol·L-1浓度下对Hela细胞的抑制率较高。因此，进一步测定1、3-5对Hela细胞的IC50，结果见表2。结果显示，化合物1、3、4的抑制活性较为显著，IC50值分别为（69.94±1.89）、（66.25±2.11）、（59.81±1.73）μmol·L-1。
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4 讨论与结论
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本研究综合运用多种分离分析方法及结构鉴定手段对蛇含委陵菜抗肿瘤活性部位的化学成分进行研究，得到13个木脂素类化合物，包括10个骈四氢呋喃型木脂素（1-10），2个四氢呋喃型木脂素（11、12）和1个二苄基丁烷型木脂素（13）。细胞毒活性试验发现，化合物（+）-松脂素（1）、（+）-丁香脂素（3）、（+）-杜仲树脂酚（4）、（+）-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）在50 μmol·L-1浓度下对Hela细胞具有较好的抑制作用，抑制率在58.72%~71.12%之间，其中化合物1、3、4的抑制活性最为显著，其IC50值分别为（69.94±1.89）、（66.25±2.11）、（59.81±1.73）μmol·L-1。从结构类型上看，对Hela细胞具有一定抑制活性的化合物（1、3-5）均为骈四氢呋喃型木脂素，该类成分由四氢呋喃型木脂素中脂肪烃链上羟基的缩合衍生而来，其结构骨架只有一种结构类型，即7-O-9′型和7′-O-9型四氢呋喃环通过C-8/C-8′位骈合（吴立军，2014）。以本研究分离得到的10个骈四氢呋喃型木脂素结合其细胞毒活性分析其构效关系发现：C-8或C-8′位上质子未被其他基团取代时，其对Hela细胞的增殖抑制活性较好；当C-8或C-8′位上质子被羟基、糖基等亲水性基团取代后，其对Hela细胞的增殖抑制活性降低；苯环上引入的亲水基团比例越大，其对Hela细胞的增殖抑制活性也会相应地降低；此外，C-7或C-7′构型的差异也会导致化合物对Hela细胞增殖抑制活性的改变，这为骈四氢呋喃型木脂素的结构修饰提供了思路和方向。未来可针对蛇含委陵菜抗肿瘤活性部位中的木脂素类化合物进一步扩大肿瘤细胞株的筛选范围，对活性突出的化合物进行相应的结构修饰、药效学、药代动力学、代谢组学及成药性方面的深入研究。
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本研究进一步丰富了蛇含委陵菜的植物化学信息及化合物结构类型，并通过细胞毒活性试验判断木脂素类成分可能是蛇含委陵菜发挥抗肿瘤药理活性的重要成分。此外，本研究初步分析了骈四氢呋喃型木脂素的构效关系，在一定程度上为该类成分的结构修饰和抗肿瘤药物的研究提供了参考，为蛇含委陵菜的进一步开发利用奠定了基础。
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摘要
为了研究蛇含委陵菜（Potentilla kleiniana）的化学成分及其肿瘤细胞毒活性，该研究综合运用D-101大孔树脂、硅胶、Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40F及半制备高效液相等现代色谱分离技术对蛇含委陵菜60%乙醇提取物进行分离纯化，根据化合物的理化性质结合核磁共振波谱（NMR）、高分辨质谱（HR-ESI-MS）鉴定化合物的结构，并采用MTT法测定各化合物对人宫颈癌细胞株Hela的细胞毒活性。结果表明：（1）从蛇含委陵菜中分离鉴定了13个木脂素类化合物，分别为(+)-松脂素（1）、(+)-8-羟基松脂素（2）、(+)-丁香脂素（3）、(+)-杜仲树脂酚（4）、(+)-松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、(+)-8′-羟基松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（6）、(+)-8′-羟基松脂素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（7）、(+)-松脂素-8′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（8）、schilignan F（9）、(+)-松脂素-4, 4′-O-双吡喃葡萄糖苷（10）、(+)-落叶松脂素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（11）、neoolivil-4-O-β-D-glucopyranoside（12）、3,3′-bis [3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran]（13）。其中，化合物1-4、7、8、10、12、13为首次从委陵菜属植物中分离得到，化合物5、6、9、11为首次从蛇含委陵菜中分离得到。（2）细胞毒试验结果显示，化合物1、3、4对Hela细胞具有较好的抑制活性，其半数抑制浓度IC50值分别为（69.94±1.89）、（66.25±2.11）、（59.81±1.73）μmol·L-1。该研究结果进一步丰富了蛇含委陵菜的化学成分，为抗宫颈癌药物的研发提供物质基础。
Abstract
Potentilla kleiniana belongs to the family Rosaceae, which distributes in Central Asia, East Asia and Southeast Asia. In China, this plant is mainly found in east, south and southwest provinces. P. kleiniana has been prescribed for the treatment of various diseases in the field of traditional Chinese medicine, such as cough, fever, tuberculosis, mastitis, rheumatoid arthritis. Our previous study found that P. kleiniana had a certain cytotoxicity on tumor cells. The purpose of this paper was to investigate the chemical constituents of P. kleiniana and their cytotoxicity on tumor cells. The 60% ethanol extract of P. kleiniana were isolated by D-101 macroporous adsorptive resins, silica gel, Sephadex LH-20, Toyopearl HW-40F, semi-preparative high performance liquid chromatography and other methods, and their chemical structures were elucidated on the basis of physicochemical properties, NMR and HR-ESI-MS analysis. Meanwhile, all these compounds were evaluated for cytotoxicity against human cervical cancer cell line Hela. The results were as follows: (1) Thirteen lignans were isolated and identified as (+)-pionresinol (1), (+)-8-hydroxypinoresinol (2), (+)-syringaresinol (3), (+)-medioresinol (4), (+)-pionresinol-4-O-β-D-glucopyranoside (5), (+)-8′-hydroxypinoresinol-4-O-β-D-glucopyranoside (6), (+)-8′-hydroxypinoresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside (7), (+)-pinoresinol-8′-O-β-D-glucopyranoside (8), schilignan F (9), (+)-pionresinol-4, 4′-O-bisglucopyranoside (10), (+)-lariciresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside (11), neoolivil-4-O-β-D-glucopyranoside (12), 3,3′-bis [3,4-dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-2H-1-benzopyran] (13). Among them, compounds 1-4, 7, 8, 10, 12, 13 were isolated from genus Potentilla for the first time, and compounds 5, 6, 9, 11 were isolated from P. kleiniana for the first time. (2) Cytotoxicity studies showed that compounds 1, 3 and 4 display certain inhibitory activities against Hela cells with IC50 values of (69.94 ± 1.89), (66.25 ± 2.11), (59.81 ± 1.73) μmol·L-1, respectively. Therefore, the study enriches the chemical constituents of P. kleiniana, and provides a material basis for the development of anti-cervical cancer drugs.
