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海草是生长在温带和热带浅海海域的单子叶植物，中国有22种，约占全球海草种类数（72种）的30%（郑凤英等，2013）。海草床是指由一种或两种以上的海草植物主导的海洋生态系统，与红树林、珊瑚礁并称三大典型海洋生态系统，处于红树林与珊瑚礁之间，其微生物分布广泛，多样性丰富（Hassenrück et al.，2015；蔡泽富等，2021）。组成海草根圈、底质和叶的菌落主要有γ-变形杆菌纲、α-变形杆菌纲、拟杆菌门、黄杆菌纲和蓝细菌门等（Devereux，2005）。江玉凤等（2016）发现海南新村湾海草沉积物中主要的细菌类群分布在变形菌门和厚壁菌门，其中优势菌群为γ-变形菌门。凌娟等（2010）从泰来藻（Thalassia hemperichii）植株的根际分离得到1株固氮成团泛菌（Pantoea agglomerans）。王琦等（2017）从鳗草（Zoslera marina）植株的根际分离获得2株新的具有较高固氮酶活性的芽孢杆菌（Bacillus sp.）和海旋菌（Thalassospira sp.）。广西北部湾海洋微生物物种资源丰富，近年来对红树林和珊瑚礁微生物资源的研究较多，忽视了海草床微生物资源的丰富性（徐新亚等，2020）。广西是中国热带-亚热带海域海草床主要分布区之一，据周毅等（2023）调查发现，广西现有海草5种，海草床面积合计665.46 hm2，其中防城港海域海草面积为297.89 hm2，占广西海草床总面积的44.76%。防城港海草床主要分布在珍珠湾（郑凤英等，2013），珍珠湾海草床位于广西北仑河口国家级自然保护区，地处中越边界，地理位置特殊，属南亚热带湿热季风气候区，其基质多为淤泥。珍珠湾海草床地处亚热带，受季节与潮汐影响海草物种单一，以矮大叶藻（Zostera japonica）为优势种，夏季混生喜盐草（Halophila ovalis），并且多处于潮间带，低潮时受失水胁迫，能适应高碱性高盐度环境（郑杏雯，2007；范航清和郑杏雯，2007；邱广龙等，2014）。海草床毗邻红树林和珊瑚礁，受自然和人为双重胁迫，海草根茎发达，交错成密集的网络状，能截留大量的海底沉积物，成为独特微生物的温床（李森等，2010；周毅等，2023；胡晓珂等，2023）。总之，海草床生境特殊，蕴含着大量与陆地环境不同的微生物。
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北部湾红树植物根际土壤可培养细菌资源丰富。例如：吴家法等（2017）从茅尾海25份红树林土壤样品中分离获得117株放线菌，分布于6个亚目10个科19个属，优势菌属为链霉菌属（Streptomyces）；候师师等（2020）从海南西海岸四种真红树根系土壤共分离获得22株放线菌，隶属于4目7科9属，其中链霉菌属为优势菌群；李王靖等（2023）从7份红树植物根际土壤样品中培养获得细菌120种，隶属于35科47属，优势菌属为链霉菌属。
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据文献报道，海草床生境可培养细菌资源具有丰富的生物活性，如抗病毒（Rowley et al.，2002）、抗癌（Gavagnin et al.，2007）、抗菌（Qi et al.，2008）等。Rowley 等（2002）从 Thalassia testudinum 中分离出的黄酮苷化合物有抗 HIV 病毒活性。Gavagnin 等（2007）从 Halophila stipulacea 分离出1个对人体和大鼠癌细胞具有强抑制活性的大环内酯类化合物。Qi等（2008）从海南采集的海菖蒲（Enhalus acoroides）中分离得到木犀草素、芹黄素、木犀草素-4′-葡萄糖显示拒食活性、细胞毒性、抑菌活性等活性。据统计，自2020年起从北部湾3种海草植物中获得3个新化合物和7个已知活性化合物（高程海等，2022）。目前，抗生素耐药性依然严重威胁着人类的生命，每年约有70万人死于感染，预计到2025年这将导致数以百万计的人失去生命（Subramaniam &Girish，2020）。因此，亟待寻找新的抗生素来源。
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本研究以防城港珍珠湾和渔洲坪两处海草床为研究对象，采用稀释涂布法分离盐生植物根际可培养细菌，通过16S rRNA基因测序鉴定菌种以及滤纸片法筛选细菌代谢产物粗提物的抑菌活性，拟探讨以下问题：（1）与红树植物根际土壤可培养细菌相比，海草床盐生植物根际土壤可培养细菌的新颖性和独特性；（2）海草床可培养细菌代谢产物粗提物的抑菌活性。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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1.1.1 样品采集
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2021年6月从广西防城港珍珠湾和渔洲坪海草床生态系统采集海草贝克喜盐草等植物的根际土壤样品9份（表1）。拔起植物根系，抖落根系周围松散的土壤后，收集剩下的附着在根系上的土壤，挑除断根等杂质后，用无菌采样袋盛装，放入冰盒保存并尽快送回实验室进行分离实验。
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1.1.2 试剂
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Chelex-100树脂和2X Easy Taq Supermix购于Bio-Rad公司（美国）。16S rRNA基因扩增引物对27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）购于生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司。其他试剂均为国产分析纯。
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1.1.3 培养基
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1.1.3.1 分离培养基
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共采用5种分离培养基对海草床盐生植物根际土壤细菌进行培养，分别为改良ISP5培养基（M7）、棉籽糖-组氨酸培养基（M11）、燕麦培养基（P3）、酪氨酸-天冬酰胺培养基（P7）和AM6-1。其中，M7、M11、P3、P7详细配方参考李蜜等（2020），AM6-1详细配方参考马睿霄（2016）。每种培养基加入1 L海水和15 g琼脂，pH调节至7.2，添加重铬酸钾25 mg·L-1抑制真菌生长。
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1.1.3.2 纯化及菌种保存培养基
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改良ISP2固体培养基（38号），配方为酵母提取物2.0 g、麦芽提取物2.0 g、葡萄糖2.0 g、琼脂粉15.0 g、海盐30.0 g和去离子水1 000 mL。
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1.1.4 指示菌
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）由广西中医药大学海洋药物研究所提供，表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）由广东微生物研究所提供，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由华南农业大学提供。
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1.2 方法
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1.2.1 样品处理方法
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挑除海草床盐生植物根际土壤样品中的杂质，称取样品2 g置于装有20 mL无菌水的锥形瓶中，置于摇床充分摇匀后，稀释成1×10-2、1×10-3悬液，各取100 μL分别涂布于5种分离培养基上，倒置在培养箱内恒温28℃培养14~30 d。
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1.2.2 细菌的分离纯化
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分离培养3~5 d后观察菌落的生长状况，当平板长出明显的菌落形态，在超净工作台下挑取各单菌落，采用三区划线法，使用无菌竹签接种到改良ISP2 固体培养基平板上，置于28℃ 恒温箱进行纯化培养，观察并记录菌落的形态特点，直至获得纯单菌落。
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1.2.3 细菌的保藏
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配置20%（V/V）甘油管，灭菌后转接纯化的菌株，置于-80℃冰箱冷冻保藏以备用。
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1.2.4 细菌的鉴定
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参考周双清等（2010）的方法，用Chelex-100法提取细菌基因组DNA，用27F和1492R引物对PCR扩增16S rRNA基因片段，PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司广州分公司测序，用DNA Star软件编辑整理16S rRNA基因测序结果，在数据库 EzBioCloud（http://www.eztaxon.org/）及Blast网站上在线比对相似性。
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1.2.5 抑菌活性实验
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1.2.5.1 细菌发酵粗提物的制备
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参考李蜜等（2020）的方法，发酵已分离纯化的菌株，离心收集发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取。将萃取物减压浓缩后，溶解于甲醇并收集置于通风橱，待甲醇挥干后，将得到的细菌发酵粗提物存放于4℃的冰箱中备用。
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1.2.5.2 抑菌活性筛选
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用三角瓶配置LB液体培养基50 mL并灭菌，待冷却至约50℃，接种生长良好的指示菌，置37℃摇床180 r·min-1培养6 h即得种子液。用培养皿制备成种子液浓度为0.2%的LB固体培养基检定板。将细菌发酵粗提物用甲醇溶解配成20 mg·mL-1，吸取5 μL至直径为6 mm的无菌滤纸片上（加入5 μL甲醇和3 μL浓度为50 μg·mL-1的甲氧苄啶滤纸片分别作阴性和阳性对照），挥干甲醇，贴于检定板表面，于37℃培养24 h，观察并记录抑菌圈的大小，实验重复3次，计算抑菌圈平均值（曾臻和谭强来，2019）。
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2 结果与分析
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2.1 多样性分析
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16S rRNA基因序列比对结果排重后，最终获得细菌42株（表2）。由图1可知，42株菌隶属3门4纲12目13科14属42种。其中，链霉菌属最多，有13种，占总分离菌种的30.95%，为优势菌群，与红树根际土壤的研究结果类似（李王靖等，2023），海草床盐生植物根际土壤也含有丰富多样的放线菌。其次是弧菌属（Vibrio）和芽孢杆菌属（Bacillus），分别为9种和6种，占21.43%和14.29%。从16S rRNA基因序列比对相似度来看，42株细菌中4株16S rRNA相似度小于98.65%，分别为Streptomyces abikoensis、S. griseocarneus、S. carpinensis、Vibrio hispanicus。由此可见，海草床根际土壤放线菌资源不仅丰富，而且潜藏着疑似新菌，值得进一步发掘和研究。
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2.2 细菌在不同盐生植物根际土壤、不同培养基中的分布
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不同样品盐生植物根际土壤细菌多样性如图2所示。F4贝克喜盐草分离出11属11种可培养细菌，多样性最丰富，优势均属为弧菌属。其次为F2贝克喜盐草，分离获得6属9种可培养细菌。F1广州相思子（沙质），分离筛选出5属9种可培养细菌。广州相思子F7和F3不相上下，分别为6属7种和5属7种。F6卵叶喜盐草和F8贝克喜盐草，均获得4种，分别隶属于4属和2属。F5卵叶喜盐草和F9苔藓分离获得的可培养细菌最少，均为2属2种。由此可见，不同样品可培养细菌多样性存在差异，其中最多的2个样品（F2、F4）都是贝克喜盐草，F4比F2多分离出2种可培养细菌，参考邱广龙等（2020）对贝克喜盐草生态学特征的研究，推测可能与贝克喜盐草特殊的生境有关。贝克喜盐草仅生长在潮间带，受周期性潮汐运动影响，需忍耐相对其他海草更大的环境波动（邱广龙等，2020）。此外，不同海域可培养细菌的多样性也存在差异。来源于珍珠湾的样本分离到的细菌要多于渔洲坪。徐慧鹏（2020）研究表明，珍珠湾的表层沉积物有黏土，而渔洲坪则没有。因此，造成两地差异的原因可能与两地的表层沉积物质地不同有关。
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图1 海草床42株可培养细菌多样性分布
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Fig.1 Diversity distributions of 42 culturable bacteria from the seagrass bed
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细菌生长受培养基营养成分影响，故不同培养基分离得到的细菌会存在差异。由图3可知，5种培养基中，M11分离得到菌株总数最多，为15株7属，其中链霉菌属最多，共6株。其次是M7和P7，分离获得的菌株数量相当，分别为12株8属和12株5属，两者都含有L-天冬酰胺和甘油且含量相当，这两种成分是微生物生长所必需的生长因子。这与李蜜（2020）的研究结果一致。AM6-1分离获得可培养细菌8种6属，相比M7和P7，它只含有甘油。纯化得到可培养细菌数量最少的是培养基P3，仅5种3属。P3只含有燕麦粉一个营养成分，不含甘油或氨基酸，本次实验样本可培养细菌需要较多的氨基酸类生长因子，对于碳源的需求不高。
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图2 不同盐生植物根际土壤可培养细菌多样性差异
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Fig.2 Diversity differences of culturable bacteria from rhizosphere soil in different halophytes rhizosphere
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图3 不同培养基可培养细菌多样性差异
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Fig.3 Diversity differences of culturable bacteria from different culture media
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2.3 抑菌活性分析
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本次研究采用滤纸片法，筛选具有抑菌活性的细菌发酵粗提物，由表3和图4可知，有6株菌的发酵粗提物具有抑菌活性。除1株弧菌外，其余5株均是放线菌，包含4株链霉菌，由此可知，放线菌尤其是链霉菌属产生抗生素的潜力巨大。菌株GXIMD209对MRSA、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌均有不同程度的抑制作用。GXIMD119对鲍曼不动杆菌无作用，对其他三种指示菌均有抑制作用。GXIMD200对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和鲍曼不动杆菌具有抑菌活性，而对金黄色葡萄球菌无抑菌活性。GXIMD160仅对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌有抑制作用，相反地，GXIMD156对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌有抑制作用。GXIMD130对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌无抑制作用，对其他三种指示菌显阳性。
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3 讨论与结论
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本次研究，从广西北部湾防城港珍珠湾与渔洲坪两地采集9份海草床盐生植物根际土壤样本，分离纯化得到42株可培养细菌，隶属12目13科14属，链霉菌属是优势菌属。在优势菌属上，本研究与吴家法等（2017）、候师师等（2020）及李王靖等（2023）研究结果一致，优势属均为链霉菌属。不同的是，本次研究的对象为防城港海草床的盐生植物。然而，防城港海域的红树植物根际土壤亦存在丰富的放线菌资源，如吴越等（2017）从防城港北仑河口红树林植物根际土壤中分离获得放线菌110株。据此推测，防城港海草床根际土壤中亦可能富含放线菌，可对此作进一步研究。
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海草床盐生植物可培养细菌的多样性和新颖性受植物、培养基、分离技术等因素影响。不同盐生植物分离得到的菌种存在差异，本研究采集于珍珠湾的两处贝克喜盐草根际土壤分离到的细菌数量最多。这应该和贝克喜盐草的特殊生境和环境胁迫等因素有关。贝克喜盐草为最古老的海草之一，被称为“活恐龙”。珍珠湾贝克喜盐草位于红树林和矮大叶藻之间，生长于潮间带，相对于其他海草，每天需承受周期性潮汐运动所产生的光照、温度、盐度等环境波动（邱广龙等，2013，2020），此外海草床微生物群落活动也受光照的影响（邓娱婷，2023）。贝克喜盐草面临多种生存威胁，重金属的胁迫影响贝克喜盐草根际沉积物酶活性，从而对土壤的微生物产生影响（权佳惠，2022）。海草床微生物群落分布受根龄、叶龄、季节变化、海草定植、海草生理状况和组织部位等多种因素影响（胡晓珂等，2023）。这启发了研究者可采集海草床多类型样本对其微生物多样性作进一步研究。就不同培养基进行分析，从M11培养基中分离获得的菌株数量最多，P3培养基获得细菌数量最少。P3主要成分为燕麦粉，为寡营养琼脂培养基，海草床土壤中含有较高水平的有机碳能为海草根际微生物提供充足的碳源（胡晓珂等，2023）。吴越等（2017）采用的培养基为5种，而成分比本研究采用的培养基复杂。传统的分离技术和方法越来越难获得新颖性高的可培养细菌。据李王靖等（2023）统计，2015—2021年运用传统分离方法从北部湾海洋植物根际土壤分离得到的潜在新菌（＜98.65%）比例为2.34%。本次研究采用传统的分离方法，获得4株16S rRNA基因序列比对相似度小于98.65%的细菌，但均高于97.00%，新颖性较低。李王靖等（2023）采用富集培养法以复苏休眠的菌株，分离获得5 种相似度均低于97.00%的潜在新菌。后续可采用其他方法分离海草床的可培养细菌以获得新颖性高的菌株，如高通测序分析、原位培养等。熊小飞等（2018）采用高通测序分析法发现广西北仑河口潮间带红树林沉积物中微生物的5大主要类群分别为变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、浮霉菌门和酸杆菌门。因此，我们需要利用新技术、配制多种培养基，从而充分发掘海草床的细菌多样性，获得更多新型可培养的海洋细菌。
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注： +. 有抑菌圈; -. 无抑菌圈; SA. 金黄色葡萄球菌; MRSA. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; SE. 表皮葡萄球菌; AB. 鲍曼不动杆菌。
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Note： +. Inhibition zone; -. No inhibition zone; SA. Staphylococcus aureus; MRSA. Methicillin-resistant S. aureus; SE. S. epidermidis; AB. Acinetobacter baumannii.
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放线菌有较强的抑菌活性，链霉菌属是产生抗生素最多的放线菌（吕佩帅等，2021）。本研究发现具有较强抑制人体致病菌的可培养细菌6株，分别为GXIMD209、GXIMD119、GXIMD200、GXIMD160、GXIMD156和GXIMD130。其中，GXIMD160与GXIMD156分离自广州相思子的根际土壤，均隶属于链霉菌属，GXIMD209和GXIMD119分离自贝克喜盐草的根际土壤，分别隶属于弧菌属和罗思氏菌属（Rothia），GXIMD200分离自卵叶喜盐草，隶属于链霉菌属，GXIMD130分离自苔藓，亦隶属于链霉菌属。6株活性菌中，除GXIMD209外，其余5株均属放线菌且4株为链霉菌。吴越等（2017）从分离自防城港北仑河口红树林根际土壤的51株放线菌中筛选出46株有抗菌活性。
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本研究首次将海草床植物根际土壤作为研究对象，拓宽了北部湾微生物资源研究的范围，是寻找具有抗菌活性菌株的一次有益尝试。彭霞薇等（2013）证明阿比科恩链霉菌（Streptomyces abikoensis）对茄腐皮镰刀菌（Fusarium solani）引起的根腐病具有较强的抑制作用。而本研究活性菌株GXIMD160与菌株阿比科恩链霉菌相似性为100%，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌有较强抑制作用，预示其可能有抑制人体致病菌的潜力，具有进一步开发为人用抗生素的价值。
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综上所述，防城港海域海草床盐生植物根际土壤可培养细菌资源较为新颖独特，链霉菌属细菌具有较强的抑菌活性，是开发新型抗生素的潜在菌种资源。但是，除防城港海域海草床盐生植物根际土壤样本外，本实验未采集防城港海草床更多样本或其他海域的海草床样本，后续将考虑采集更多海草床样本。另外，本研究分离得到的菌株数量与有效活性菌株种类有关，需改进细菌培养的技术，扩大致病菌筛选范围及改进抑菌实验方法，以获取更多强活性的新型海洋微生物，为进一步研究微生物多样性和抑菌活性提供新思路和新的菌株资源。
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图4 4种人体致病菌抑菌活性实验结果图
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Fig.4 Results for antibacterial activities of four human pathogenic bacteria
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摘要
为探究海草床盐生植物根际土壤可培养细菌的新颖性和独特性及其代谢产物粗提物抑菌活性，该文采集防城港市珍珠湾和渔洲坪海草床9份盐生植物根际土壤进行研究，使用5种分离培养基，并采用稀释涂布法分离纯化可培养细菌。通过PCR扩增和16S rRNA测序进行菌种鉴定并对其进行多样性分析。采用滤纸片法筛选可培养细菌发酵粗提物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）4种人类致病菌的抑制活性。结果表明：（1）从9份样品中共分离获得可培养细菌42株，隶属13个科14个属，包括链霉菌属、弧菌属、芽孢杆菌属、希瓦氏菌属、微杆菌属、短杆菌属、葡萄球菌属、鞘氨醇单胞菌属、罗思氏菌属、嗜冷杆菌属、假诺卡氏菌属、发光菌属、氟单胞菌属和志贺菌属，其中链霉菌属为优势菌属。（2）抑菌活性初筛结果显示，6株可培养细菌至少对2种以上人类致病菌有较强的抑制活性，其中1株来自弧菌属，1株来自罗思氏菌属，其余4株均来自链霉菌属。综上所述，防城港海域海草床盐生植物根际土壤微生物资源较新颖独特，链霉菌属细菌具有较强的抑菌活性，为开发新型抗生素提供了潜在菌种资源。
Abstract
The purpose of this study was to investigate the novelty and particularly of the culturable bacteria in seagrass bed and study its antibacterial activity crude extracts of the metabolites. A total of nine rhizosphere soil samples were collected from the seagrass bed ecosystems in Pearl Bay and Yuzhouping, Fangchenggang City. Five different isolation media were used to isolate and purify the culturable bacteria using the dilution spread plate method. The bacterial species were identified through PCR amplification and 16S rRNA sequencing. The antibacterial activity against four human pathogenic bacteria (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. aureus and Acinetobacter baumannii) were screened with Kirby-Bauer method. The results were as follows: (1) A total of 42 culturable bacteria were isolated, belonging to 14 genera and 13 families, which included Streptomyces, Vibrio, Bacillus, Shewanella, Microbacterium, Brevibacterium, Staphylococcus, Sphingomonas, Rothia, Psychrobacter, Pseudonocardia, Photobacterium, Halomonas, and Shigella. The genus Streptomyces was the dominant bacterium. (2)Antibacterial activity showed that six bacteria exhibited strong inhibitory activity against at least two or more human pathogenic bacteria, which included Vibrio (1 strain), Rothia (1 strain), and Streptomyces (4 strains). The studies show that the rhizosphere soil microbial resources of halophytes in the seagrass bed in Fangchenggang sea area are novel and unique, and Streptomyces has a strong antibacterial activity, which provides a new source for the research and development of new antibiotics drugs.
