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植物在生长发育过程中会进化出一系列防御策略以适应逆境胁迫，转录调控是植物生长发育和环境适应的基础，转录因子是调控下游靶基因时空表达的重要蛋白（Wu et al.，2022）。在应激网络信号通路中，转录因子通过结合顺式作用元件来抑制或激活某些基因的表达，参与调控植物生长发育和胁迫响应（Strader et al.，2022）。bHLH转录因子家族是植物中最重要、规模最大的转录因子家族之一，广泛存在于几乎所有的真核生物，在转录水平上调控多种生物学过程（Zhang et al.，2020），bHLH因具有高度保守的碱性基本区域（basic region）和α螺旋1-环-α螺旋2（α helix1-loop-α helix 2，HLH）两个亚功能区而得名（Zhang CH et al.，2018; Zhang TT et al.，2018; Pires &Dolan，2010），其结构域长为50~60个氨基酸。碱性基本区位于结构域N端，长为10~20个氨基酸，作为DNA结合区可识别靶基因启动子序列中的E-Box（5′-CANNTG-3′）并与之特异性结合（Feller et al.，2011）；HLH区位于结构域C端，长为40~50个氨基酸，由两个含保守疏水残基的α-螺旋组成且由一个可变长度的环隔开，α-螺旋之间的相互作用可形成同源或异源二聚体，与靶基因启动子不同区域结合以调控基因转录（Lang &Liu，2020）。植物bHLH家族一般被划分为15~25个亚家族，某些特殊物种可达32个（Bano et al.，2021）。随着测序技术的发展，bHLH转录因子家族在众多模式植物和农业作物中被鉴定和分析，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）（Hao et al.，2021）、花生（Arachis hypogaea）（Li et al.，2021）、黄瓜（Cucumis sativus）（Li et al.，2020）和茶树（Camellia sinensis）（Liu et al.，2021）等。现有研究表明bHLH转录因子参与调控光形态发生（Akmakjian et al.，2021）、花果发育和花青素积累（Zhao et al.，2019）以及逆境胁迫响应（Sun et al.，2019）等生物学过程。
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马缨杜鹃是杜鹃花科杜鹃花属常绿杜鹃亚属的多年生高山木本花卉，树姿苍劲优美、花大色艳且花期长，具有较高的观赏价值、药用价值和园林应用前景（Sun et al.，2021），但马缨杜鹃对生境要求较为苛刻，人工引种需在温室条件下才能生长良好，水分亏缺是制约其园林应用的关键限制因子（Cai et al.，2019; Wang et al.，2020）。已有研究表明，bHLH转录因子在胁迫相关调控网络和信号通路中发挥重要作用（Li et al.，2019），但目前对杜鹃花科植物bHLH转录因子家族的系统分析鲜有报道。
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本研究以马缨杜鹃基因组文件和转录表达数据为基础，运用生物信息学方法，对RdbHLH家族成员进行了系统鉴定和分析，拟探讨以下问题：（1）RdbHLH家族成员及蛋白理化性质等基本信息；（2）系统发育分类、基因结构、保守基序及顺式作用元件等特征；（3）蛋白互作网络、转录表达模式及三维结构等特征和功能预测。以期为进一步研究RdbHLH转录因子在抗干旱胁迫过程中的生物学功能提供理论依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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从杜鹃花植物基因组数据库（http://bioinfor.kib.ac.cn/RPGD/index.html）获取马缨杜鹃基因组序列、CDS序列、蛋白序列、GFF注释文件及不同干旱处理下的转录表达数据；模式植物拟南芥AtbHLH数据来自TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/）。
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1.2 RdbHLH家族成员的鉴定、蛋白理化性质及定位预测分析
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从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）下载bHLH基因的隐马尔科夫模型文件（PF00010），运用HMMER软件进行第一次结构域搜索，取前1/3基因的保守结构域序列构建马缨杜鹃特异性隐马尔科夫模型，进行第二次结构域搜索，以0.001的E value筛选得到候选基因，为验证候选基因是否都具有bHLH结构域，将对应的蛋白序列提交至Pfam和SMART（https://mart. embl.de/）数据库进行确认（Zhang et al.，2022）。运用ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）分析RdbHLH的蛋白理化性质，包括氨基酸数目、蛋白分子量、等电点、不稳定指数、脂肪指数和亲水性；运用PSORT工具（https://www.genscript.com/wolfpsort.html）进行RdbHLH蛋白亚细胞定位预测。
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1.3 RdbHLH蛋白多序列比对、系统发育和分类分析
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选取所有RdbHLH和部分AtbHLH的氨基酸全长序列，运用MEGA 11软件中的ClustalW程序进行多序列比对，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，Bootstrap重复检验1 000次以评估树中节点统计的可靠性。利用ChiPlot工具（https://www.chiplot.online/）绘制系统发育树，并参照AtbHLH家族基因的分类系统（Heim et al.，2003）对RdbHLH家族成员进行亚组和亚家族分类。
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1.4 RdbHLH家族基因结构、保守结构域和Motif分析
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运用MEME工具（http://meme-suite.org/）分析RdbHLH蛋白的Motif，Motif搜索数量为15，长度范围为6~100；基于GFF注释文件提取RdbHLH基因的外显子和内含子位置信息；将蛋白序列上传至NCBI搜索保守结构域，下载hitdate结果文件，利用TBtools软件的Gene structure view程序结合系统发育树对上述结果进行可视化；基于第二次结构域搜索结果提取RdbHLH对应的保守结构域序列，运用ClustalW程序进行多序列比对，最后用WebLogo工具（https://weblogo.berkeley.edu/ logo.cgi）和geneDoc软件分析保守结构域。
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1.5 RdbHLH基因启动子顺式作用元件分析
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截取RdbHLH基因起始密码子上游2 000 bp的启动子DNA序列，提交至Plant CARE在线工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）检索顺式作用元件，并对元件种类、数量及功能进行统计分析。
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1.6 RdbHLH家族基因在不同干旱胁迫处理下的表达分析
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通过对转录表达数据的分析，计算基因表达水平并归一化为FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）值，得到4组不同处理下实验植株RdbHLH基因的相对表达量，实验处理方式为正常灌溉（CK）、停灌5 d（D5）、停灌9 d（D9）和停灌10 d后立即浇水灌溉6 h（REC）。基于limma R程序进行差异表达分析，与对照相比，表达差异显著的标准为|log2（Fold Change）|＞1且P（padj）＜0.05，使用Tbtools软件对差异基因表达数据进行标准化处理，FPKM值按照log2（FPKM value+1）进行转换以表示基因相对表达水平（Zhang et al.，2020），绘制差异RdbHLH基因在不同干旱胁迫处理下的表达热图。
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1.7 RdbHLH蛋白三维结构预测
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基于转录表达分析，将响应干旱胁迫的RdbHLH蛋白序列与PDB数据库（https://saves.mbi.ucla.edu/）进行PSI-blast同源比对，搜索得到特定RdbHLH匹配的蛋白三维结构模板文件，运用Swiss-model在线工具（https://swissmodel.expasy.org/）以同源建模的方式构建RdbHLH蛋白三维结构模型，将模型文件提交至第三方软件SAVES（https://saves.mbi.ucla.edu/）进行评估确认。
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1.8 RdbHLH蛋白互作网络分析
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运用OrthoVenn2在线工具（https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）将马缨杜鹃所有基因的蛋白序列与拟南芥进行同源比对，经筛选得到RdbHLH和拟南芥基因间的同源关系对，利用STRING数据库（https://string-db.org/）分析同源关系对中拟南芥基因间的互作网络关系，映射得到RdbHLH基因间的互作关系（交互得分≥0.65）。
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2 结果与分析
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2.1 RdbHLH转录因子家族成员的鉴定、理化性质及定位分析
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本研究共鉴定了116个RdbHLH转录因子家族成员，将其重新命名为RdbHLH1-RdbHLH116，已鉴定的RdbHLH详细信息见表1。与前人研究相比，RdbHLH家族基因数量较少，前人在桃树（Prunus persica）（Zhang CH et al.，2018）、红梅（P. mume）（Wu et al.，2022）、黄瓜（Li et al.，2020）、苦荞麦（Fagopyrum tataricum）（Sun et al.，2020）、马铃薯（Solanum tuberosum）（Wang et al.，2018）、玉米（Zea mays）（Zhang TT et al.，2018）和白菜（Brassica rapa）（Song et al.，2014）中分别鉴定出95、100、142、164、190、208、230个bHLH基因，不同物种间bHLH家族基因数量差异较大。
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蛋白理化性质及亚细胞定位分析结果（表1）显示: RdbHLH蛋白序列长度为94~1 024个氨基酸，84.48%的蛋白序列由200~600个氨基酸构成；蛋白分子量为10 552.83~113 904.83 Da，81.03%的蛋白分子量在20 000~60 000 Da之间；蛋白等电点大小为4.87~9.93，平均值为6.69，65.52%的RdbHLH蛋白等电点小于7，呈弱酸性；不稳定指数大于40的RdbHLH蛋白数量为111个（95.69%）；蛋白脂肪指数为47.70~102.50，大于60的蛋白数量占比90%以上；所有蛋白平均疏水指数均为负值，平均为-0.54；除各有3个RdbHLH基因定位到细胞质和线粒体，1个定位到细胞外区域外，其余RdbHLH基因（93.97%）定位于细胞核。
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2.2 RdbHLH的系统发育研究和分类
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目前，对模式植物拟南芥AtbHLH基因的研究较为明晰，本研究选取了131个AtbHLH基因作为分类参照，参与构建RdbHLH转录因子家族的系统发育进化树。根据系统发育树的拓扑结构和AtbHLH亚家族的分类，对RdbHLH亚家族成员进行分类。
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如表2和图1所示，系统发育进化树共划分为30个亚组和21个亚家族，116个RdbHLH家族成员分布在21个亚家族中的17个亚家族中，分别为Ⅰa、Ⅰb1、Ⅰb2、Ⅱ、Ⅲa+b+c+d+e+f、Ⅳa、Ⅳb2+c、Ⅳd、Ⅴa+b、Ⅶa+b、Ⅷa、Ⅷb+c、Ⅸ、Ⅹ-a、Ⅺ、Ⅻ和ⅩⅢ，RdbHLH111和RdbHLH84不能明确归属为AtbHLH的任何一组，故将其归类为ⅩⅢ亚家族，其中Ⅲa+b+c+d+e+f亚家族包含20个RdbHLH家族成员，为数量最多的亚家族，而Ⅳb1、Ⅹ-b、Ⅹ-c和Ⅵ亚家族无RdbHLH家族成员分布。在植物中，同一亚家族成员进化距离越近，其结构、参与途径和生物学过程就可能越相似（Zhang CH et al.，2018），根据系统发育关系和AtbHLH功能可推测RdbHLH的功能，如XI、X和Ⅷc亚家族成员可能参与调节根的生长发育，Ⅻ、Va+b、X、Ⅲa+b+c+d+e+f、Ⅳd、Ⅰa和ⅠⅩ亚家族大多数成员可能参与调控植物生长（细胞伸长、花发育、器官形态建成）和非生物胁迫（干旱、寒冷、盐）反应（Salih et al.，2021）。
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2.3 RdbHLH基因结构、保守结构域和Motif分析
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基因结构分析结果（图2：c）显示：不同亚家族的RdbHLH基因结构差异较大，长度为467 bp（RdbHLH82）~11 869 bp（RdbHLH33）不等；内含子和外显子数量也存在较大差异，内含子数量为0~13个，12个基因（10.34%）无内含子，分布在Ⅲ-1、Ⅷ-1和Ⅹ亚家族中，15个RdbHLH基因（12.93%）有1个内含子，分布在Ⅰ-1、Ⅰ-3、Ⅲ-1、Ⅴb和Ⅷ-1亚家族中，4个基因（RdbHLH28、RdbHLH96、RdbHLH109和RdbHLH110）的内含子数量大于等于10，分布在Ⅲ-2、Ⅳ-2和Ⅻ亚家族中，84个RdbHLH基因（72.41%）的内含子数量为2~8个；外显子数量为1~14个不等，12个RdbHLH基因（10.34%）有1个外显子，分布在Ⅲ-1、Ⅷ-1和Ⅹ亚家族中，98个RdbHLH基因（84.48%）外显子数量为2~8个。多序列比对结果和保守结构域显示（图2：b和图3），RdbHLH基因均含有典型的bHLH结构域，其中含bHLH_SF超家族结构域的基因数量最多，为36个，同一亚家族RdbHLH结构域组成相似性较高。
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如图2：a和图3所示，共鉴定出15个Motif（Motif 1-Motif 15），不同基因包含的Motif数量为1~8个，Motif长度为21~100个氨基酸（表3）。除RdbHLH8、 RdbHLH68、 RdbHLH71、 RdbHLH82、RdbHLH100、RdbHLH102和RdbHLH108不存在碱性基本区，RdbHLH99不存在HLH区外，其余108个RdbHLH（93.10%）均同时含有Motif 1和Motif 2结构，Motif 1和Motif 2位置除了在RdbHLH42、RdbHLH57和RdbHLH88基因中间隔较远外，在其余RdbHLH中均紧密相邻，Motif 1包含一个碱性基本区域和一个螺旋区域，而Motif 2包含一个环状区域和另一个螺旋区域，两个基序共同组成bHLH结构域（图3和图4），RdbHLH保守结构域氨基酸序列中有28个氨基酸较保守（sequence identity＞50%），9个氨基酸高度保守（sequence identity＞90%）。一般来说，系统发育树相邻分支上的RdbHLH具有相似的基序结构，如Ⅰ-2、Ⅱ、Ⅳ-1、Ⅴb、Ⅶ、Ⅷ-1、Ⅸ-1、Ⅺ、Ⅻ等亚家族的基序结构均高度保守。
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续表1
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续表1
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2.4 RdbHLH基因启动子顺式作用元件分析
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基因启动子区域上游序列作为转录因子结合位点，被认为是顺式调控元件，在植物生物学过程中发挥重要调控作用（Schmitz et al.，2022）。为进一步研究RdbHLH的功能，本文对启动子区域的顺式元件进行了鉴定和分析。如表4和图5所示，116个RdbHLH基因中共含有32种，2 731个主要的顺式作用元件，可大致分为四类（Schmitz et al.，2022）：第一类与植物生长发育有关，如分生组织和蛋白代谢调节元件等，包括AT-rich element、CAT-box和O2-site，占总元件数量的4.58%；第二类与激素响应有关，如脱落酸、生长素、赤霉素、茉莉酸甲酯和水杨酸等，包括ABRE、GARE-motif、P-box、TATC-box、TCA-element和TGA-element等9个元件，占比33.54%；第三类为光响应元件，包括ACE、AE-box、GA-motif、G-box、GT1-motif和MRE等13个元件，占比43.39%；第四类为低温、干旱、创伤和厌氧等胁迫响应元件，包括ARE、ATC-motif、LTR、TC-rich repeats和WUN-motif等7个元件，占比18.49%。其中，共有47个（40.52%）RdbHLH家族基因含响应干旱胁迫的顺式作用元件。
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2.5 RdbHLH家族基因在不同干旱处理下的表达分析
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不同干旱胁迫处理下RdbHLH基因的差异表达情况如图6所示。在干旱胁迫下，共有36个RdbHLH基因表达量显著变化，RdbHLH40、RdbHLH21和RdbHLH48在CK组中具有较高的表达量，而在干旱胁迫和复水处理下，表达量均较低，这可能是这些基因参与调控植物正常的生长发育，干旱胁迫限制了植物正常生理过程并抑制了这些基因的表达； RdbHLH28、 RdbHLH104、RdbHLH103在D5处理下，表达量急剧增加，表明这些基因对干旱胁迫较为敏感，在植物抵御中度干旱胁迫阶段发挥重要调控作用；RdbHLH56、RdbHLH7、RdbHLH91、RdbHLH65在CK和D5处理下具有较高表达量，而在D9处理下表达量降低，表明重度干旱胁迫限制了这些基因的表达；RdbHLH23、RdbHLH100、RdbHLH52、RdbHLH82、RdbHLH98和RdbHLH81在D9处理下表达量急剧升高，重度干旱胁迫诱导了这些基因的表达；RdbHLH51、RdbHLH16、RdbHLH50、RdbHLH27和RdbHLH69等9个基因在REC处理下表达量较高，推测这些基因参与植物胁迫损伤后的修复机制；RdbHLH49、RdbHLH95和RdbHLH64在D5和D9处理下表达量均较高，表明这些基因参与植物整个干旱胁迫的响应，其中RdbHLH49和RdbHLH95的表达响应更为强烈，可能在植株抗干旱胁迫过程中发挥了重要调控作用。
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图1 马缨杜鹃与拟南芥bHLH转录因子家族系统发育进化树
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Fig.1 Phylogenetic tree of bHLH transcription factor family between Arabidopsis thaliana and Rhododendron delavayi
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2.6 RdbHLH蛋白三维结构预测
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基于转录表达分析，对强烈响应干旱胁迫的12个RdbHLH蛋白（RdbHLH28、RdbHLH104、RdbHLH103、RdbHLH23、RdbHLH100、RdbHLH52、 RdbHLH82、RdbHLH98、RdbHLH81、RdbHLH49、RdbHLH95和RdbHLH64）三维结构的预测如图7所示。所有RdbHLH均具有α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲的空间构象。整体蛋白三维结构具有一定相似性，所有蛋白成员均具保守的bHLH结构。
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图2 RdbHLH基因的基序、保守结构域和基因结构
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Fig.2 Motif, conserved domain and gene structure of RdbHLH gene
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2.7 RdbHLH转录因子蛋白互作网络分析
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蛋白互作网络（图8）显示，RdbHLH33（同源磷酸三聚异构酶，triose phosphate isomerase，AtTIM），与调控糖酵解的关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）的AtGAPA-2、AtGAPB、AtGAPC2和AtGAPCP-2等蛋白间存在较强互作关系（Suzuki et al.，2021; Simkin et al.，2023），拟南芥AtGAPCp在干旱胁迫响应和ABA信号通路中起关键作用（Zhang et al.，2019），推测转录因子RdbHLH33能够诱导GAPA-2、GAPB、GAPC2和GAPCP-2的表达，促进信号传导，协同调控光合作用还原磷酸戊糖途径和糖酵解途径，维持细胞ATP水平，并增强植株对高温和干旱等逆境的抗性。RdbHLH46（同源AtbHLH29，类FER铁吸收调节剂，FER-like regulator of iron uptake，FRU）、RdbHLH50（同源AtbHLH105，耐IAA-亮氨酸3，IAA-leucine resistant 3，ILR3）、RdbHLH47（同源AtbHLH104）和RdbHLH52（同源AtbHLH39）共同调节基因的表达以增加铁的吸收、分布和利用，维持植物铁稳态，并在缺铁期间提供光保护以减少活性氧积累对植株造成损伤（Jakoby et al.，2004; Akmakjian et al.，2021）。AtbHLH13（Huang et al.，2018）、髓细胞组织增生蛋白2（myelocytomatosis protein 2，MYC2）（Zhu et al.，2023）、茉莉酸ZIM结构域蛋白1（1JAZ1）（Feng et al.，2020）和TIFY7（Singh &Mukhopadhyay，2021）均参与调控茉莉酸诱导的胁迫响应，RdbHLH56（同源AtbHLH13）和RdbHLH7（同源AtMYC2）与AtJAZ1和AtTIFY7蛋白间存在较强的互作关系，此外，茉莉酸响应转录因子AtRERJ1（同源RdbHLH23）（Kiribuchi et al.，2004）、AtbHLH92（同源RdbHLH48）（Shen et al.，2021）和AtJAZ1蛋白间也存在较强互作关系，推测RdbHLH转录因子RdbHLH56、RdbHLH7、RdbHLH23和RdbHLH48在茉莉酸信号通路和盐渗透胁迫响应过程发挥关键调节作用。转录因子Speechless（SPCH）和MUTE均参与调节气孔发育，促进叶表皮转化为气孔（Yang et al.，2022; Zuch et al.，2023），G蛋白信号调节因子E1（regulator of G-protein signaling E1，RGE1）参与调节胚胎生长和发育（Zuo et al.，2021），FAMA可促进气孔保卫细胞分化（Ohashi-Ito &Bergmann，2006），CBF启动子诱导因子1（inducer of CBF expression 1，ICE1）是调节冷诱导的转录激活剂，可通过调控SPCH、MUTE和FAMA基因的连续作用以介导表皮气孔分化（Feng et al.，2013），故推测RdbHLH19（同源AtICE1）分别与RdbHLH74（同源AtMUTE）、RdbHLH42（同源AtSPCH）和RdbHLH67（同源AtRGE1）相互作用调节植物冷应激反应、气孔发育和胚胎发育（Liang &Yang，2015）。拟南芥TIFY转录因子AtTIFY7（Liu &Chen，2019）、bHLH转录因子Transparent Testa8 （AtTT8）（Shin et al.，2013）和Glabra3（AtGL3）（Zhang et al.，2016）均参与调控花青素的生物合成，据互作关系推测RdbHLH37（同源AtTT8）、RdbHLH53（同源AtGL3）和TIFY7转录因子共同参与调控花青素等黄酮类化合物的合成。隐花色素2（cryptochromes 2，CRY2）、光敏色素A（phytochrome A，PHYA）、光敏色素互作因子3/7（phytochrome interacting factor 3/7，PIF3/7）和隐花色素互作因子bHLH1（cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix 1，CIB1）均参与调控植物光周期生长和开花时间（Zuo et al.，2011; Liu et al.，2013），RdbHLH105（同源AtPIF3）、AtPHYA、AtCRY2、RdbHLH21（同源AtPIF7）和RdbHLH65（同源AtCIB1）之间存在较强互作关系，故推测RdbHLH105、RdbHLH21和RdbHLH65参与调控植物的光形态建成、代谢生物合成及信号转导。DYT1（dysfunctional tapetum 1）是拟南芥花药发育及绒毡层早期分化过程中重要的转录因子（Li et al.，2017），AtbHLH10（Huang et al.，2020）、AtbHLH30（Reisfeld et al.，2022）和AtbHLH41（Reisfeld et al.，2022）均参与了绒毡层和花粉的发育调控，据互作关系可推测RdbHLH13（同源AtbHLH10）、RdbHLH2（同源AtDYT1）、RdbHLH8（同源AtbHLH41）、RdbHLH89（同源AtbHLH30）和RdbHLH39（同源AtbHLH144）共同参与调控花的发育。
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图3 MEME预测的RdbHLH转录因子15个Motifs Logo
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Fig.3 15 Motifs Logos of RdbHLH transcription factors predicted by MEME
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3 讨论与结论
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本研究共鉴定了116个RdbHLH转录因子家族成员，相比白菜、玉米和马铃薯等物种，成员数量较少，可能是不同物种在进化、基因组复制或基因组大小及生境等方面的差异导致了物种间bHLH基因数目的不同，马缨杜鹃RdbHLH家族基因没有经历大规模的基因复制事件（gene duplication），而大规模基因复制事件导致了bHLH家族基因在白菜、玉米和马铃薯中的扩展（Carretero-Paulet et al.，2010; Xu et al.，2015）。所有蛋白平均疏水指数均为负值，表明RdbHLH转录因子均为亲水性蛋白；等电点跨度较大（4.87~9.93），表明其编码蛋白能适应不同的酸碱环境；绝大多数RdbHLH蛋白不稳定指数大于40，表明RdbHLH蛋白整体稳定性较差，绝大多数RdbHLHd蛋白定位于细胞核，表明该家族基因主要在细胞核发挥功能。马缨杜鹃RdbHLH基因家族成员聚类划分为17个亚家族，这与植物bHLH家族一般可划分为15~25个亚家族的早期研究结果相符合（Pires &Dolan，2010），其中第Ⅲ亚家族的成员数量最多，无归类为Ⅵ亚家族的RdbHLH成员，这可能是该亚类蛋白在马缨杜鹃的进化过程中丢失所致。同一亚家族内基因的结构、保守结构域和Motif组合具有一定相似性，但在不同亚家族间差异较大，推测正是由于这些特异结构和Motif组合的存在导致了bHLH家族基因功能分化，从而调控植物复杂的生物学过程（Wani et al.，2021）。RdbHLH基因启动子顺式调控元件可分为植物生长发育、植物激素响应、植物光响应和胁迫响应四类，表明RdbHLH基因参与调控植物多方面的生物学过程，光响应相关的元件数量最多，分布最广，表明光信号可能在RdbHLH基因的转录调控中发挥重要作用（Nawaz et al.，2014）。47个RdbHLH家族基因含响应干旱胁迫的顺式作用元件，表明大量RdbHLH参与响应干旱胁迫。对不同干旱胁迫处理下RdbHLH的差异表达分析研究发现其表达模式存在显著差异，说明其功能发生分化，在响应干旱胁迫过程中发挥不同作用（Zhang et al.，2022），干旱的加剧诱导了RdbHLH49、RdbHLH95、RdbHLH64、RdbHLH100、RdbHLH52和RdbHLH82基因的高表达，其中RdbHLH49和RdbHLH95的表达响应更为强烈，在复水后这些基因的表达量降低，这可能是复水作用在一定程度上缓解了植株的干旱损伤，推测它们可能在植物抵御干旱胁迫过程中发挥调控作用。
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图4 RdbHLH蛋白保守结构域多序列比对
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Fig.4 Multiple sequence alignment of RdbHLH protein conserved domain
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RdbHLH46（同源AtFRU）、RdbHLH50（同源AtILR3）、RdbHLH47（同源AtbHLH104）和RdbHLH52（同源AtbHLH39）参与调控铁的吸收、分布和利用，维持植物中铁稳态，并在缺铁期间提供光保护，RdbHLH37（同源AtTT8）、RdbHLH53（ATGL3）和AtTIFY7共同参与调控花青素等黄酮类化合物的合成，这与Kazemitabar等（2020）对芝麻（Sesamum indicum）SinbHLH的蛋白互作研究结果一致，FRU、ILR3和TT8在芝麻生命周期中调控胁迫响应、铁离子内环境稳定和花青素合成。RdbHLH19（同源AtICE1）分别与RdbHLH74（同源AtMUTE）、RdbHLH42（同源AtSPCH）和RdbHLH67（同源AtRGE1）互作调节植物冷应激反应、气孔发育和胚胎发育，该互作关系与前人在拟南芥中的发现相符，ICE1可能通过与SPCH、MUTE和FAMA形成异二聚体，在气孔发育过程中起正调控作用（Pillitteri &Torri，2007; Liu et al.，2009）。RdbHLH105（同源AtPIF3）、RdbHLH21（同源AtPIF7）、RdbHLH65（同源AtCIB1）、PHYA和CRY2共同参与调控植物的光形态建成、代谢生物合成及信号转导，这与Liu等（2018）的研究发现相符，CRY2通过激活CIB1来促进开花素（flowering locus T，FT）mRNA的表达，以响应蓝光。RdbHLH13（同源AtbHLH10）、RdbHLH2（同源AtDYT1）、RdbHLH8（同源AtbHLH41）、RdbHLH89（同源AtbHLH30）和RdbHLH39（同源AtbHLH144）共同参与调控花的发育，这与Cheng等（2023）对拟南芥的研究结果相符，AtbhLH10可与DYT1形成蛋白质复合物，协同作用调控花药分化。差异表达分析中，一些响应干旱胁迫的关键蛋白也被预测存在显著相互作用，综合互作关系推测马缨杜鹃对干旱胁迫的响应主要通过激发胁迫信号传导通路和渗透调节系统，并合成黄酮类化合物以消除活性氧，缓解胁迫损伤。
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图5 RdbHLH基因启动子顺式作用及数量分布
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Fig.5 Cis-acting elements and quantitative distribution of RdbHLH genes promotor
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图6 RdbHLH基因在干旱胁迫下的表达
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Fig.6 Expression of RdbHLH gene under drought stress
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本研究中，RdbHLH基因的系统发育关系和基序结构等特征与功能预测相呼应。例如：拟南芥Ia亚家族的AtbHLH45、AtbHL97和AtbHLH98与气孔发育控制相关（Zhou et al.，2020），同属于Ia亚家族的RdbHLH74和RdbHLH42在互作网络中也体现了该功能；Ⅷb亚家族中的AtbHLH37、AtbHLH40、AtbHLH43和AtbHLH88调控花和果的发育（Carretero-Paulet et al.，2010），被划分在Ⅷb亚家族的RdbHLH72、RdbHLH106、RdbHLH107、RdbHLH11和RdbHLH85在互作网络中也具有类似功能；AtbHLH38、AtbHLH39、AtbHLH100和AtbHLH101基因参与铁缺乏反应（Wang et al.，2013），Ib1亚家族中RdbHLH102、RdbHLH68和RdbHLH52在互作网络中也被预测参与缺铁反应，这体现了系统发育功能推测与蛋白互作网络功能预测相一致。此外，在互作网络中，RdbHLH56、RdbHLH7、RdbHLH23和RdbHLH48被预测在茉莉酸信号通路发挥作用，在这些基因启动子中也存在与茉莉酸甲酯相关的顺式调控元件，包括G-box CGTCA和TGACG基序，预测参与光响应的RdbHLH56、RdbHLH7、RdbHLH23和RdbHLH48基因启动子中也存在G-box、Box 4和GT1-motif等光响应顺式调控元件，这体现了RdbHLH基因结构和功能的统一。
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图7 RdbHLH蛋白三维结构预测
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Fig.7 Three-dimensional structure prediction of RdbHLH protein
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图8 RdbHLH蛋白互作网络
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Fig.8 Interaction network of RdbHLH protein
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综上所述，本研究鉴定了116个RdbHLH基因，对家族成员进行了系统的特征分析和进化分类，结合转录表达数据，对RdbHLH基因在干旱胁迫下的表达模式进行了总结，筛选出与干旱胁迫相关的2个重要候选基因，RdbHLH49和RdbHLH95可能在马缨杜鹃抵御干旱胁迫过程中发挥重要作用，但具体功能仍需开展后续实验进行验证。本研究结果为进一步研究RdbHLH基因的生物学功能提供了理论依据，也为培育马缨杜鹃优良园艺品种提供了靶向基因资源。
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摘要
水分亏缺是制约马缨杜鹃（Rhododendron delavayi）园林应用的关键因子，bHLH转录因子在植物生长发育和胁迫响应过程中发挥重要调控作用。该文以马缨杜鹃基因组文件和转录表达数据为材料，运用生物信息学方法鉴定马缨杜鹃bHLH转录因子（RdbHLH）家族成员，并分析了基因结构、保守基序、系统发育、蛋白理化性质、顺式作用元件、蛋白互作网络及表达模式等特征。结果表明：（1）共鉴定出116个RdbHLH基因，不同蛋白氨基酸数目和分子量大小差异较大，总体为弱酸性亲水蛋白，主要在细胞核行使功能。（2）RdbHLH共划分为17个亚家族，各亚家族基因基序结构保守，但在不同亚家族间差异较大，绝大多数RdbHLH蛋白同时含有Motif 1和Motif 2，启动子区域含大量与植物生长发育、激素响应、光响应和胁迫响应相关的顺式作用元件。（3）马缨杜鹃响应干旱胁迫主要通过激发信号传导通路与渗透调节和黄酮类化合物合成系统，以缓解胁迫损伤；干旱胁迫影响了36个RdbHLH基因的表达,强烈诱导了12个RdbHLH基因的表达，其中RdbHLH49和RdbHLH95可能在植株抗干旱胁迫过程中发挥重要调控作用。研究结果为进一步研究RdbHLH基因的生物学功能提供了理论依据，也为培育马缨杜鹃优良园艺品种提供了靶向基因资源。
Abstract
Water deficiency is a critical factor that restricts the utilization of Rhododendron delavayi in landscaping. bHLH transcription factors are pivotal regulators of plant growth, development, and stress responses. This study aimed to identify members of the R. delavayi bHLH transcription factor (RdbHLH) family by utilizing the R. delavayi genome file and transcriptome data. Through bioinformatics methods, we analyzed various aspects, including gene structure, conserved motifs, phylogenetic relationships, protein physicochemical properties, cis-acting elements, protein interaction networks, and expression patterns. The results were as follows: (1) A total of 116 RdbHLH genes were identified, exhibiting significant variations in terms of amino acid composition and molecular weight of proteins. These genes were primarily weakly acidic hydrophilic proteins that function predominantly within the cell nucleus. (2) The RdbHLH family was categorized into 17 subfamilies, where motif structures were conserved within each subfamily but displayed noticeable differences between different subfamilies. Most RdbHLH proteins contained both Motif 1 and Motif 2 at the same time. The promoter region of these genes contained a substantial number of cis-acting elements associated with plant growth and development, hormone response, light response, and stress response. (3) R. delavayi responded to drought stress by activating signal transduction pathways and regulating osmotic pressure and flavonoid biosynthesis systems, leading to stress damage mitigation. Drought stress exerted an impact on the expression of 36 RdbHLH genes, with 12 genes displaying robust induction. Notably, RdbHLH49 and RdbHLH95 might play pivotal regulatory roles in enhancing plant resistance to drought stress. These research findings provide a theoretical basis for further investigations into the biological functions of RdbHLH genes and establish target gene resources for the breeding of superior horticultural varieties of R. delavayi.
Keywords
Rhododendron delavayi ； bHLH ； bioinformatics ； drought stress ； expression patterns
