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bHLH（basic helix-loop-helix）转录因子是高等植物中仅次于MYB转录因子家族的第二大家族成员，因含有bHLH结构域而得名（Guo et al.，2008）。bHLH转录因子结构域一般由50~60个氨基酸组成，包括N端能与DNA序列顺式作用元件结合的碱性氨基酸区和C端能形成二聚化的螺旋-环-螺旋区（Atchley et al.，1997）。bHLH转录因子广泛存在于高等植物中，Murre等（1989）首次在动物细胞中发现bHLH转录因子家族成员，Ludwing等（1989）首次在植物中发现该家族成员，并表明玉米R基因中bHLH转录因子能够参与调控花青素的生物合成。Liu等（2014）研究发现在拟南芥中过表达bHLH122能显著增强植物的抗逆性，使植株表现出较强的抗干旱能力。Xu等（2017）研究发现MdbHLH33参与调控苹果次生代谢物的生物合成。目前，拟南芥中鉴定出162个bHLH转录因子（Toledo-Ortiz et al.，2003），水稻中鉴定出167个bHLH转录因子（Li et al.，2006），苹果中鉴定出175个bHLH转录因子（杨金华，2017）。bHLH转录因子不仅分布较广，而且在植物生长发育的各个阶段均发挥着重要作用，但在红树莓中bHLH转录因子尚未被鉴定。
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红树莓（Rubus idaeus），又名覆盆子、木莓等，是蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus L.）半灌木植物（房琳琳和赵余庆，2014），果实香甜、美味可口。红树莓中含有丰富的营养活性成分，如花青素、树莓酮、鞣花酸、水杨酸和维生素A等，具有较高的营养价值，被誉为“黄金水果”（刘建华等，2004）。红树莓不仅被用于鲜食，还被用于加工果酒、果汁等（延海荧等，2018）。红树莓中的树莓酮作为天然抗氧化活性物质，因可以很好地分解脂肪而受到人们的广泛喜爱。此外，树莓酮在抗癌、抗炎、预防心脑血管和糖尿病等方面也具有很大的应用潜力（王丰和明哲，2010）。孟宪军等（2012）通过体外消化实验证明红树莓中所含有的树莓酮具有调节高血脂症大鼠血脂的作用，并且能有效改善高血脂症低度炎症状态。Park等（2015）研究发现树莓酮能促进成熟的脂肪细胞基因转录，表明树莓酮能促进脂解和氧化途径。
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本课题组前期通过高效液相色谱已经探究了2种红树莓不同果期的树莓酮含量，为了深入挖掘红树莓中与树莓酮调控相关的bHLH转录因子，本研究以红树莓果实转录组数据为依据，以拟南芥bHLH转录因子为参照，采用生物信息学手段，通过对理化性质、亚细胞定位、二级结构、保守结构域、结构基序以及表达模式进行分析，拟探讨以下问题：（1）红树莓果实中bHLH转录因子家族成员数量；（2）bHLH转录因子家族成员理化性质、二级结构、亚细胞定位、保守结构域、结构基序、系统进化和表达模式等；（3）筛选与红树莓中树莓酮合成相关的bHLH转录因子。本研究旨在筛选红树莓中与树莓酮调控相关的bHLH转录因子，以期为进一步研究bHLH转录因子的结构和功能提供参考。
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1 材料与方法
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1.1 红树莓果实实验材料
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用于转录组测序的2种红树莓‘波尔卡’和‘橙色传奇’果实均由中国林业科学研究院林业研究所董凤祥教授提供。选择‘波尔卡’‘橙色传奇’青果（BEK-qing和CSCQ-qing，15 d）、成熟果（BEK-hong和CSCQ-hong，34 d）为材料（闫希幻等，2020）。摘取大小相似、无病虫害的果实，每个时期摘取15颗果实，放入蒸馏水中浸泡1 min，将果实泥土、污渍冲洗干净，用滤纸擦干，锡纸包好放入液氮中速冻，部分样品放于超低温冰箱中-80℃保存。
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1.2 红树莓果实RNA的提取、质量检测
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采用艾德莱植物总RNA提取试剂盒（RN53）提取红树莓果实总RNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用Nanodrop-2000微量紫外分光光度计定量检测RNA样品的浓度和纯度。
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1.3 红树莓果实转录组测序和组装
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合格样品交由百迈客公司进行Illumina HiSeq高通量测序。以黑莓基因组为参考基因（https://www.rosaceae.org/species/rubus_occidentalis/genome_v1.1）。过滤原始数据中低质量的序列之后使用软件TopHat2将测序reads比对到参考基因组上。基于各样品Reads与参考序列的TopHat2比对结果，使用软件Cufflinks进行转录本的拼接和表达定量。
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1.4 红树莓bHLH转录因子家族的鉴定
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以拟南芥的bHLH蛋白序列为参考序列，利用TBtools软件对转录组数据中的所有蛋白序列进行搜索，去除重复序列后，筛选E-value≤1×10-5的序列为候选蛋白。同时利用PlantTFDB数据库（http://planttfdb.gao-lab.org/）、NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Batch CD-Search工具和SMART数据库（http://smart.embl-heidelberg.de/）对候选基因编码蛋白进行结构域预测，去除不含bHLH结构域及重复的序列。最终确定可靠的bHLH转录因子。拟南芥bHLH转录因子下载于拟南芥数据库（http://www.arabidopisis.org）。
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1.5 红树莓bHLH转录因子家族的理化性质和亚细胞定位分析
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利用在线软件Expasy（http://web.expasy.org/protparam）分析红树莓bHLH转录因子蛋白的基本理化性。利用在线软件ProtComp v9.0（http://linux.softberry.com）对红树莓bHLH转录因子家族亚细胞进行定位分析。利用在线软件SOPMA（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_sopma.html）分析红树莓bHLH转录因子的二级结构。利用在线软件SignalP 5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测红树莓bHLH转录因子的信号肽。
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1.6 红树莓bHLH转录因子保守结构域和结构基序分析
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利用Clustal X软件对红树莓bHLH转录因子蛋白进行多序列比对，比对之后的保守结构域用WebLogo 3（http://weblogo.three-plusone.com/）进行绘图。利用MEME在线程序（http://memesuite.org/tools/meme）对红树莓bHLH转录因子的保守基序进行分析。
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1.7 红树莓bHLH转录因子家族系统进化树的构建
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利用MEGA-X软件并运用Neighbor-Joining邻接法对红树莓和拟南芥的bHLH转录因子构建系统进化树，Bootstrap值设为1 000。
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1.8 红树莓bHLH转录因子家族表达模式的分析
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基于转录组数据，利用TBtools软件的log2（FPKM+1）计算并绘制红树莓bHLH转录因子的表达量。
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2 结果与分析
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2.1 红树莓转录组数据的拼接和组装
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使用百迈克Illumina HiSeq高通量测序平台对‘波尔卡’和‘橙色传奇’2种红树莓果实的不同时期进行转录组测序，经过严格的测序质量控制，共获得86.95 Gb Clean Data，各样品的Q20碱基百分比均大于97.78%，各样品的Q30碱基百分比均不小于94.02%。GC含量为46.42%~47.74%，说明测序质量较高，转录组数据可用于后续分析（表1）。
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以黑莓作为参考基因组，红树莓转录组序列数匹配到参考基因组数据库的比例为81.47%~86.16%，表明转录组数据质量较好，可用于后续基因分析（表1）。
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2.2 红树莓bHLH转录因子家族成员的筛选和理化性质分析
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经过综合比对，在红树莓转录组数据中共鉴定到95个bHLH转录因子，分别命名为RinbHLH1-RinbHLH95。根据Expasy预测显示，红树莓bHLH转录因子家族蛋白序列相差较大，蛋白质数目位于82 bp（RinbHLH65）~1 238 bp（RinbHLH84）之间；相对分子质量介于9 kDa（RinbHLH65）~137 kDa（RinbHLH84）之间；等电点大于7的蛋白有29个，大多数红树莓bHLH转录因子呈弱酸性，能与碱性物质结合；不稳定指数为36.39~91.23，平均集中在55，说明红树莓bHLH转录因子家族蛋白较不稳定；脂肪系数大多集中于70左右；总平均疏水性均为负值，表明红树莓bHLH转录因子家族蛋白均为亲水性蛋白，并且RinbHLH7的亲水性最好，为-0.849。
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利用在线软件SOPMA分析红树莓bHLH转录因子的二级结构，结果表明，红树莓bHLH转录因子的二级结构多为α-螺旋和无规卷曲。其中，77个bHLH转录因子中无规卷曲所占的比例最大，16个bHLH转录因子中α-螺旋所占的比例最大。
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利用在线软件ProtComp v9.0分析红树莓bHLH转录因子的亚细胞定位，预测结果显示，超过半数的转录因子位于细胞核，仅有2个转录因子位于细胞质中。利用在线软件SignalP 5.0 Server 预测红树莓bHLH转录因子的信号肽，结果显示95个bHLH转录因子均不含信号肽。
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2.3 红树莓bHLH转录因子家族蛋白保守结构域和结构基序分析
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利用Clustal X软件对红树莓bHLH转录因子家族蛋白进行多序列比对，并用WebLogo 3进行作图（图1）。由图1可知，红树莓的bHLH保守结构域由50~60个氨基酸组成，含有N端的碱性保守区和C端的螺旋-环-螺旋区。大部分bHLH转录因子在N端含有保守的His5-Glu9-Arg13序列，该区域对bHLH转录因子结合DNA上游启动子区域至关重要，尤其是其中的Glu位点，用于与DNA双螺旋结构中的大沟结合（Garcia-Seco et al.，2015）。红树莓中有78个成员含有Glu9-Arg13位点，可识别并与DNA启动子区的E-box（5′-CANNTG-3′）序列结合，有58个成员含有His5-Glu9-Arg13序列，可以特异识别并与G-box（5′-CACCTG-3′）结合，有8个成员不含有Glu和Arg序列，无法与DNA序列相结合（Hytoneo et al.，2018）。C端的23位和54位的2个亮氨酸（Leu）高度保守，23位的亮氨酸保守性为99%，仅有1个bHLH转录因子（RinbHLH91）的23位为丙氨酸，该序列对于同源和异源二聚化的形成必不可少。
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利用MEME在线软件对红树莓的95个bHLH转录因子家族成员进行基序分析，并用TBtools软件进行可视化 （图2）。用不同的颜色表示红树莓bHLH家族中10种基序。其中，Motif 1（HSLAERR RREKINERLKALQSLVPNGSKM）和Motif 2 （DKAS MLDAIEYVKELQKQVQ）是红树莓bHLH转录因子的保守基序，所有的bHLH转录因子同时含有Motif 1和Motif 2，RinbHLH8/95/40所含有的基序最多（7个），RinbHLH92仅含有1个基序。
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图1 红树莓bHLH转录因子家族的保守结构域
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Fig.1 Conserved domains of the bHLH transcription factor family in red raspberry
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图2 红树莓bHLH转录因子家族保守基序分析
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Fig.2 Conserved motif analysis of the bHLH transcription factor family in red raspberry
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图3 红树莓bHLH转录因子表达模式分析
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Fig.3 Analysis of expression patterns of red raspberry bHLH transcription factors
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2.4 红树莓bHLH转录因子不同发育时期表达模式分析
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基于转录组数据，利用TBtools软件对‘波尔卡’‘橙色传奇’这2种红树莓果实的青果和成熟果的bHLH转录因子进行了表达模式分析。结果表明，95个bHLH转录因子的表达量大多是青果期高于成熟期。RinbHLH71、RinbHLH84、RinbHLH91、RinbHLH4、RinbHLH14、RinbHLH18、RinbHLH21、RinbHLH33、RinbHLH34、RinbHLH60、RinbHLH63、RinbHLH65、RinbHLH70这13个转录因子在2个红树莓品种的2个时期均不表达，推测这些转录因子与树莓果实的生长发育关系较小。RinbHLH75、RinbHLH73、RinbHLH72、RinbHLH7、RinbHLH36、RinbHLH20、RinbHLH86、RinbHLH55这8个bHLH转录因子在‘波尔卡’红树莓中表达量较低，在‘橙色传奇’红树莓青果时期表达量较高，成熟期表达量显著下降。在‘波尔卡’红树莓中RinbHLH81、RinbHLH6、RinbHLH17、RinbHLH82在青果期表达量较高，成熟期表达量明显降低。与拟南芥花青素合成有关聚为同一支的红树莓RinbHLH50、RinbHLH51、RinbHLH58，均是青果期表达量显著高于成熟期（图3）。
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2.5 红树莓bHLH转录因子家族系统进化树的构建
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利用MEGA-X软件对95个红树莓和153个拟南芥的bHLH转录因子构建系统进化树，结果表明，红树莓中95个bHLH转录因子被分为20个亚家族，其中R家族的成员最多，含有12个成员。K、C、D亚家族成员最少，仅含有1个成员，此外，U家族没有聚类到红树莓转录因子家族成员，只有拟南芥家族成员。推测是由于红树莓这一物种在进化过程中出现了基因缺失现象。根据聚类结果可知，氨基酸数量相似、功能相关的转录因子聚集在一起且同一分支的家族成员含有数量和结构相同的基序（图4）。
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3 讨论与结论
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随着测序技术的逐渐成熟，转录组测序技术日益成为挖掘功能基因的常用手段。基于前期实验，本研究采用Illumina HiSeq高通量测序平台对‘波尔卡’和‘橙色传奇’2种红树莓果实的不同时期进行转录组测序，获得了86.95 Gb Clean Data。经组装后获得24 213个单基因。bHLH、 bZIP和MYB转录因子家族已经被证实参与植物次生代谢物的合成（Nakata et al.，2013）。近年来，随着植物基因组测序的不断完善，bHLH转录因子家族成员已经在诸多模式生物中研究得较为透彻，但在其他物种中研究较少。
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图4 红树莓bHLH转录因子家族的系统发育进化树
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Fig.4 Phylogenetic tree of the bHLH transcription factor family in red raspberry
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本研究共鉴定到95个bHLH转录因子，该家族蛋白均不稳定，等电点大多小于7，这与拟南芥（Toledo-Ortiz et al.，2003）、水稻（Li et al.，2006）的bHLH转录因子性质相似。大多数bHLH转录因子位于细胞核，可能是核定位信号将其定位于细胞核中，进一步激活或抑制靶基因的转录水平从而发挥功能。这与黑果枸杞的bHLH转录因子家族亚细胞定位结果相同（刘静等，2020）。
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转录因子通过转录水平与相关基因启动子区结合进而调控基因的表达。bHLH转录因子保守结构域存在N端保守的His5-Glu9-Arg13序列区和C端高度保守的Leu序列区。N端保守的序列区可与DNA启动子区的E-box或者G-box结合，起到调控作用。Leu区大多与蛋白质发生相互作用，形成同源或异源二聚化蛋白复合体。据报道，同样的结果也在银杏（冯磊等，2019）、白菜（唐文武等，2020）、草莓（郑玲等，2022）等物种中发现。以上表明这2个保守区对于bHLH转录因子结合特定的DNA序列至关重要。
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根据bHLH结构域特征，以拟南芥bHLH转录因子家族作为参考（Nakata et al.，2013），可将红树莓bHLH转录因子分为20个亚家族，其中R是最大的亚家族，包含12个成员。通过聚类分析可以初步判断红树莓bHLH转录因子的功能。红树莓RinbHLH31、RinbHLH45、RinbHLH27与拟南芥AT1G03040、AT4G02590聚为同一支，推测其与植物非生物胁迫，与抗盐、抗旱等有重要关系（Liu et al.，2014），红树莓RinbHLH90、RinbHLH91、RinbHLH34与拟南芥AT5G37800、AT1G66470进化关系较近，推测其与植物根毛生长发育、伸长有关（Nesi et al.，2000）。RinbHLH58、RinbHLH50、RinbHLH51和拟南芥AT1G63650、AT5G41315、AT4G09820聚为同一支，推测其参与植物花青素的生物合成（Qi et al.，2014）。‘波尔卡’和‘橙色传奇’这2个品种红树莓的bHLH转录因子表达量大多是青果期高于成熟期，表明红树莓bHLH转录因子调控树莓酮的合成并非是在成熟期。RinbHLH75、RinbHLH73、RinbHLH72、RinbHLH7、RinbHLH36、RinbHLH20、RinbHLH86、RinbHLH55这8个bHLH转录因子在‘波尔卡’红树莓中表达量较低，在‘橙色传奇’红树莓青果时期表达量较高，成熟期表达量显著下降，猜测这些基因可能与‘橙色传奇’红树莓果实独特的黄色有关。此外，这2种红树莓青果期表达量较高的基因并不相同，说明调控红树莓不同颜色的基因有多个，不仅仅是单个基因的作用。这些基因可能是造成红树莓品种颜色差异的一大原因。
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树莓酮与花青素同来源于植物苯丙烷代谢途径，调控花青素的转录因子很大程度上会调控树莓酮的生物合成。RinbHLH58、RinbHLH50、RinbHLH51不仅聚类到花青素一支，而且在青果期和成熟果期表达量差异显著。因此，筛选RinbHLH58、RinbHLH50、RinbHLH51候选为与树莓酮调控相关的转录因子。后续将对其进行功能研究。
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摘要
bHLH转录因子是植物中数量较大的一类转录因子家族，在植物的生长发育、次级代谢调控、激素响应等方面发挥着重要作用。红树莓果实中含有丰富的树莓酮，为了深入探究bHLH转录因子在红树莓生长发育及树莓酮合成过程中的作用，该研究基于‘波尔卡’和‘橙色传奇’2种红树莓果实的转录组测序，鉴定了红树莓bHLH基因家族成员，并对这些基因进行生物信息学分析。结果表明：（1）红树莓果实中共鉴定到95个bHLH转录因子家族成员。（2）红树莓的bHLH转录因子家族成员多数为不稳定蛋白；超过半数成员定位于细胞核。（3）bHLH转录因子N端包含保守的His5-Glu9-Arg13序列，C端包含保守的Leu序列。（4）系统发育树将该家族成员分为20个亚家族，其中R亚家族成员最多，有12个。（5）表达模式图表明bHLH转录因子在青果期表达量较高，成熟期表达量较低。该研究结果为筛选与树莓酮含量变化一致的bHLH转录因子提供了依据，为进一步探究红树莓bHLH家族的功能提供了参考。
Abstract
bHLH transcription factors are a large family of transcription factors in plants, which play important roles in plant growth and development, secondary metabolism regulation, and hormone response. Red raspberry fruit is rich in raspberry ketone. To investigate the role of bHLH transcription factor in the growth and development of red raspberry and the synthesis of raspberry ketone, members of the red raspberry bHLH gene family were identified and bioinformatics analysis of these genes were performed based on transcriptome sequencing of two red raspberry fruits, ‘Polka’ and ‘Orange Legend’. The results were as follows: (1) A total of 95 bHLH transcription factor family members were identified in red raspberry fruits. (2) Most of the bHLH transcription factor family members were unstable hydrophobic proteins; and more than half of them were localized in the nucleus. (3) bHLH transcription factor N-terminal contained the conserved His5-Glu9-Arg13 sequence and C-terminal contained the conserved Leu sequence. (4) The phylogenetic tree divided the family members into 20 subfamilies, of which the R subfamily had the most members with 12. (5) The expression pattern map indicated that the bHLH transcription factor was expressed at a higher level during the green fruit stage and at a lower level during the ripening stage. The results provide a basis for screening bHLH transcription factors that are consistent with changes in raspberry ketone content and provide a reference for further exploring the function of red raspberry bHLH family.
