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泛素化途径中26S-蛋白酶体由泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3和26S蛋白酶体组成，是真核生物生命活动中重要的调节机制之一（Mukhopadhyay et al.，2007; Wang et al.，2015）。泛素化是通过共轭联级反应来识别特定的泛素信号，而泛素连接酶E3决定底物蛋白的特异性识别，根据其作用机理和亚基的不同，可将泛素连接酶E3分为4类，即HECT、U-box、RING和多亚基泛素连接酶家族。其中，U-box的突变会使E3连接酶的活性降低或丧失，并导致细胞分裂、信号传导、生物胁迫、非生物胁迫、生长发育等多个方面功能丧失（宋素胜和谢道昕，2006；Mazzucotelli et al.，2006；Stone &Callis，2007； 秦小兵， 2020；欧斯艳等，2020； Kim，et al.，2021）。U-box结构域最早发现于酵母UFD2蛋白且在真核生物中高度保守，其由70多个氨基酸残基组成，但在不同生物基因组中数量差异较大（Koegl et al.，1999）。
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U-box家族已在多个物种中被鉴定，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中鉴定出61个含有U-box的结构蛋白，其中AtPUB1、AtPUB18、AtPUB19、AtPUB30与低温、干旱和盐胁迫有关（Wiborg et al.，2008）；在水稻（Oryza sativa）中鉴定得到77个U-box结构蛋白，其中OsPUB21、OsPUB23、OsPUB24、OsPUB26、OsPUB28、OsPUB54、OsPUB56、OsPUB60、OsPUB70均与干旱胁迫和稻瘟病有关。此外，在干旱胁迫条件下，OsPUB41基因被OsUBC25激活，并与OsCLC6相互作用，负调控干旱胁迫（Seo et al.，2021）；在香蕉（Musa acuminata）中共鉴定得到91个U-box结构蛋白，其中MaPUB84和MaPUB91在响应干旱胁迫中起正调控作用（Hu et al.，2018）；在番茄（Lycopersicon esculentum）中鉴定出56个U-box结构蛋白，其中Solyc-01g007000.2.1在丛枝菌根真菌胁迫中显著表达；在甘蓝（Brassica oleracea）中鉴定出99个U-box成员，通过启动子分析发现有36个候选基因与激素调节和干旱胁迫相关（Hu et al.，2019； 胡燈科，2021）；在玉米（Zea mays）中共鉴定出76个U-box蛋白，通过分析启动子序列得到玉米U-box基因可能参与光合作用、激素应答和逆境胁迫且响应程度不同，说明各成员间基因功能特异性明显（陈曙等，2022）。
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小立碗藓（Physcomitrium patens）属于非维管束植物、结构简单，是早期登陆植物的代表。植物在从水生到陆生的历程中，需要适应陆生环境的非生物胁迫和生物胁迫，是研究植物发育和逆境胁迫的理想材料（赵奂等，2004；刘艳等，2007；León et al.，2012）；而小立碗藓中的26S蛋白酶体对其发育进程至关重要（Girod et al.，1999）。本文以小立碗藓为研究材料，利用其全基因组数据，通过生物信息学方法鉴定U-box家族中的成员，对其特征及表达进行分析，拟探讨：（1）小立碗藓U-box家族的特征；（2）小立碗藓U-box家族成员在非生物胁迫中发挥的重要作用。以期为后续深入研究小立碗藓U-box家族的基因功能奠定基础以及为其相关研究提供理论依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料和试剂
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1.1.1 材料
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小立碗藓材料由首都师范大学何奕騉教授赠送，利用BCDATG培养基进行继代培养，培养条件为（25±1）℃，光照40 mmol·m-2·s-1，每隔25 d进行继代培养（田旭，2023）。
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1.1.2 试剂
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RNA提取试剂盒TRIzol Reagent（Invitrogen，Cat. No.15596-018）和荧光定量PCR试剂盒Power UPTM SYBRTM Green Master Mix（Thermofisher scientific，Cat. No.25741）均购于赛默飞世尔科技公司；引物合成及测序由生物工程（上海）股份有限公司完成。
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1.2 方法
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1.2.1 U-box家族成员鉴定
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小立碗藓基因组数据来源于phytozome数据库（https://jgi.doe.gov/data-and-tools/data-systems/phytozome/），拟南芥U-box基因和蛋白质序列来源于TAIR（https://www.arabidopsis.org/）。以TAIR数据库中U-box成员PF04564序列与phytozome数据库的小立碗藓全基因组进行BLAST，筛选出小立碗藓U-box基因，并翻译成蛋白质，利用SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）和Batch CD-Search（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/）筛选出U-box的保守结构域，删除无典型U-box结构域的序列后得到的即为小立碗藓U-box家族成员。
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1.2.2 U-box结构特征及亚细胞定位分析
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根据已确定的小立碗藓U-box家族成员的基因与CDS序列，利用TBtools软件分析基因结构并利用注释文件对基因进行染色体定位和可视化（Chen et al.，2020）。通过Expasy Proteomics Server（http://www.expasy.org/roteomics）分析小立碗藓U-box家族成员的蛋白质分子量、等电点等理化性质预测。利用Plant-mPLoc（http://Plant-mPLoc server sjtu.edu.cn）预测U-box蛋白的亚细胞定位。
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1.2.3 U-box系统进化树的构建
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利用MEGA 11软件对拟南芥、玉米、小立碗藓的U-box蛋白序列进行比对，通过邻接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育进化树。参数设置成替换模型为Poisson model，缺口为pairwise deletion，矫正参数值为1 000。
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1.2.4 U-box基因启动子分析和组织表达模式分析
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提取小立碗藓U-box家族基因上游2 kbp的序列，通过Plant CARE（http://bioinformatics.Psb.Ugent.be /webtools/plantcare/html/）对启动子进行预测。利用小立碗藓的EFP（https://bar.utoronto.ca/）搜索31个U-box家族基因在不同组织及发育时期的表达，包括胚胎（S1）、早期孢子（S2）、孢子（S3）、减数分裂时期孢子（M）、假根、配子体、轴丝体、绿丝体、颈卵器、原生质体和孢子体共11个组织（Ortiz-Ramírez et al.，2016）。
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1.2.5 小立碗藓胁迫处理
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将小立碗藓接种在BCDATG培养基中，于25℃、光照16 h/黑暗8 h条件下培养28 d后，将其转移到分别含新鲜的BCDATG培养基和含有50 μmol·L-1脱落酸、100 mmol·L-1甘露醇（mannitol，MAN）和饱和LiCl的新鲜培养基中，对小立碗藓进行激素和不同的渗透胁迫，处理7 d后观察表型（郭强和王晓琴，2016）。
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1.2.6 RNA提取及定量表达检测
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通过TRIzol®提取不同处理后配子体的mRNA，利用RT-PCR kit（Takara，Tokyo）将mRNA转录成cDNA。Primer 6.0设计荧光定量引物后，参照Power UPTM SYBRTM Green Master Mix试剂盒进行定量，反应条件设置为95℃预变性2 min、95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min保持40个循环。以Ppactin 3（GenBank: 3AY382283.1）作为内参对目的基因进行相对定量，基因相对表达量用公式2-△△Ct法计算，3次生物学重复（王倩倩，2021）。具体基因的引物如表1所示。
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2 结果与分析
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2.1 小立碗藓基因组中U-box家族成员的鉴定和理化性质分析
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通过BLAST比对搜索，并利用SMART和Batch CD-Search网站，去除无典型U-box结构域的序列，最终鉴定得到小立碗藓U-box家族共有31个成员，如表2所示，小立碗藓U-box家族成员中，蛋白的分子量差异较大。PpPUB30有1 036个氨基酸，分子量最大，为117.49 kDa；而PpPUB5有327个氨基酸残基，分子量最小，为37.74 kDa； 此外，U-box家族成员的等电点也存在显著差异，PpPUB25等电点为8.55，而PpPUB29等电点为5.32。小立碗藓U-box家族成员不均匀地分布在14条染色体上，分别是1、3、6、9、10、12~15、17、18、20、22、24号染色体。除PpPUB3、PpPUB14、PpPUB18和PpPUB24定位于内质网和细胞核以外，其余成员均定位在细胞核中。
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2.2 小立碗藓U-box家族的基因结构域、基因结构及系统进化分析
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利用基因组注释文件，通过TBtools软件对小立碗藓U-box家族成员的基因结构绘制基因结构图（图1）。由图1可知，在小立碗藓的31个PUB蛋白中，有8个成员仅由1个外显子构成且无内含子。预测31个小立碗藓U-box家族成员的蛋白结构域，得到U-box家族除含有典型的U-box结构域以外，部分还具有WD-重复蛋白和34个多肽重复序列的蛋白质共价结合相关结构域。利用鉴定出的31个小立碗藓U-box家族成员的蛋白质序列与拟南芥和玉米U-box家族成员组成数据矩阵，使用MEGA 11构建系统进化树（图2）。图2结果表明，小立碗藓、拟南芥和玉米U-box家族可以分为9个亚家族，不同亚家族间小立碗藓的U-box成员数量差异明显，其中亚家族Ⅶ中含有小立碗藓成员最多，共有11个（占U-box家族的36.67%）；在亚家族Ⅰ、Ⅲ中各含有6个成员；在亚家族Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ中不含有小立碗藓的成员。
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2.3 小立碗藓U-box家族的基因启动子顺式作用调控元件分析
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对U-box家族成员上游2 kbp的启动子顺式作用元件进行分析和可视化（图3）。由图3可知，其主要有植物激素响应元件和非生物应答元件；在激素调控方面主要有生长素、脱落酸、赤霉素和水杨酸等响应元件；非生物响应元件包括低光反应元件、温胁迫响应元件和干旱胁迫响应元件。在31个U-box家族成员中，所含启动子作用元件的数量和种类差异明显，PpPUB7含有的启动子元件最少，有11个；PpPUB4含有的启动子元件最多，有39个，主要包括低温响应元件、脱落酸反应元件、赤霉素反应元件、生长素反应元件、MeJA响应元件、光反应元件。在植物激素调控方面，与脱落酸调控相关的元件最多，有28个基因家族成员含有与脱落酸调控相关的作用元件。此外，有21个基因家族成员含有与干旱胁迫相关的元件。
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2.4 小立碗藓U-box家族成员在不同组织和发育期的表达分析
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通过eFP Browser（http://www. bar. utoronto.ca/）查询31个小立碗藓PUB基因在不同组织的表达，并将孢子体分为4个发育时期，分别是M期和S1-S3期（Ortiz-Ramírez et al.，2016）。利用TBtools绘制基因表达热图，结果如图4所示，除部分基因（如PpPUB12、PpPUB13和PpPUB18）的表达量较低以外，小立碗藓U-box基因家族成员在不同组织中表达差异变化明显，可以分为3个聚类。其中，大部分PpPUBs在绿丝体、轴丝体和孢子体S3时期大量表达，推测这些U-box成员对原丝体阶段的形成和孢子体的发育起着重要的作用。相对于其他基因家族成员，PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25和PpPUB26在配子体中的表达量较高。由于小立碗藓是以单倍体配子体为主要生活史，因此PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25和PpPUB26在植物配子体对外界的环境响应过程中可能发挥着重要的作用。
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2.5 不同胁迫处理下对小立碗藓U-box家族的表达量分析
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通过ABA、饱和LiCl和甘露醇的处理，观察配子体的表型，并分析小立碗藓U-box家族在配子体中高表达的4个基因PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25和PpPUB26的表达变化（图5）。由图5可知，ABA处理后配子体拟茎的下端出现轻微的黄化；而饱和LiCl和甘露醇模拟干旱处理，均导致配子体的整个部位出现明显黄化，其中LiCl的表型更为明显，其处理后拟叶部位枯萎甚至出现褐色斑点。通过进一步分析PpPUBs的表达量，发现PpPUBs在脱落酸的处理下表达均被显著诱导，可能与其启动子能够结合脱落酸的信号相关，其中PpPUB21的表达最为显著，经ABA处理后增加了8.10倍。在饱和LiCl和甘露醇处理后，PpPUB21的表达量变化最为明显，分别增加了6.50倍和3.90倍。此外，PpPUB26在饱和LiCl处理后被显著诱导，但在甘露醇的渗透胁迫中没有发生显著变化，而PpPUB22和PpPUB25在甘露醇处理后则显著增加。这表明不同PpPUB成员在不同的渗透胁迫下发挥着重要的作用。
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图1 小立碗藓U-box 家族的基因结构（A）和motif分析（B）
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Fig.1 Gene structure (A) and motif analysis (B) of Physcomitrium patens U-box family
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3 讨论与结论
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泛素蛋白质降解途径在植物的生长发育、响应逆境胁迫中发挥重要作用（Xiao et al.，2018）。U-box家族是E3泛素连接酶家族中重要的一个，也是底物特异性识别的重要因子（缴莉等，2016）。在拟南芥的基因组中，与E3泛素连接酶相关的基因有1 200多个，其中U-box是E3泛素连接酶中具有重要功能的一类（赵丹等，2021）。迄今为止，U-box家族的特征和功能已在维管束植物中被鉴定报道，但对小立碗藓U-box家族未见报道。本研究从小立碗藓全基因组中鉴定出31个U-box家族成员，相对于拟南芥和玉米的U-box家族成员要少，但与葡萄的U-box家族成员相同，表明U-box家族成员在不同物种中存在差异，推测这可能与物种间进化关系和适应环境有关（Smalle &Vierstra，2004）；小立碗藓U-box家族成员在不同亚家族间的理化性质及基因结构差异较大，推测不同的成员功能可能存在差异（Ignacio，2010），基因结构与进化分析结果显示，同一亚家族中，不同分支的U-box家族的蛋白质序列长度、保守结构域、外显子和内含子等具有较大差异；同一分支的基因结构相似，说明小立碗藓U-box家族的基因结构较为复杂，暗示其功能的多样性，推测小立碗藓泛素连接酶U-box家族在进化过程中保持高度保守性，在维持其基本功能的同时使其基因功能多样化，以适应环境变化和物种的延续；保守的结构域与基序通常与转录因子的功能相关，而同一分支的保守结构域相似，推测其具有相似的信号调控途径和生物学功能，不同亚家族的特异性保守结构域可能在转录中同样发挥了重要作用（王玉凤等，2023）。小立碗藓U-box家族成员亚细胞定位大部分在细胞核中，说明其在细胞质中合成后进入细胞核发挥作用；此外部分还分布于细胞质中，说明其功能分工上有所不同，可能是在信号传递的不同阶段发挥作用（Sakuma et al.，2002）。通过对小立碗藓31个U-box家族成员启动子功能预测分析发现，其含有大量与植物激素响应相关的元件，表明其能够响应植物的生长发育、逆境胁迫、细胞周期调控和信号转导等，推测U-box家族成员可能参与植物的生长发育（王悦冰等，2008）；通过ABA处理小立碗藓配子体后的基因表达量分析发现，PpPUB21、PpPUB22、PpPUB25、PpPUB26显著上调表达，推测其可能参与ABA响应，而通过干旱处理小立碗藓后的基因表达量分析，发现PpPUB21、PpPUB26基因表达量显著上调，推测其可能参与调控干旱胁迫后恢复，其结果与启动子分析的结果一致（Ignacio，2010）。通过对小立碗藓11个不同组织部位表达分析发现，不同的U-box基因在不同组织中表达差异明显，PpPUB2、PpPUB16在绿丝体、原生质体、假根、配子体、轴丝体和孢子中表达量较高，在孢子体和颈卵器中表达量较低，推测其与小立碗藓单倍体的生长发育有关，PpPUB5、PpPUB6和PpPUB27在孢子体，颈卵器中表达量较高，在绿丝体、原生质体、假根、配子体、轴丝体表达量较低，推测可能与小立碗藓的有性繁殖有关。
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图2 小立碗藓U-box 家族的系统进化树
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Fig.2 Phylogenetic tree of U-box family in Physcomitrium patens
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图3 小立碗藓U-box家族成员的启动子序列分析
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Fig.3 Promoter sequence analysis of U-box family members in Physcomitrium patens
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小立碗藓U-box家族具有与其他物种相似的生物信息学特征及规律，同时参与小立碗藓的生长发育、逆境胁迫的生物学功能。通过研究小立碗藓U-box家族的分子生物信息学特征及组织表达规律，有助于阐明小立碗藓U-box家族的分子调控机制。本研究依据小立碗藓全基因组数据，筛选出31个小立碗藓的U-box 家族成员，各成员内含子数目差异较大，其中8个成员无内含子；亚细胞定位显示PpPUB3、PpPUB14、PpPUB18和PpPUB24定位于内质网和细胞核，其余成员均定位于细胞核中；启动子功能预测分析结果显示，U-box家族成员可能参与小立碗藓激素应答和胁迫应答反应且响应程度不同。基因表达模式分析结果显示，小立碗藓PpPUBs基因表达具有组织特异性。配子体中高表达的PpPUB21在ABA和不同渗透胁迫下均能被显著上调，为进一步揭示PpPUB基因在植物进化过程和逆境胁迫中的作用提供了理论基础，也为将来揭示该基因家族在进化过程中发挥重要的功能以适应环境提供了理论依据。
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图4 小立碗藓U-box 家族成员在不同组织部位及孢子体不同发育时期的表达热图
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Fig.4 Heat map for expressions of U-box family members in Physycomitrium patens in different tissues and sporophytes at different developmental stages
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图5 不同胁迫下小立碗藓配体子的表型及PpPUBs基因的表达分析
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Fig.5 Phenotype of Physcomitrium patens gametophyte and expression analysis of PpPUBs under different stresses
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参考文献
-
CHEN CJ, CHEN H, ZHANG Y, et al. , 2020. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J]. Mol Plant, 13(8): 1194-1202.
-
CHEN S, ZHANG Y, CHEN Z, et al. , 2022. Genome-wide identification and expression analysis of ubiquitin ligase U-box gene family in Maize [J]. SW Chin J Agric Sci, 35(3): 481-490. [陈曙, 张彧, 陈卓, 等, 2022. 玉米泛素连接酶U-box基因家族的全基因组鉴定及表达分析 [J]. 西南农业学报, 35(3): 481-490. ]
-
GIROD PA, FU H, ZRYD JP, et al. , 1999. Multiubiquitin chain binding subunit MCB1 (RPN10) of the 26S proteasome is essential for developmental progression in Physcomitrella patens [J]. Plant Cell, 11(8): 1457-1471.
-
GUO Q, WANG XQ, 2016. The role of ABA on desiccation stress in Physcomitrella patens [J]. J Beijing Univ Agric, 31(1): 1-4. [郭强, 王晓琴, 2016. ABA在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制 [J]. 北京农学院学报, 31(1): 1-4. ]
-
HU D, XIE Q, LIU Q, et al. , 2019. Genome-wide distribution, expression and function analysis of the U-Box gene family in Brassica oleracea L. [J]. Genes (Basel), 10(12): 1000-1024.
-
HU DK, 2021. Genome-wide identification of U-box family and cloning and analysis of BoPUB8 in Brassica oleracea L. [D]. Chongqing: Southwest University. [胡燈科, 2021. 甘蓝U-box家族全基因组鉴定及BoPUB8基因的克隆与分析 [D]. 重庆: 西南大学. ]
-
HU H, DONG C, SUN D, et al. , 2018. Genome-wide identification and analysis of U-Box E3 ubiquitin protein ligase gene family in Banana [J]. Int J Mol Sci, 19(12): 3874-3890.
-
IGNACIO M, 2010. Ancient origin of animal U-box ubiquitin ligases [J]. BMC Evol Biol, 10(1): 331-345.
-
JIAO L, FU SF, ZHANG YL, et al. , 2016. U-box E3 ubiquitin ligases regulate stress tolerance and growth of plants [J]. Chin Bull Bot, 51(5): 724-735. [缴莉, 付淑芳, 张雅丽, 等, 2016. U-box泛素连接酶调控植物抗逆和生长发育 [J]. 植物学报, 51(5): 724-735. ]
-
KIM MS, KANG KK, CHO YG, 2021. Molecular and functional analysis of U-box E3 ubiquitin ligase gene family in rice (Oryza sativa) [J]. Int J Mol Sci, 22(21): 12088-12108.
-
KOEGL M, HOPE T, SCHLENKER S, et al. , 1999. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly [J]. Cell, 96(5): 635-644.
-
LEÓN I, SHHMELZ EA, AGGERO C, et al. , 2012. Physcomitrella patens activates reinforcement of the cell wall, programmed cell death and accumulation of evolutionary con served defense signals, such as salicylic acid and 12-oxo-phytodienoic acid, but not jasmonic acid, upon botrytis cinerea infection [J]. Mol Plant Pathol, 10(8): 960-974.
-
LIU Y, CAO T, CHEN JW, 2007. Advances on the study of the moss Physcomitrella patens, a potential model plant [J]. Guihaia, 27(1): 90-94. [刘艳, 曹同, 陈静文, 2007. 有前景模式植物小立碗藓的研究进展 [J]. 广西植物, 27(1): 90-94. ]
-
MAZZUCOTELLI E, BELLONI S, MARONE D, et al. , 2006. The E3 ubiquitin ligase gene family in plants regulation by degradation [J]. Curr Genom, 7(8): 509-522.
-
MUKHOPADHYAY D, RIEZMN H, 2007. Proteasome-independent functions of ubiquitin in endocytosis and signaling [J]. Science, 315(26): 201-205.
-
ORTIZ-RAMÍREZ C, HERNANDEZ-CORONADO M, THAMM A, et al. , 2016. A transcriptome atlas of Physcomitrella patens provides insights into the evolution and development of land plants [J]. Mol Plant, 9: 205-220.
-
OU SY, ZHANG YN, WANG JX, 2020. Advances in protein ubiquitination in response to low phosphorus stress in plants [J]. J Plant Nutr Fert, 26(11): 2060-2069. [欧斯艳, 张亚楠, 王金祥, 2020. 植物响应低磷胁迫的蛋白质泛素化途径研究进展 [J]. 植物营养与肥料学报, 26(11): 2060-2069. ]
-
QIN XB, 2020. Research progress on the function of ubiquitination modification in DNA damage repair [J]. Hubei Agric Sci, 59(24): 16-20. [秦小兵, 2020. 泛素化修饰在 DNA 损伤修复中的功能研究进展 [J]. 湖北农业科学, 59(24): 16-20. ]
-
SAKUMA Y, LIU Q, DUBOUZET JG, et al. , 2002. DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression [J]. Biochem Biophys Res Comm, 290(3): 998-1009.
-
SALLE J, VIERSTRA RD, 2004. The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway [J]. Ann Rev Plant Biol, 55(1): 555-590.
-
SEO DH, LEE A, YU SG, et al. , 2021. OsPUB41, a U-box E3 ubiquitin ligase, acts as a negative regulator of drought stress response in rice (Oryza sativa L. ) [J]. Plant Mol Biol, 106(4): 463-477．
-
SONG SS, XIE DX, 2006. The ubiquitin-proteosome pathway and plant development [J]. Chin Bull Bot, 23(5): 564-577. [宋素胜, 谢道昕, 2006. 泛素蛋白酶体途径及其对植物生长发育的调控 [J]. 植物学通报, 23(5): 564-577. ]
-
STONE SL, CALLIS J, 2007. Ubiquitin ligases mediate growth and development by promoting protein death [J]. Curr Opin Plant Biol, 10(6): 624-632．
-
TIAN X, 2023. Functional analysis and regulation of PpCAD4 gene in Physcomitrium patens [D]. Guiyang: Guizhou Normal University. [田旭, 2023. 小立碗藓PpCAD4基因功能分析和调控研究 [D]. 贵阳: 贵州师范大学. ]
-
WANG J, QU BY, DOU SJ, et al. , 2015. The E3 ligase OsPUB15 interacts with the receptor-like kinase PID2 and regulates plant cell death and innate immunity [J]. BMC Plant Biol, 15(1): 49-63.
-
WANG QQ, 2021. Cloning and expression analysis of EhHsp90-1 and EhHsp90-2 genes in Eogystia hippophaecola larvae and construction of RNA interference system of EhHsp90-1 [D]. Beijing: Beijing Forestry University. [王倩倩, 2021. 沙棘木蠹蛾幼虫EhHsp90-1和EhHsp90-2基因的克隆表达及EhHsp90-1基因RNA干扰体系的构建 [D]. 北京: 北京林业大学. ]
-
WANG YB, LIANG ZH, HUANG DF, et al. , 2008. Effects of pre-mRNA introns on regulation of eukaryotic gene expression [J]. Biol Bull, 4(1): 1-5. [王悦冰, 郎志宏, 黄大昉, 2008. 内含子对真核基因表达调控的影响 [J]. 生物技术通报, 4(1): 1-5. ]
-
WANG YF, MENG Y, YU HH, et al. , 2023. Identification of AP2/ERF gene family in Aquilegia vulgaris and expression analysis under salt stress [J]. Guihaia, 43(10): 1861-1875. [王玉凤, 孟缘, 于海航, 等, 2023. 欧耧斗菜AP2/ERF基因家族鉴定及盐胁迫下表达分析 [J]. 广西植物, 43(10): 1861-1875. ]
-
WIBORG J, OSHEA C, SKRIVER K, et al. , 2008. Biochemical function of typical and variant Arabidopsis thaliana U-box E3 ubiquitin-protein ligases [J]. Biochem J, 413(3): 447-457．
-
XIAO L, YOBI A, KOSTER KL, et al. , 2018. Desiccation tolerance in Physcomitrella patens: Rate of dehydration and the involvement of endogenous abscisic acid (ABA) [J]. Plant Cell Environ, 41(1): 275-284.
-
ZHAO D, LI B, ZHAO DG, et al. , 2021. Identification and analysis of U-box gene family in Eucommia ulmoides Oliv [J]. Seed, 40(7): 10-17. [赵丹, 李波, 赵德刚, 2021. 杜仲U-box基因家族鉴定及分析 [J]. 种子, 40(7): 10-17. ]
-
ZHAO H, ZHAO XG, HE YS, et al. , 2004. Physcomitrella patens, a potential model system in plant molecular biology [J]. Chin Bull Bot, 21(2): 129-138. [赵奂, 赵晓刚, 何奕坤, 等, 2004. 植物分子生物学研究及其前景的模式系统——小立碗藓 [J]. 植物学报, 21(2): 129-138. ]
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摘要
U-box家族编码E3泛素连接酶能够特异性识别底物，从而调控蛋白的修饰和降解过程。为鉴定小立碗藓U-box家族成员，分析其生物学特征及基因表达规律，该研究基于小立碗藓的全基因组测序数据，通过生物信息学技术对泛素连接酶U-box家族成员的理化性质、进化关系、顺式作用元件、组织表达模式、胁迫响应等进行了分析。结果表明：（1）在小立碗藓全基因组中共鉴定得到31个U-box家族成员，并且不均匀地分布于14条染色体上；其分子量大小在37.75~117.49 kDa之间，等电点介于5.32~8.55之间。（2）进化树显示，小立碗藓的U-box家族成员分布在I-IX亚家族中，其中亚家族VII含有小立碗藓成员最多，共11个（约占36.67%），说明小立碗藓在历史进化过程中具有高度保守性且功能多样化。（3）经启动子分析发现，小立碗藓U-box家族成员具有结合GA和ABA等多个激素的元件。（4）组织表达分析发现小立碗藓U-box家族成员主要在绿丝体、轴丝体和孢子体S3时期大量表达。（5）通过ABA、甘露醇和饱和LiCl处理后发现，配子体的拟茎均发生黄化且PpPUB21的表达量均被显著诱导。推测小立碗藓U-box家族成员在生长发育和响应逆境胁迫中发挥着重要作用，这为后续深入研究小立碗藓U-box家族成员的基因功能研究奠定了理论基础，也为其相关研究提供了参考。
Abstract
The U-box family encodes E3 ubiquitin ligase, which can specifically recognize the substrate and thus regulate the process of protein modification and degradation. In order to identificate the members of the Physcomitrium patens U-box family and to analyze their gene expression regularities, their physicochemical characteristics, evolutionary relationship, cis-acting element, tissue expression patterns and stress response were analyzed based on the whole sequencing data of P. patens through bioinformatics technology. The results were as follows: (1) A total of 31 U-box family members were identified in the whole genome of P. patens and were unevenly distributed on 14 chromosomes; their molecular weight sizes ranged from 37.75-117.49 kDa, and their isoelectric points ranged from 5.32-8.55. (2) The evolutionary tree showed that the U-box family members of P. patens were distributed in subfamilies I-IX, among which subfamily Ⅶ contained the largest number of members, with a total of 11 members accounting for about 36.67%. This indicated that P. patens was highly conserved and functionally diversified in the historical evolutionary process. (3) Promoter analysis yielded that P. patens U-box family members had elements that binded several hormones including GA and ABA. (4) Tissue expression analysis yielded that P. patens U-box family members was abundantly expressed mainly in the chloroplast, axoplast, and sporophyte S3 periods. (5) After simulated drought treatment with ABA, mannitol and saturated LiCl, it was found that the proposed stems of gametophytes were yellowed and the expression of PpPUB21 was significantly induced. It is hypothesized that the P. patens U-box family members plays an important role in growth and development and in response to adversity stress, and these findings provide a reference for further research on the U-box gene of P. patens.
