在现存的 35 万种被子植物中，大约 78%的温带物种和 94%的热带物种需要动物传粉（Paton et al.，2008；Ollerton et al.，2011），尤其是昆虫。最为常见和高效的传粉昆虫是蜂类，对很多蜂类来说，花蜜和花粉是它们唯一的食物来源，只有高频率的拜访花朵，它们才能获取足够的营养用于给自身提供动力和抚育后代，在长期的协同进化后，蜂类进化出和传粉相适应的一系列特征，比如体表有大量的绒毛（Harder，1990；Pauw，2006；Huang &Shi，2013）。蝴蝶也是常见的访花昆虫，访花主要是为了获取少量的能量用于生存，因为它们用于生长和繁殖所需的营养物质在幼虫阶段都已经积累完成（周尧，1998；廖宇，2009），蝴蝶有着长长的口器，可以吸食多种植物的花蜜，这些植物不仅可以是开放式的花朵，还可以是花蜜比较隐藏的花朵，如花冠管较长且为蜂类传粉的植物，因此蝴蝶被认为是一个传粉效率低下的机会主义者（Jennersten，1984；Massinga et al.，2005）。但是部分研究发现蝴蝶也是十分高效的传粉昆虫，而且植物也能很好地适应蝴蝶传粉（Butler &Johnson，2020；Liu et al.，2022）。考虑到蝴蝶访花的普遍性，我们需要更多的研究来阐明蝴蝶在传粉系统中的作用。

大部分由蝴蝶传粉的植物是由蝴蝶的口器或者头部来传播花粉，这些植物往往具高脚碟状花冠，花冠的下部为狭圆筒状，上部突然扩大成平面的裂片，花药和柱头一般内藏于花冠筒中或者和冠口齐平（Massinga et al.，2005；Ferrero et al.，2009）。为了减少同域分布的其他植物花粉带来的干扰，不同植物趋向于使用传粉动物的各部位来传粉（Dressler，1968；Armbruster et al.，1994；Muchhala &Potts，2007；Johnson，2010）。虽然蝴蝶翅膀的表面积很大，但是相对而言，利用蝴蝶翅膀传粉的植物较少，这些植物主要分布在8个不同的科中，包括石蒜科、百合科、秋水仙科、鸢尾科、唇形科、豆科、杜鹃花科和山柑科，在这些科中，植物的花通常具有高度外露的花药和柱头，花冠成蜘蛛花型或者碗状（Cruden &Hermann-Parker，1979；Johnson &Bond，1994；Butler &Johnson，2020；Liu et al.，2022）。因此，该种花部特征可能代表了蝴蝶翅膀传粉综合征。

忽地笑（Lycoris aurea）为石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜属（Lycoris Herb）多年生草本植物（裴鉴，1985）。忽地笑鳞茎内富含石蒜碱、加兰他敏、力克拉敏等10余种生物碱，可用于治疗轻中度老年性痴呆症、小儿麻痹后遗症等疾病，同时具有抗肿瘤、抗病毒和抗疟的作用，对癌症具有一定疗效，不仅能抑制癌细胞的生长，还能杀死癌细胞，具有重要的药用价值（孙志峰等，2013；季宇彬等，2016；Masi et al.，2020）；忽地笑花色艳丽、色彩缤纷，是一种具有观赏价值的野生花卉资源，深受人们的喜爱，在日本和中国台湾地区的忽地笑切花市场已经初具规模（袁菊红和胡绵好，2009）。近年来，由于经济利益驱动，国内的忽地笑被大量采挖，野生资源破坏较为严重（潘春屏，2023）。为减缓忽地笑这一特有花卉物种资源的流失和破坏，保护其资源多样性，有必要对忽地笑的野外繁殖状况进行研究。在石蒜科中发现蝴蝶翅膀传粉的植物，如网球花（Scadoxus multiflorus）、美丽花盏（Brunsvigia marginata）、君子兰（Clivia miniata）、紫根兰（Cyrtanthus elatus）等都是分布在南非（Butler &Johnson，2020），它们都具有典型蝴蝶翅膀传粉的花部特征，而分布于中国的忽地笑有类似的特征，呈蜘蛛花型，具有高度外露的柱头和花药，我们预测其也是由蝴蝶翅膀传粉。为此，本文对该物种花部特征、繁育系统、传粉昆虫及其行为进行了研究，旨在探讨以下两个问题：（1）蝴蝶是否为忽地笑的有效传粉动物和如何为其传粉；（2）忽地笑的自然居群是否存在花粉限制。这些问题的答案不仅可以让我们更深入认识蝴蝶翅膀传粉综合征的进化，也可为忽地笑的资源保护和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地点和试验材料

观察试验于2022年8—10月在贵州省贵阳市花溪区党武镇思丫村附近的喀斯特落叶林下进行，地理位置为106° 38′ E、26° 23′ N，海拔1 130~1 220 m，属中亚热带温润季风气候，全年平均气温15.7℃，植被类型为落叶阔叶林。忽地笑主要分布在中国西南的省份，贵阳市处于该物种的分布中心（裴鉴，1985），此处是开展忽地笑的传粉生物学的理想试验区。忽地笑鳞茎卵形；叶剑形；伞形花序，有花4~8朵，黄色；蒴果具3棱；种子少数，近球形，黑色；花叶不同期，叶期10月至次年5月，花期8—9月，果期10月。忽地笑在此处生长在腐殖土和石缝中，研究的居群大约有3 000个个体，400~600个花序。

1.2 方法

1.2.1 花部特征观察与花粉胚珠比（P/O）测定

随机选择20朵来自不同植株上的花蕾，用号牌进行标记。于每天早上9:00进行观察并记录花的状态，即花瓣开放状态、花药是否开裂散粉。我们观察到忽地笑的花柱存在运动现象后，记录了花柱的运动方向并测量了花丝和花柱两者之间的角度。从开花第一天到花朵枯萎凋谢，我们用量角器测量并记录花柱与和花柱夹角最小的一束花丝之间的度数，用游标卡尺测量了花药与柱头之间的距离。随机选择20个处于盛花期的植株，用号牌在每个植株上随机标记1朵开放的花，用游标卡尺测量花冠长、花冠宽和花冠筒长。

随机选取35朵来源于不同植株上即将开放的花蕾，用镊子剖开花蕾后取出全部花药分别置于1.5 mL离心管中，用镊子夹取子房置于另外一个离心管中，同一花蕾的花药和子房标号对应，加入75%酒精，带回实验室。在室内用镊子分别将每朵花的花药全部夹碎，置于50 mL EP管中，加蒸馏水定容至50 mL，充分摇匀后用移液枪取出10 μL，置于载玻片上，于显微镜下计数单花花粉数，重复统计10次。用镊子分别将每朵花的子房取出后剖开，统计单花胚珠数目。计算花粉胚珠比（单花花粉数/单花胚珠数，即P/O）。

1.2.2 柱头可授性

随机选取90朵尚未开放的花蕾套袋，分成3个处理，每个处理30朵花，分别在单花开花第1天、第3天、第5天后取同种异株上刚散粉的花药对柱头进行人工授粉。一个月后收取所有处理的花，统计每种处理的平均种子数。实验结果用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。

1.2.3 花蜜量和花蜜糖浓度测定

随机选取60朵尚未开放的花蕾套袋，分成3个处理，每个处理20朵花，分别在单花开花第1天、第3天、第5天后取下花朵，使用内径为0.5 mm，长度为100 mm的玻璃毛细管吸取每朵花的花蜜，用游标卡尺测量花蜜在毛细管内的长度，计算花蜜体积公式：V=πr²h（式中：r为毛细管内半径；h为毛细管内花蜜长度）。将测完体积的花蜜采用手持式折光测糖仪（0~50%、45%~80%）测定糖浓度。花蜜量和花蜜糖浓度分别用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。

1.2.4 访花和传粉昆虫种类和行为的观察

于忽地笑盛花期（8月中旬），选择开花集中的地方，选取200朵花进行访花昆虫观察，连续观察4 d，时间为9：00—17：00。每隔 1 h 观察记录访花昆虫种类、数目和访问频率，并记录昆虫在单花上的访问时间，对每种昆虫的访花行为进行拍照和视频记录。用捕虫网捕捉访花昆虫带回室内鉴定，在解剖镜下观察记录昆虫携带花粉情况，同时在蝴蝶翅脉图上绘制出花粉所分布的区域。

1.2.5 授粉试验

为检测忽地笑的繁育系统类型，在该居群实施以下6组处理：（1）自然对照，使用号牌标记80朵即将开放的花蕾，以检测自然状态下结实情况；（2）去雄套袋，标记30朵即将开放的花蕾，用镊子去掉雄蕊后套上尼龙袋，不做任何处理，以检测是否存在孤雌生殖现象；（3）不去雄套袋，标记30朵即将开放的花蕾并套袋，以检测是否具备主动自交能力；（4）人工去雄自交，标记80朵即将开放的花蕾去雄并套袋，花开放后用同一植株上其他花朵上的花粉人工授粉；（5）人工去雄异交，标记80朵即将开放的花蕾去雄并套袋，花蕾散开后用其他个体的花粉人工授粉；（6）补充异交花粉，标记80朵花做补充异交花粉处理。一个月后收取所有处理的花，统计坐果率和每果种子数。用人工去雄自交的坐果率和每果种子数分别除以人工去雄异交的坐果率和每果种子数，得出忽地笑的自交亲和系数（Becerra &Lloyd，1992）。比较自然对照和补充授粉处理的坐果率和每果种子数，检验该居群是否存在花粉限制。利用卡平方（χ²）和单因素方差分析分别检验各种处理的坐果率和每果种子数。

2 结果与分析

2.1 花部特征与P/O 值

忽地笑的单花持续时间为（5.9±0.1） d （平均值±标准误，下同）。由图1可知，忽地笑最初花药和柱头聚集在花朵中央，花蕾上的花瓣散开后雄蕊稍微散开，此时花丝和花柱集中成一束，随后花柱很快向下移动，同时花药开始纵裂散粉，开花第2天后花柱逐渐向上移动，第3天时基本与花丝在同一条线上，柱头比花药高29.4 mm，第3天后花柱和花丝位置无明显变化。我们在开花第1天早上9：00观察到花丝和花柱两者之间的角度为（30.3±3.2）°，第2天为（19.9±3.1）°，第3天为（3.1±0.3）°，第3天后无明显变化。花冠长为（50.5±0.9） mm，花冠宽为（86.3±2.5） mm，花冠筒长为（15.0±0.6） mm。单花花粉数目为（310 000.0±19 725.2），胚珠数目为（13.5±0.7），P/O值为（23 488.6±1 306.1）。

2.2 柱头可授性

进行人工授粉处理后，柱头在开花后的第1天、第3天和第5天都有一定的可授性，三者产生的种子数不存在显著差异（df=2，F=0.049，P=0.952）（图2），这表明忽地笑在整个花期柱头都具有一定程度的可授性。

2.3 花蜜量和花蜜糖浓度

忽地笑开花第1天的花蜜量为（9.1±0.5） μL，与第3天（19.9±1.6） μL和第5天（21.4±1.1） μL存在显著性差异（df=2，F=34.768，P＜0.05），第3天（19.9±1.6） μL与第5天（21.4±1.1） μL不存在显著性差异（P=0.351）。第5天的糖浓度为（42.3±2.2）%，与第1天（31.7±1.2）%和第3天（32.0±1.3）%存在显著性差异（df =2，F=13.464，P＜0.05），第1天（31.7±1.2）%与第3天（32.0±1.3）%不存在显著性差异（P=0.907）（图3）。

2.4 访花和传粉昆虫种类和行为

对忽地笑的访花昆虫连续观察4 d后发现，访花昆虫主要有凤蝶、熊蜂和蚂蚁（图1）。其中，凤蝶为最常见的访花昆虫和有效的传粉动物，它们访花主要是吸取花蜜，访花时腹面后翅携带大量花粉（肉眼能分辨），访花频率为每花每小时0.098 4次。熊蜂访花时最初停留在花冠上，然后沿着花冠边缘进入花冠基部取食花蜜，由于忽地笑花丝和花柱较长，熊蜂体型相对小，它们一般不会碰到花药和柱头。蚂蚁取食花蜜时，在花冠上和花冠基部频繁活动，其体型很小，身体通常也不会接触到花药和柱头。

凤蝶在9：00 后开始出现访花，访花频率随着气温升高逐渐增多，14：00—16：00为凤蝶出现高峰期；随着气温降低和光照减少，凤蝶出现频率减少。凤蝶在单个花序上平均拜访（1.2±0.1）朵花。我们一共捕捉了14只凤蝶，其中8只为玉斑凤蝶（Papilio helenus）、3只为蓝凤蝶（P. protenor）、2只为碧凤蝶（P. bianor）、1只为宽带凤蝶（P. nephelus），在解剖镜下观察发现花粉均集中在这4种凤蝶的后翅腹侧翅脉上，在前翅腹侧观察到少量花粉，其他部位没有观察到（图4）。而在捕捉到的3只熊蜂和12只蚂蚁身体的各个部位中，解剖镜下观察并未发现忽地笑的花粉。

2.5 授粉试验

去雄套袋和不去雄套袋处理均不结实，说明忽地笑不存在孤雌生殖现象和主动自交能力。由表1可知，人工去雄异交坐果率显著高于人工去雄自交的坐果率（χ²=7.243 1，df=1，P=0.007），但是每果种子数没有显著差异（t=-0.686，P=0.494）。基于坐果率和每果种子数得到的自交亲和系数分别为0.64 和0.90（表1），表明忽地笑自交后也很有可能结实。补充授粉显著提高了忽地笑的坐果率（χ²=10.002，df=1，P=0.002），坐果率从36% 增加到 63%（表1），但是每果种子数没有显著差异（t=-0.051，P=0.96），说明忽地笑在自然状态下存在一定程度的花粉限制。

3 讨论与结论

忽地笑的花呈蜘蛛花型，具有高度外露的柱头和花药，根据前人的研究结果，该种花部特征的植物由蝴蝶翅膀传粉（Cruden &Hermann-Parker，1979；Johnson &Bond，1994；Kiepiel &Johnson，2014；Epps et al.，2015；Liu et al.，2022），因此我们预测忽地笑的传粉方式为蝴蝶翅膀传粉，经过野外定点试验和观察，可以确定凤蝶是忽地笑的有效传粉动物且是利用其翅膀为忽地笑传粉。虽然熊蜂和蚂蚁是忽地笑的访花昆虫，它们沿着花冠边缘到达花冠筒口并吸取花蜜，但是由于忽地笑的柱头和花药离花冠筒口较远，熊蜂和蚂蚁在访花过程中不能碰触到它们，在采集到的熊蜂和蚂蚁标本身体表面，我们也没有观察到忽地笑的花粉，因此熊蜂和蚂蚁最有可能是忽地笑的窃蜜者。4种凤蝶被观察到拜访忽地笑的花，在它们的后翅腹侧沉积了大量忽地笑的花粉，在拜访过程中，我们发现蝴蝶的翅膀会接触到忽地笑外露的柱头和花药，因此蝴蝶应该是忽地笑的有效传粉动物。南非是石蒜科植物的起源中心和多样性中心（Ito et al.，1999），前人已经发现多种石蒜科植物由蝴蝶翅膀传粉，它们都是分布在南非，并且发现携带花粉的蝴蝶种类也主要是凤蝶（Johnson &Bond，1994；Kiepiel &Johnson，2014；Butler &Johnson，2020）。本研究证实了在石蒜科中该种传粉方式在中国也存在，这说明蝴蝶（凤蝶）翅膀传粉在石蒜科植物中可能是一个重要的传粉方式，未来可通过研究石蒜科的系统发育和传粉方式，来探讨石蒜科植物在分化和扩散过程中传粉模式的演变具有重要科学意义。

忽地笑的花部特征与蝴蝶翅膀传粉相适应，具体表现在以下三点特征。第一，忽地笑的花和凤蝶的体型是匹配的，忽地笑的花为两侧对称，蝴蝶访花时，抓住花被片和花丝维持身体平衡，口器朝向花冠口以吸取花蜜，此时蝴蝶后翅腹侧就可以接触到高度暴露的花药和柱头，这种完美的匹配反映了传粉动物对植物的花部特征有很强的塑造作用（Fenster et al.，2004）。第二，忽地笑具有雌雄异位的特点，在花刚开放的时候，花柱和花丝是在同一个平面，但是很快花柱向下移动，这样花柱和花丝就有一个约30°的夹角，蝴蝶来拜访花的时候，一般停留在花丝上方，后翅腹侧可以和花药接触，而不能和花丝下方的柱头接触。在开花的中后期，花柱向上运动且变得更长，最终花柱和花丝呈平行状态，但是柱头往往比花药高2~3 cm，此时蝴蝶访花时其后翅往往只接触到柱头。虽然柱头可授性试验表明柱头一直都有可授性且忽地笑是自交亲和的，但是蝴蝶访花很难导致花内传粉，这样可避免自交和雌雄干扰。第三，忽地笑花药以纵裂方式裂开，裂开后的形状呈平口状，这个特征利于蝴蝶访花时翅膀触碰到花药时大量花粉附着其上。Shwe（2020）就发现在蝴蝶翅膀传粉的匍茎百合（Lilium lankongense）具有类似的雌雄异位机制以避免花粉折损，同时也具有类似利于花粉附着在蝴蝶翅膀上的花药裂开方式及裂开形状。

人工自交授粉试验证明忽地笑具有一定的自交亲和能力，该结果与李雪等（2023）对中国石蒜交配系统的研究结果一致，即以异交为主，有一定的自交能力，这说明石蒜属植物可能普遍具有一定的自交能力，但这不等同于说明它们有较高的自交率。石蒜属植物为多年生具鳞茎植物，多年生植物由于反复繁殖，如果有一定的自交率，自交衰退效应会持续累积，会强烈降低个体的繁殖适合度，因此多年生植物往往趋向于异交（任明迅等，2012）。忽地笑虽然有一定自交能力，但是套袋试验证明其不存在主动自交的能力。忽地笑的雌雄异位基本可以避免同株自花传粉且凤蝶每次访花一般也只访问1朵花，这样就可以避免同株异花传粉。我们推测忽地笑虽然有一定的自交亲和性，但是通过特定的花部机制和传粉动物的互作，使得其自交率维持在一个非常低的水平，这需要通过分子标记来检验交配系统加以验证。

在补充花粉后，忽地笑的坐果率有显著提高，说明该物种在自然状态下存在花粉限制，这可能是由于传粉动物凤蝶访问次数少导致，而每果种子数的变化不是很大，可能是由于忽地笑的子房中胚珠数量有限且往往只有1~2个胚珠发育成种子，一次有效拜访后落置的花粉就足够忽地笑结实。在石蒜科中许多物种也存在一定的花粉限制，如Haemanthus rotundifolius、Cyrtanthus ventricosus、C. guthrieae（Johnson &Bond，1997）。有研究发现蝴蝶可适应低糖浓度花蜜（Kingsolver &Daniel，1979；Goldblatt &Manning，2002；Martins，2015），如Johnson和Bond（1994）就发现在蝴蝶传粉的石蒜科植物中，糖浓度一直较低。但是本研究发现，在忽地笑分泌的花蜜糖浓度在开花后期达到40%以上。这可能反映传粉动物活动的不足，糖浓度的升高是由于花蜜持续分泌，凤蝶拜访较少，而水分通过花冠筒口不断蒸发，使得糖浓度增加。栖息地丧失和全球气候变化会使得蝴蝶数量变少（Bonebrake et al.，2016；Jain et al.，2017；Miao et al.，2021），全球气候变化还会使得蝴蝶的生存空间向高纬度和高海拔移动，随着气温上升，成虫出现时间也会提前（赵彩云等，2010），这可能导致蝴蝶和其传粉植物的物候不同步和分布不重叠。在我们研究的居群中，忽地笑的个体以成年植株为主，小个体植株较少（未发表数据），忽地笑的自然更新可能存在障碍，我们需要更多的研究来评估这一重要野生资源的生存繁育状况。

注：数值=平均值±标准误。不同处理间标有相同字母表示无显著性差异（P＞0.05）； 不同字母表示有显著性差异 （P＜0.05）; n为样本量。

Note: Data= $\stackrel{-}{x}\pm s_{\stackrel{-}{x}}$. The same letter among different treatments indicates no significant difference (P＞0.05) ; the different letters indicate significant differences （P＜0.05）; n is the sample size.

参考文献