龙牙百合（Lilium brownii var. viridulum）主产于湖南、江西、贵州、四川等地，是我国传统的食用百合栽培种类，亦是一种道地药材。此外，龙牙百合观赏价值较高，是一种药食赏兼用的多功能植物，在乡村振兴中发挥重要作用。近年来，湖南、江西等龙牙百合主产区面临着因品种退化、土传病害严重而导致的连作障碍问题（蒋思佳，2023）。百合栽培过程中面临的土传病害是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎病（Prados-Ligero et al.，2008；王丽波等，2018；Sun et al.，2024），通常采用化学方式进行防治。但是，由于化学防治容易造成农残含量超标等一系列问题，而利用抗性品种进行枯萎病防治则更加安全、环保，因此利用杂交进行龙牙百合抗性育种具有重要意义。目前，杂交育种既是培育百合新品种的主要手段，也是近代育种工作中最常采取的方法，育种学家已经培育出大量枯萎病抗性强的观赏百合品种（杨秀梅等，2010；龙彬等，2018）。然而，鲜有人利用杂交育种进行龙牙百合抗病性种质创新。

目前，已有大量学者对不同百合品种的枯萎病抗性进行了评价。其中，亚洲百合杂种系（Lilium Asiatic hybrids）的抗性最强，麝香百合杂种系（Lilium longiflorum hybrids）的抗性次之，东方百合杂种系（Lilium Oriental hybrids）的抗性最弱（Lim et al.，2003；杨秀梅等，2010）。由于百合商业栽培品种更新较快，因此近年来畅销的观赏百合栽培品种的枯萎病抗性并未获得鉴定。已有一些学者将易感枯萎病的百合品种与枯萎病抗性强的百合品种进行杂交，成功选育出抗枯萎病的杂交后代。例如，谢松林（2011）将易感枯萎病的麝香百合‘White fox’与具有枯萎病抗性的亚洲百合‘Connecticut king’进行杂交，获得了具有枯萎病抗性的杂种后代；龙彬等（2018）利用枯萎病抗性强的东方百合‘Huaxianzi’作母本参与杂交，培育出了对镰刀菌有很强抗性的东方百合新品种‘惊鸿’。利用枯萎病抗性强的观赏百合与易感枯萎病的龙牙百合进行杂交，有望获得具有枯萎病抗性的龙牙百合新种质。当前，有关龙牙百合的杂交育种研究主要聚焦于培育赏食兼用的龙牙百合杂交后代，如武利可（2020）将万载龙牙百合和兰州百合（Lilium davidii var. unicolor）进行杂交，崔罗敏（2021）将三倍体观赏百合与二倍体食用龙牙百合进行杂交。以上2个研究均成功获得了杂交后代，但未对亲本及后代的抗病性进行评价。

虽然枯萎病已成为遏制龙牙百合种球生产的重要因素之一，但有关培育龙牙百合抗枯萎病杂交后代的研究鲜见报道。因此，本研究以湖南省隆回县的龙牙百合，以及目前国内市场上畅销的14个百合栽培品种为材料，对其进行枯萎病的抗性评价，将筛选出抗病性强的百合栽培品种与龙牙百合分别进行正交和反交，并对杂交后代进行枯萎病抗性鉴定，以期为龙牙百合的远缘杂交提供参考，为后期培育抗性强的百合新品种提供材料基础。本研究拟探讨以下问题：（1）参与杂交的亲本材料的枯萎病抗性；（2）通过重复授粉、子房切片及胚珠离体培养能否克服龙牙百合远缘杂交障碍；（3）通过SSR分子标记鉴定以及杂交后代的枯萎病抗性鉴定能否鉴定出具有枯萎病抗性的龙牙百合杂交后代。

1 材料与方法

1.1 材料

研究所用植物材料包括传统栽培变种龙牙百合（购自湖南一线情农业有限公司）和观赏百合栽培品种（5个杂种系14个品种，均购自浙江的虹越花卉股份有限公司和湖南的龙山县印家界生态农业开发有限公司）。其中，亚洲百合杂种系品种（A）为‘金百合’、‘Tresor’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Secret kiss’、‘Strawberry event’；东方百合杂种系品种（O）为‘Sorbonne’；麝香百合杂种系品种（L）为新铁炮百合（Lilium×formolongi）、‘Pink planet’；麝亚百合杂种系品种（Lilium longiflorum hybrids×Lilium Asiatic hybrids，LA）为‘Yellow brush’、‘Brindisi’；麝东百合杂种系品种（Lilium longiflorum hybrids×Lilium Oriental hybrids，LO）为‘Cali’、‘Magnefique’。以上植物材料的种球均于2022年春季栽培于湖南农业大学园林花卉基地，植物材料开花图片如图1所示。供试菌种尖孢镰刀菌（菌株编号为ACCC37262，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心），该菌为百合枯萎病的致病菌。菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA），购自北京索莱宝科技有限公司，37 g·L^-1，置于25℃下培养7 d后保存于4℃冰箱待用。

1.2 方法

1.2.1 枯萎病抗性鉴定

对所有百合材料采用离体叶片接种法进行枯萎病抗性鉴定。（1）离体叶片的准备：每个百合品种选择生长健壮发育阶段一致的植株，每个品种分别从上、中、下 3个部位等量摘取叶片，共摘取30片叶片。（2）菌丝块的准备：用直径为0.5 cm的打孔器将尖孢镰刀菌打成菌丝块，待用。（3）接种：将摘取的叶片用75%酒精灭菌15 s，用无菌水冲洗干净，摆放于铺有无菌滤纸的培养皿上，滤纸用无菌水保湿；用接种针挑取菌丝块，每个叶片上分别接种2个菌丝块，菌丝面朝下和叶片充分接触；将叶片基部用湿润的棉球覆盖，接种完成后包上保鲜膜，置于25℃条件下培养，分别于1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的同一时间调查叶片的发病情况，每日观察时在滤纸上滴加无菌水。

百合尖孢镰刀菌侵染叶片致病的分级标准、枯萎病抗性评价标准参照朱丽梅等（2012）的方法。枯萎病叶部病斑分级标准如下：0级，无病斑；1级，叶片病斑较少，病斑面积占整片叶面积的 5%以下；3级，病斑较多，病斑面积占整个叶面积的 5%~30%；5级，病斑较多，病斑面积占整个叶面积的 31%~50%；7级，病斑很多或融合成大斑，病斑面积占整个面积的比例在50%以上。根据相对抗性指数进行抗性划分，抗性水平及对应的相对抗性指数分别为高抗（HR）=0.70~1.00、中抗（MR）=0.40~0.69、中感（MS）=0.20~0.39、高感（HS）＜0.20。

病情指数的计算公式如下：

病情指数（%）=Σ（病级叶片数×病级代表值）/（调查总叶片数×最高病级代表值）×100；相对抗性指数（%）=100-相对病情指数。

1.2.2 杂交组合与杂交方式的确定

根据不同百合种及品种的枯萎病抗病程度、前期测定的花粉生活力情况，确定杂交组合。选择枯萎病抗性为高抗、中抗的观赏百合栽培品种与龙牙百合分别进行正交和反交，作父本的观赏百合栽培品种要求具有较强的花粉生活力。采用常规杂交授粉方式，分别于花蕾期、盛花期、末花期进行不同时期授粉，每天早、中、晚重复授粉3次，每个杂交组合杂交 30 朵花以上，授粉后套袋，并挂上标签（周敏等，2023）。授粉后30 d统计子房膨大率，子房膨大率（%）=膨大子房数/授粉花朵数×100。

1.2.3 子房切片培养及胚珠离体培养

授粉50 d后，摘下尚未成熟的子房，刷洗表面污垢，于自来流水下冲洗1 h左右，在组培台上用75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，放于10%次氯酸钠溶液（NaClO）中不断摇晃5 min，无菌水冲洗5次，置于接种盘上将子房横切为0.3 cm的薄切片；之后接种在子房切片培养基上，培养基配方为1/2 MS+30 g·L^-1蔗糖+0.01 mg·L^-1萘乙酸（NAA）+0.1 mg·L^-1 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+7.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8~6.0。培养25 d后，将膨大胚珠取出放于胚珠离体培养基上，培养基配方为MS+30 g·L^-1蔗糖+0.01 mg·L^-1 NAA+7.5 g·L^-1琼脂，pH值为5.8~6.0。大约2个月后统计胚珠的萌发率，胚珠萌发率（%）=萌发出苗的胚珠数/膨大胚珠数×100。

1.2.4 杂种苗SSR分子标记鉴定

采用SSR分子标记鉴定杂种的真实性，采集杂种苗及其亲本的新鲜幼嫩叶片，并提取DNA。利用周艳萍（2020）筛选发表的百合SSR引物进行PCR扩增。反应体系25.0 μL：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，10 μmol·L^-1上游和下游引物各1.0 μL，补足ddH₂O至25 μL。扩增程序：95℃预变性3 min；95℃15 s，56~63℃ 15 s，72℃ 15 s，进行35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。用2%琼脂糖凝胶电泳筛选出条带稳定清晰、无杂带且多态性较好的引物，加上荧光标记后送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行毛细管电泳检测。

1.2.5 杂交后代枯萎病抗性鉴定

选取直径1.5 cm左右的组培小鳞茎移植到无菌基质中培养7 d，将小鳞茎移入大小一致的装有灭菌基质的花盆中，用直径1 cm的打孔器将尖孢镰刀菌打成菌丝块放入基质中，每5小球为一组，设置3次重复，置于25℃培养箱中培养，培养3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d后分别对病情进行统计。百合尖孢镰刀菌侵染百合鳞茎致病的鉴定方法、病级分级标准抗性评价标准均参考罗建让和谢松林（2015）的方法。枯萎病鳞茎病级分级标准：1级，无症状；2级，茎盘处稍有镰刀菌侵染症状；3级，茎盘已有明显腐烂，外部鳞片易脱落；4级，球茎盘严重腐烂，外部鳞片脱落；5级，球茎盘完全腐烂，鳞片触手即散；6级，种球完全腐烂，无法找到。根据相对抗性指数进行抗性划分，抗性水平及对应的相对抗性指数分别为高抗（病情指数＜0.25）、中抗（0.25≤病情指数＜0.5）、中感（0.5≤病情指数＜0.75）和高感（0.75≤病情指数＜1）。

病情指数的计算公式如下：

各基因型病情指数=∑（病级数×鳞茎个数）/（最高级×总鳞茎数）。

2 结果与分析

2.1 不同百合种及品种枯萎病抗性鉴定

不同百合种及品种枯萎病的病情发展动态及抗性鉴定结果如表1所示，由于观察到第9天时，大部分百合都达到最高感病等级，因此以第7天时的相对抗性指数确定抗性水平。7 d时不同百合种及百合品种枯萎病病情如图2所示。表1和图2结果表明，龙牙百合、‘Tresor’、‘Secret kiss’、‘Pink planet’ 感抗类型为中感； ‘金百合’、 ‘Red county’、‘Peter’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’、新铁炮百合、‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’、‘Magnefique’的感抗类型为中抗；‘Black stone’的感抗类型为高抗。多数感病品种（龙牙百合、‘Secret kiss’、‘Pink planet’）发病早，病情发展迅速，多数抗性品种（‘Black stone’、‘Sorbonne’等）发病晚，病情发展缓慢。

注：数值后不同小写字母表示P＜0.05的显著性水平; HR. 高抗; MR.中抗; MS. 中感。

Note： Different letters indicate P＜0.05 significance level; HR. High resistance; MR. Medium resistance; MS. Medium sensitivity.

2.2 杂交组合的确定及子房膨大率分析

根据不同百合种及品种枯萎病抗性鉴定结果，‘Tresor’、‘Secret kiss’和‘Pink planet’感抗类型为中感，不参与杂交，其余12个观赏百合栽培品种的感抗类型为中抗或高抗，与中感类型的龙牙百合进行杂交，希望能获得枯萎病抗性更强的后代。根据课题组前期花粉萌发率测定结果，‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’的花粉萌发率基本为0，这4个百合品种仅作为母本参与杂交。因此，本研究以龙牙百合为母本，以‘金百合’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’和新铁炮百合为父本进行正交，共7个杂交组合；以‘金百合’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’、新铁炮百合、‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’为母本，以龙牙百合为父本进行反交，共11个杂交组合。

授粉50 d后，以龙牙百合作母本时，所有杂交组合的子房均有膨大，但不同品种间的子房膨大率存在显著差异，其中龙牙百合בStrawberry event’的子房膨大率最高，为26.09%；以‘金百合’、‘Black stone’（图3:A）、‘Peter’3个亚洲百合品种作父本时，子房膨大率在11%~13%之间；以新铁炮百合作父本时，子房膨大率最低，为3.23%（表2）。以龙牙百合作父本时，只有‘Red county’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、新铁炮百合、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’为母本的杂交组合的子房出现膨大，其中以‘Red county’、‘Strawberry event’、‘Brindisi’为母本的杂交组合的子房膨大率较高，均在40%以上，而以‘Black stone’作母本的子房膨大率最低，为2.50%（表3）。

因此，以龙牙百合做母本时，所有杂交组合都存在子房膨大现象，但子房膨大率普遍不高，较高的几个组合均为以亚洲百合品种作父本的杂交组合；以龙牙百合做父本时，只有一部分杂交组合获得了膨大蒴果，但子房膨大率明显高于以龙牙百合做母本的。

2.3 不同杂交组合幼胚萌发率分析

以龙牙百合作母本时，通过子房切片（图3:B）及胚珠离体培养（图3:C），仅有龙牙百合בBlack stone’这一杂交组合中有幼胚萌发，萌发率为12.90%（图3:D；表2）。以龙牙百合作父本时，仅有‘Strawberry event’×龙牙百合有胚珠萌发，萌发率为7.69%（表3）。胚珠经过120 d无菌培养后，共获得龙牙百合בBlack stone’（LYA-1、LYA-2、LYA-3）的3个杂种单株（图3:E）和‘Strawberry event’×龙牙百合（ALY）的1个杂种单株。其他杂交组合所获胚珠均未出现萌发现象。

2.4 杂种苗SSR分子标记鉴定

使用SSR分子标记对杂交后代的真实性进行检测，利用琼脂糖凝胶电泳筛选，得到11对条带清晰、具有多态性的SSR引物，并用这些引物进行毛细管电泳检测（表4）。图4、图5结果表明，LYA-1、LYA-2、LYA-3在引物SB091中同时扩增出了母本和父本的特异性片段，LYA-1、LYA-3在引物MJ014中同时扩增出了母本和父本的特异性片段；图6结果表明，LYA-2、LYA-3在引物XT094中同时扩增出了母本和父本的特异性片段；ALY在11 对引物中均只扩增出了母本的特异性片段。因此，LYA-1、LYA-2、LYA-3均为龙牙百合בBlack stone’的真实杂交后代，而ALY不是‘Strawberry event’× 龙牙百合的杂交后代。

2.5 杂交后代枯萎病抗性鉴定

以亲本为对照，龙牙百合 × ‘Black stone’杂交后代枯萎病的病情发展动态及抗性鉴定结果如表5所示，以30 d时的感病指数确定抗性水平。龙牙百合在接菌培养24 d后1个小鳞茎完全腐烂至无法找见，第30天时3个小鳞茎腐烂至完全找不见，而30 d时其他百合种类均未存在完全腐烂至无法找见的情况，第21天时杂交后代LYA1及亲本小鳞茎生长状况如图7所示。因此，龙牙百合感抗类型为高感，‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3感抗类型为中抗；龙牙百合发病早、病情发展迅速，而‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3病情发展较为缓慢。

3 讨论

3.1 百合种质资源枯萎病抗性评价

为选择枯萎病抗性较强的亲本，本研究采用离体叶片接菌法对收集到的百合种质资源进行枯萎病抗性评价，结果表明亚洲百合杂种系、麝香百合杂种系、麝亚百合杂种系、麝东百合杂种系中大部分品种均具有一定的抗病性，存在高抗及中抗品种，这与杨秀梅等（2012）研究结果一致。杨秀梅等（2012）采用鳞片接种法对36个百合栽培品种及5个野生种进行枯萎病抗性鉴定，发现百合野生种的抗病性较强，亚洲百合杂种系、麝香百合杂种系、麝亚百合杂种系的多数品种对镰刀菌表现为较高的抗性，而东方百合杂种系中大部分品种则表现为较易感染镰刀菌。本研究用离体叶片接菌法鉴定湖南隆回龙牙百合枯萎病抗性结果为中感，但在李润根和程华（2017）的研究中，采用离体叶片接种法进行枯萎病抗性鉴定，其所选用的7个不同产地的龙牙百合种系枯萎病抗性鉴定结果均为高感，而在鳞片接种法中7个龙牙百合枯萎病抗性有所不同，其中‘广西高片’、‘万载柳片’的龙牙百合为中抗，说明不同产地的龙牙百合品系间的枯萎病抗性有所差异。

3.2 龙牙百合远缘杂交技术研究

本研究中，以龙牙百合做母本时，尽管所有杂交组合都存在子房膨大现象，但子房膨大率普遍不高，较高的几个组合都是以亚洲百合品种作父本的杂交组合，以东方百合品种作父本时子房膨大率次之，而麝香百合品种最低。本研究结果表明，龙牙百合与亚洲百合系列的大部分品种亲和性较高，较易获得膨大蒴果实及杂种后代。以龙牙百合做父本时，虽然只有一部分杂交组合获得膨大蒴果，但子房膨大率明显高于以龙牙百合做母本的杂交组合。这说明以龙牙百合作父本进行远缘杂交时，较容易获得膨大果实。尽管本研究获得了较多以龙牙百合作父本的膨大蒴果，但未获得杂种后代，推测可能受限于子房切片、胚珠离体培养的实验技术水平，或是没有选择到合适的时期，从而没能克服受精后障碍获得杂种苗。

注：数值后不同字母表示显著性差异 （P＜0.05）； HS. 高感； MR. 中抗。

Note： Different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05) ; HS. High sensitivity; MR. Medium resistance.

近年来，部分学者对龙牙百合进行了远缘杂交育种的研究，武利可（2020）将龙牙百合与兰州百合进行正交和反交，仅在以龙牙百合为母本、以兰州百合为父本时，获得膨大果实，并获得166株杂种苗。Kim等（2022）将汉森百合与龙牙百合进行正交和反交，仅有以龙牙百合为父本的杂交组合获得了92株杂种苗。本研究将龙牙百合与观赏百合栽培品种进行正交和反交，仅获得龙牙百合בBlack Stone’的3株杂种苗，与上述两位学者的研究结果一致，仅获得单向的杂交后代，这可能与龙牙百合跟其他百合品种进行杂交时容易出现单向杂交不亲和的现象有关。单向杂交不亲和现象在其他百合种及品种的杂交中也较为常见，如尹燕等（2022）将兰州百合与大花卷丹进行正交和反交，仅获得兰州百合×大花卷丹的杂交后代。此外，Wu等（2021）、Kim和Kim（2017）、Kim等（2022）选用龙牙百合进行远缘杂交均获得较多的杂交后代，但本研究获得的杂交后代较少，分析认为，上述学者以龙牙百合为亲本进行杂交的杂交组合较少，但杂交的花朵数都在80朵以上，并选择了切割柱头、混合授粉等多种杂交方式克服远缘杂交障碍，从而获得大量杂交后代。虽然本研究的杂交组合较多，但由于每一杂交组合的花朵数在30朵左右，并且仅采用重复授粉的方式克服远缘杂交障碍，因此通过杂交仅获得3株龙牙百合杂交后代。综上可知，扩大杂交授粉的花朵数量和采用不同授粉方式是克服远缘杂交障碍、增加杂交成功率、获得更多杂交后代的重要方法。

3.3 杂交后代真实性鉴定及枯萎病抗性评价

本研究利用琼脂糖凝胶电泳筛选得到11对条带清晰、具有多态性的SSR引物，并利用SSR分子标记的方法，鉴定出3个龙牙百合בBlack stone’的真实杂交后代，1个‘Strawberry event’×龙牙百合的假杂种，为今后开展SSR分子标记鉴定工作提供了参考。近年来，SSR分子标记已成为百合杂交后代鉴定的一种普遍方法。例如，李卓忆（2019）通过SSR分子标记确定了兰州百合בPrunotto’的15个杂交后代的真实性；舒柯（2022）利用SSR分子标记鉴定确定出卷丹百合בTresor’的2个杂种株系为真杂种。另外，本研究以龙牙百合作父本的杂交组合获得了假杂种，考虑可能是因重复授粉的操作过程中未能包裹好柱头而导致异源花粉污染或自交授粉，胡伟荣（2021）在杂交后代鉴定时也发现了兰州百合בPink flavour’的假杂种，推测有可能是因授粉时花粉污染而导致。

本研究对所获得的3个杂交后代及其亲本进行枯萎病抗性鉴定，‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3的枯萎病抗性为中抗，龙牙百合的枯萎病抗性为高感，本研究通过杂交成功获得了具有一定枯萎病抗性的龙牙百合杂交后代，说明通过远缘杂交进行抗性育种在龙牙百合上切实可行。本研究采用小鳞茎栽培基质接种病原菌方法鉴定出‘Black stone’为中抗、龙牙百合为高感，与离体叶片法鉴定结果有所不同；李润根和程华（2017）通过离体叶片接菌法、鳞片接种法鉴定兰州百合、‘吉安龙牙’等百合的枯萎病抗性时，也出现两种方法鉴定结果不一致的情况；张丽丽等（2012）通过用鳞片接种和离体叶片接种方法进行枯萎病抗性鉴定时，‘Bright’和‘Snow queen’在两种不同方法下的鉴定结果也有差异。对于同种百合在不同方法进行枯萎病鉴定时存在差异的现象，可能是由于枯萎病为土传病害，采用百合的不同部位为实验材料，因此所展现的抗病能力有所不同。

4 结论

本研究将易感枯萎病的龙牙百合与抗枯萎病的观赏百合进行远缘杂交，最终获得了具有枯萎病抗性的龙牙百合杂交后代，为之后培育抗性强、观赏性状优良的赏食兼用百合新品种提供了材料基础。目前，本研究获得的龙牙百合杂种苗仍处于幼龄生长阶段，未能将其与亲本进行观赏性、食用价值等方面的比较，本课题组成员后期将对杂交后代观赏性和食用价值等进一步进行评估，为培育抗性强、高产、优质的食用百合新品种提供材料基础。

参考文献