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蛋白酶抑制剂（protease inhibitor，PI）广泛存在于动物、植物和微生物中，是一类分子量介于5~25 kDa之间的小分子多肽或蛋白质，以二聚体或四聚体的方式存在于生物体中，对于蛋白水解活性的调节至关重要，在代谢和细胞生理学相关的生物学过程中发挥重要作用（Habib &Fazili，2007）。在植物中，蛋白酶抑制剂是贮藏蛋白，也是内源性蛋白调节因子，不仅参与种子萌发和休眠等生理过程，而且参与调节植物对植食性昆虫的抗性（Hörger &van der Hoorn，2013; Singh et al.，2020; Xie et al.，2021）。例如，一些植物蛋白酶抑制剂通过调控昆虫内源蛋白酶活性从而导致细胞程序性死亡，它们也能进入昆虫消化道，与昆虫肠道中消化酶结合，抑制其活性，从而影响昆虫对营养物质的消化吸收，最终干扰昆虫的生长发育（Meekins et al.，2017）。此外，一些蛋白酶抑制剂也能进入昆虫血淋巴，干扰免疫系统（Rahbé et al.，2003）。因此，发掘植物蛋白酶抑制剂基因，解析其生理功能，并将其应用于害虫防治对于发展绿色农业具有重要意义。
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植物中存在多种类型的蛋白酶抑制剂，主要包括丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine proteinase inhibitor）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cysteine proteinase inhibitor）、天冬氨酸蛋白酶抑制剂（aspartic proteinase inhibitor）和金属蛋白酶抑制剂（metallo-proteinase inhibitor）（Laskowski &Kata，1980）。在这些蛋白酶抑制剂中，丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的应用最为广泛。丝氨酸蛋白酶抑制剂是植物最丰富的一类蛋白酶抑制剂（Rustgi et al.，2018），其结构较为复杂，但在功能上非常保守，可以抑制多种丝氨酸蛋白酶的活性和调节植物体内自身的免疫反应，增强植物对昆虫的抗性（Clemente et al.，2019; Benbow et al.，2019; Ferreira et al.，2023）。如Losvik等（2017）发现在大麦（Hordeum vulgare）中过表达丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Barley chymotrypsin inhibitor 2c （CI2c）能显著提高大麦对桃蚜（Myzus persicae）的抗性，进一步研究发现，CI2c基因通过抑制桃蚜消化酶的活性，干扰了其营养吸收和生长，从而显著降低其繁殖力。半胱氨酸蛋白酶抑制剂则通过水解半胱氨酸蛋白酶影响昆虫的正常生长发育，对于鞘翅目昆虫具有较好的抗虫效果。Cingel等（2017）将半胱氨酸蛋白酶抑制剂胱抑素I和Ⅱ（oryzacystatin I和oryzacystatin Ⅱ，OC I和OC Ⅱ）基因转入马铃薯（Solanum tuberosum）中，获得能同时表达这两种蛋白质的马铃薯。进一步生物测定试验显示，取食上述转基因马铃薯的科罗拉多马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）幼虫发育速度减慢，体重降低，死亡率升高。
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水稻（Oryza sativa）是全球重要的粮食作物之一，水稻的稳产对于全球粮食生产至关重要。然而，水稻在生长过程中常常受到各种害虫的为害，导致产量和品质下降（Lou et al.，2013）。当前我国水稻害虫防治主要依赖化学杀虫剂，不仅危害人类健康，还会导致环境污染、农副产品中农药残留量超标和害虫抗药性增加等（Mao et al.，2019）。因此，发展绿色防控手段对于水稻害虫综合治理具有重要意义。发掘抗虫基因，培育和种植抗虫水稻品种是水稻害虫防治的重点，植物蛋白酶抑制剂基因的发掘和利用是其中一个重要研究方向。譬如，丝氨酸蛋白酶抑制剂在水稻抵御二化螟（Chilo suppressalis）、稻纵卷叶螟（Cnaphalocrocis medinalis）及稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等病虫害中发挥了重要作用（Zhang et al.，2020; Liu et al.，2021; 张娜等，2022）。转基因水稻超量表达胰蛋白酶抑制剂基因AvrPiz-t interacting protein 4（APIP4）可增强对二化螟和稻瘟病菌的抗性（Zhang et al.，2020; Liu et al.，2021）。也有研究显示转入外源蛋白酶抑制剂基因可增强植物对病虫害抗性，如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（cowpea trypsin inhibitor，CpTI）是一种广谱抗虫基因，向水稻中转入CpTI基因可对多种水稻害虫产生较强的抗性（Xu et al.，1996）。转基因水稻表达大麦胰蛋白酶抑制剂CMe基因显著提高了对米象（Sitophilus oryzae）的抗性，进一步研究发现，转基因水稻中表达的胰蛋白酶抑制剂CMe降低了米象肠道胰蛋白酶的活性，从而抑制米象的生长和发育（Alfonso-Rubí et al.，2003）。因此，发掘新的蛋白酶抑制剂基因对于水稻害虫绿色防控具有重要价值。
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前期转录组测序结果表明，二化螟和褐飞虱（Nilaparvata lugens）为害均可诱导水稻蛋白酶抑制剂基因（Oryza sativa chymotrypsin protease inhibitor 2，OCPI2）上调表达，推测该基因在水稻抵御上述害虫中发挥了重要作用（Liu et al.，2016，2021）。本研究以水稻品种‘中花11’（‘Zhonghua11’，‘ZH11’）为材料，通过基因克隆的方法对OCPI2基因编码区进行克隆，利用生物信息学软件对该基因进行生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR技术分析了OCPI2基因的诱导表达特征，拟探讨以下问题：（1）OCPI2基因编码区序列及其在不同水稻品种中序列是否一致；（2）OCPI2基因编码蛋白的理化性质、结构特征、所属家族以及物种间蛋白序列同源性和进化关系；（3）OCPI2基因在不同昆虫（二化螟和褐飞虱）、机械损伤处理和不同植物激素（水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯）处理后的表达特征，以期为深入解析OCPI2在水稻抗虫中的功能奠定基础。
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1 材料与方法
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1.1 供试水稻
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本研究以水稻品种‘ZH11’和‘台中1号’（‘TN1’）为试验材料，‘ZH11’用于试验处理，‘TN1’用于饲养褐飞虱。将颗粒饱满的水稻种子浸泡于清水中，置于37℃恒温箱。待浸泡种子露白后，将其以浸湿毛巾包裹，并继续置于37℃恒温箱中，待其根和芽露出后种植于灭菌营养土中。培养条件：温度（30 ± 2）℃、光周期16 L（光）∶8 D（暗）、相对湿度（75 ± 10）%，生长至40 d，取长势及状态相似的水稻植株用于试验。
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1.2 供试昆虫
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二化螟和褐飞虱用于本试验。二化螟采用茭白饲养至化蛹，羽化后饲以20%的蜂蜜水。饲养条件：温度（28 ± 2）℃、光周期16 L∶8 D、相对湿度（75 ± 10）%。褐飞虱以40 d左右‘TN1’水稻苗饲养，饲养条件：温度（26 ± 2）℃、光周期16 L∶8 D、相对湿度（60 ± 10）%。
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1.3 水稻处理
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1.3.1 二化螟为害处理
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采用透明塑料筒（直径为1.5 cm，高为7 cm）套在水稻茎秆基部，上下用海绵封住后置于培养箱中放置3 d，消除套管对水稻造成的机械损伤。将提前饥饿处理2 h的3龄二化螟幼虫接入透明管内的水稻茎秆上，并观察幼虫钻蛀行为，至二化螟幼虫身体一半钻入水稻茎秆后开始计时。在二化螟为害水稻不同时间（0、1、2、4、8、12、24、48 h）后，剪取虫害部位水稻茎秆，立即浸入液氮速冻，然后置于-80℃超低温冰箱中保存。以套筒后未接虫的‘ZH11’水稻相同部位茎秆作为对照，每个处理设置3次生物学重复。
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1.3.2 褐飞虱为害处理
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提前3 d在水稻植株基部套上透明塑料筒（见1.3.1），在筒内接入15头褐飞虱4龄若虫，放入后开始计时。在褐飞虱为害不同时间（0、1、2、4、8、12、24、48 h）后，剪取为害部位水稻茎秆，立即浸入液氮速冻，然后置于-80℃超低温冰箱中保存。以套筒后未接入褐飞虱的‘ZH11’水稻相同部位茎秆作为对照，每个处理设置3次生物学重复。
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1.3.3 机械损伤处理
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在靠近水稻茎秆基部2~3 cm处的两侧，用昆虫针（针尖直径0.32 mm）少力均匀地刺100次。在损伤后不同时间点（0、1、2、4、8、12、24、48 h），剪取水稻损伤部位茎秆，立即浸入液氮速冻，然后置于-80℃超低温冰箱中保存。以相同条件下未经昆虫针刺的‘ZH11’水稻相同部位茎秆作为对照，每个处理设置3次生物学重复。
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1.3.4 植物激素处理
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使用pH=8.0的50 mmol·L-1磷酸缓冲液将水杨酸甲酯（美国Sigma公司）和茉莉酸甲酯（美国Sigma公司）分别配制成终浓度为70 μg·mL-1和100 μg·mL-1 的溶液，喷洒前分别加入终体积为0.01%的吐温20。在40 d苗龄的‘ZH11’水稻整株均匀喷洒2 mL上述水杨酸甲酯或者茉莉酸甲酯溶液。分别在处理0、1、2、4、8、12、24、48 h后剪取水稻茎秆，立即浸入液氮速冻，然后置于-80℃超低温冰箱中保存。以相同条件下喷洒2 mL的50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 8.0）的水稻茎秆作为对照，每个处理设置3次生物学重复。
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1.4 总RNA提取及cDNA合成
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水稻茎秆组织采用液氮研磨处理后，取100 mg样品用于提取总RNA，参照RNAiso Plus（TaKaRa）说明书进行。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳检测确认无降解后，用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，USA）检测其浓度和纯度。以1 μg总RNA为模板，参照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）试剂盒说明书合成cDNA。该反应采用20 μL反应体系，分两步进行：第一，去除基因组DNA；第二，再反转录成cDNA。具体包括以下步骤，第一步反应：1 μg总RNA，2 μL 5 × gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，加RNase Free dH2O至10 μL。反应条件：42℃，2 min，4℃终止反应。第二步反应：第一步反应液10 μL，1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，4 μL 5 × PrimeScript Buffer 2（for Real Time），加RNase Free dH2O至总体积20 μL。反应条件：37℃ 15 min，85℃ 50 s终止反应。试验全程在超净工作台上完成，使用耗材均为RNase Free，反应液的配置均在冰上完成，合成的cDNA保存于-20℃冰箱用于后续试验。
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1.5 水稻OCPI2基因克隆与序列分析
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根据水稻基因组数据库（Rice Genome Annotation Project，RGAP）报道的‘日本晴’（Oryza sativa spp. japonica）OCPI2基因（LOC_Os01g42860）序列，用Primer 5软件设计包含该基因全部CDS的上下游引物，引物序列见表1，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以二化螟幼虫为害24 h的‘ZH11’水稻茎秆cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，经切胶回收后连接于pMD-18T载体（TaKaRa），连接产物转入感受态大肠杆菌，并涂布到含有氨苄青霉素（Amp）的抗性平板上培养过夜，挑取单菌落进行菌液PCR验证，最后将PCR验证正确的菌液送至武汉禾泰青生物公司测序。利用Jalview软件将测序结果与‘日本晴’OCPI2基因序列进行比对。使用在线软件ExPASy（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）预测OCPI2蛋白分子量、理论等电点等理化特性，分别使用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测OCPI2蛋白的信号肽和TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测OCPI2蛋白的跨膜结构，以及使用Conserved Domain Search Service（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对OCPI2蛋白进行结构域预测。
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1.6 同源序列比对和系统发育分析
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利用NCBI数据库Blastp工具获取其他禾本科植物同源基因氨基酸序列，分别使用Jalview和MEGA 11软件进行同源序列比对和系统发育树构建，系统发育树构建采用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），Bootstrap值设置为1 000次。
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1.7 实时荧光定量PCR
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利用CFX96型实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）检测OCPI2在不同处理下的表达。采用Primer 5软件设计OCPI2基因特异性定量引物，引物序列见表1，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。参照2X M5 HiPer SYBR Premix Es Taq（聚合美）说明书，选择10 μL的PCR反应体系，包括5 μL的SYBR，2 μL的cDNA模板，0.4 μL的引物（混合）和2.6 μL的ddH2O。实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性60 s；95℃变性10 s，60℃退火60 s，40个循环。以水稻18S ribosomal RNA（Os18s，AK059783）基因作为内参，目标基因相对表达量采用2-△△Ct法进行计算。
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1.8 数据处理与分析
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采用Student t检验（Student’s t-test）分析OCPI2在害虫为害、机械损伤以及激素处理响应下的表达量。所有数据均采用SPSS 22.0软件进行统计分析。
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2 结果与分析
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2.1 水稻OCPI2基因的克隆与分析
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以二化螟幼虫为害24 h的‘ZH11’水稻茎秆cDNA为模板，利用OCPI2基因特异性引物进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在300~400 bp处出现扩增条带（图1）。
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图1 水稻OCPI2基因PCR扩增
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Fig.1 PCR amplification of OCPI2 of Oryza sativa
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将纯化的PCR产物连接至pMD18-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序。测序结果表明，PCR扩增序列长度为342 bp，其中包含OCPI2基因的完整CDS序列，长度为219 bp。与RGAP数据库中‘日本晴’的OCPI2基因（LOC_Os01g42860）CDS序列进行比对分析，结果表明‘ZH11’与‘日本晴’OCPI2基因的CDS序列完全一致（图2）。
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利用ProtParam对OCPI2基因编码氨基酸序列进行分析，发现OCPI2基因编码72个氨基酸，预测蛋白分子量为7.72 kDa，理论等电点为5.21。通过SignalP 5.0预测分析OCPI2氨基酸序列，发现不含有信号肽（图3：A），说明OCPI2可能为非分泌型蛋白；运用在线软件TMHMM Server 2.0对OCPI2编码蛋白的跨膜结构进行预测分析，结果显示该蛋白不存在跨膜结构（图3：B）。利用NCBI网站保守结构域分析工具对OCPI2基因编码氨基酸进行保守结构域分析，发现其具有一个potato_inhibit保守结构域（图3：C），通过查询保守结构域数据库和相关文献发现该基因属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员（Volpicella et al.，2011; Wang et al.，2023）。
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2.2 OCPI2的同源性及系统发育分析
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为了探究OCPI2蛋白的进化关系，将8种禾本科植物CPI蛋白与OCPI2蛋白进行同源性分析及系统发育树构建，包括柳枝稷（Panicum virgatum，XP_039836276.1）、硬直黑麦草（Lolium rigidum，XP_047070641.1）、二粒小麦（Triticum dicoccoides，XP_037471069.1）、乌拉尔图小麦（T. urartu，EMS61613.1）、非洲栽培稻（Oryza glaberrima，XP_052139272.1）、黑麦草（Lolium perenne，XP_051224251.1）、玉米（Zea mays，NP_001232814.2）、南荻（Miscanthus lutarioriparius，CAD6334936.1），利用Jalview和MEGA 11软件作图。结果表明，在9个物种中均含有一个potato_inhibit保守结构域且CPI蛋白在不同物种之间同源性较高（图4：A）；系统发育分析结果显示，OCPI2蛋白与乌拉尔图小麦、硬直黑麦草、二粒小麦和黑麦草的同源蛋白亲缘关系较近，与玉米、非洲栽培稻、柳枝稷和南荻的亲缘关系相对较远（图4：B）。
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2.3 OCPI2基因受虫害诱导的表达分析
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为探究植食性昆虫为害对OCPI2表达的影响，通过实时荧光定量PCR技术分析OCPI2受二化螟和褐飞虱取食为害诱导情况。单头3龄二化螟幼虫为害水稻后的24 h内，OCPI2的表达量在2 h和8 h有两个高峰期，与对照均存在显著差异，分别是对照的3.1倍和3.8倍（图5：A）。在虫害48 h后，OCPI2表达显著升高，是对照的30.6倍。15头4龄褐飞虱若虫为害时，OCPI2的表达量在1 h时迅速升高并达到峰值，是对照的6.7倍，之后表达量开始下降，在8 h时表达量下降到正常水平，持续为害的表达量会继续呈现出先升高再下降的表达趋势，除8 h外，在虫害后其余时间点OCPI2表达量与对照组均存在显著性差异（图5：B）。上述结果表明，二化螟和褐飞虱为害均能诱导水稻OCPI2的表达，但二者诱导表达趋势并不相同，推测OCPI2可能参与水稻对二化螟和褐飞虱的抗性。
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图2 ‘ZH11’与‘日本晴’OCPI2核苷酸序列比对
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Fig.2 Nucleotide sequence alignment of OCPI2 in ‘ZH11’ and Oryza sativa spp. japonica
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图3 水稻OCPI2基因编码蛋白的生物信息学分析
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Fig.3 Bioinformatics analysis of protein encoded by OCPI2 gene of Oryza sativa
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2.4 OCPI2基因受机械损伤处理的表达分析
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机械损伤处理水稻后，OCPI2的表达量在处理后1 h时显著增加，为对照的29.1倍；处理后2 h开始降低并在4 h恢复到正常水平，之后呈现出先升高再降低再升高的小范围表达量波动（图6）。
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2.5 OCPI2基因受外源植物激素处理的表达分析
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经水杨酸甲酯处理后，OCPI2表达量在1 h内显著升高，达到对照组的12.6倍，2 h时恢复到正常水平，之后表达量与对照相比没有显著差异（图7：A）。而经茉莉酸甲酯处理后，OCPI2在1 h时与对照组相比呈现出下调的趋势，2 h时呈现出极显著的下调趋势，之后与对照组相比一直呈现下调趋势，直至12 h时恢复到与对照相似的表达水平，之后表达量在24 h又呈现显著性下降直至48 h时也未恢复至正常水平（图7：B）。这些结果表明，外源水杨酸甲酯可以诱导OCPI2表达，而外源茉莉酸甲酯处理则抑制水稻OCPI2表达。
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图4 OCPI2与8个同源蛋白的序列比对及系统发育分析
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Fig.4 Sequence alignment and phylogenetic analysis of OCPI2 with eight orthologs
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3 讨论与结论
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蛋白酶抑制剂是植物体内重要的防御蛋白，当植物受到植食性昆虫为害时，会迅速合成蛋白酶抑制剂，以抵御昆虫取食（Volpicella et al.，2011）。利用基因工程技术，将编码蛋白酶抑制剂基因导入农作物中，培育出具有抗虫效果的转基因作物，可以有效控制农田害虫的发生。水稻是重要的粮食作物，常遭受二化螟和褐飞虱等多种害虫为害。因此，研究水稻蛋白酶抑制剂基因及其介导的抗虫机理对水稻生产具有重要意义。
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本研究成功从水稻中克隆并获得OCPI2基因cDNA序列，序列分析表明该基因编码区全长为219 bp，编码72个氨基酸，含有1个potato_inhibit结构域，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员。众多研究表明，植物丝氨酸蛋白酶抑制剂主要通过调节丝氨酸蛋白酶活性进而调节植物抗虫反应。如大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk Inhibitor，SBBI）可延迟瓜实蝇（Bactrocera cucurbitae）的生长发育（Kaur et al.，2017），取食光海红豆（Adenanthera pavonine）的胰蛋白酶抑制剂（Adenanthera pavonina trypsin inhibitor，ApTI）会导致大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）幼虫死亡率升高（Meriño et al.，2020）。因此，推测OCPI2在水稻的抗虫防御反应中发挥重要作用。
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诱导表达特征的结果显示，二化螟和褐飞虱取食以及机械损伤均能诱导OCPI2基因的表达。其中，机械损伤处理的响应模式与刺吸式口器昆虫褐飞虱为害的响应模式较为类似，但机械损伤造成的响应更加强烈。本研究机械损伤是采用昆虫针刺伤进行样品处理，其造成的伤口与褐飞虱取食所造成的伤口类似，但机械损伤造成的伤害更为严重且密集，因此OCPI2对其响应更为强烈。同样的，Singh等（2009）报道机械损伤诱导OCPI2表达，同时还发现脱落酸、低温和盐胁迫均可诱导该基因表达。然而，对其他水稻蛋白酶抑制剂基因诱导表达模式研究发现，OsLTPL164和OsLTPL151在二化螟取食和机械损伤处理不同时间后，两个基因均呈现表达水平先上升后下降再上升的趋势，但二化螟取食3 h后便可诱导OsLTPL164和OsLTPL151上调表达，而在机械损伤6 h后才被显著诱导表达（何雨娟等，2018）。咀嚼式口器昆虫二化螟为害诱导后OCPI2的最高响应强度虽高于褐飞虱诱导处理，但其响应速度和响应时间没有褐飞虱诱导处理迅速和持久。类似的，舞毒蛾（Lymantria dispar）和灯蛾（Amata mogadorensis）幼虫及柳弗叶甲（Phratora vulgatissima）成虫为害诱导黑杨（Populus nigra）Kunitz型胰蛋白抑制剂基因同样呈现不同的表达模式，其中舞毒蛾和灯蛾幼虫取食诱导表达模式相似，而柳弗叶甲成虫则诱导蛋白酶抑制剂基因表达更强烈（Eberl et al.，2021）。这些结果表明，不同植食性昆虫为害诱导蛋白酶抑制剂基因呈现不同的表达特征，并且昆虫取食与机械损伤诱导OCPI2基因的表达也存在明显不同。昆虫取食过程中不仅对植株造成机械损伤，还会分泌唾液。唾液中含有的激发子或效应子也会诱导植物产生不同的防御反应（Jones et al.，2022; 刘清松等，2023）。
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图5 虫害诱导后OCPI2基因的相对表达量
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Fig.5 Relative expression levels of OCPI2 gene after insect pest feeding
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图6 机械损伤下OCPI2基因的相对表达量
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Fig.6 Relative expression levels of OCPI2 gene under mechanical wounding
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图7 不同激素处理下OCPI2基因的相对表达量
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Fig.7 Relative expression levels of OCPI2 gene under different hormone treatments
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茉莉酸（jasmonic acid，JA）和水杨酸（salicylic acid，SA）作为重要的内源激素，调控植物对多种植食性昆虫防御反应（Erb &Reymond，2019；Liu et al.，2021）。例如，JA途径正调控水稻对二化螟和褐飞虱的抗性（Xu et al.，2021）；SA途径也参与调控水稻对褐飞虱的抗性（Guo et al.，2018）；在水稻中，研究报道外源JA诱导胰蛋白酶抑制剂基因合成和蛋白酶抑制剂的积累（Farmer et al.，1992）。然而本研究结果表明，水杨酸甲酯处理可在短时间内迅速诱导OCPI2表达，而茉莉酸甲酯处理则持续抑制OCPI2表达。这表明JA和SA拮抗调控OCPI2表达，与前人结果一致，即JA和SA信号途径存在相互拮抗作用，JA途径抑制SA途径介导的防御反应，反之亦然。例如，在拟南芥中同时采用SA和JA处理，发现SA可以拮抗JA的生物合成和信号传导（de Vleesschauwer et al.，2014）。尽管如此，但有一些研究发现JA和SA信号通路可以协同调控植物对植食性昆虫抗性（Liu et al.，2021）。因此，在调控水稻的抗虫反应中，JA和SA并非独立作用于植物，二者间的相互拮抗作用或协同作用更能有效抵御植食性昆虫取食。然而，其他植物激素是否作用于OCPI2仍有待研究。
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综上所述，本研究成功克隆水稻丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OCPI2的全部编码区序列，采用生物信息学技术分析了其编码酶的理化特性及其进化关系，并分析了植食性昆虫取食为害、机械损伤和激素处理对其转录水平的影响。本研究结果表明，OCPI2参与水稻诱导抗虫防御反应，但具体作用机制还有待进一步研究。
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摘要
为探究蛋白酶抑制剂基因在水稻抵御植食性昆虫为害中的功能，该研究以水稻品种‘中花11’为材料，克隆了水稻丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OCPI2编码区序列，并通过生物信息学软件对其序列特征进行了分析和系统发育树的构建，同时采用实时荧光定量PCR技术探究了该基因在植食性昆虫取食和植物激素诱导下的表达特征。结果表明：（1）水稻OCPI2基因编码区序列全长219 bp，编码72个氨基酸，预测蛋白分子量为7.72 kDa，理论等电点为5.21，不含信号肽，无跨膜结构。（2）OCPI2蛋白与乌拉尔图小麦(Triticum urartu, EMS61613.1)同源蛋白亲缘关系较近。（3）OCPI2基因具有1个potato_inhibit保守结构域，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。（4）二化螟和褐飞虱取食、机械损伤以及水杨酸甲酯处理均能诱导OCPI2基因的表达，茉莉酸甲酯处理则持续抑制OCPI2基因表达。以上研究结果表明，OCPI2基因可能参与了水稻对植食性昆虫的诱导防御反应，为深入研究OCPI2基因在水稻抗虫防御反应中的功能提供理论依据。
Abstract
To investigate the function of protease inhibitor genes in rice defense against herbivorous insects, the coding sequence of the protease gene OCPI2 from the rice variety ‘Zhonghua 11’ was cloned. The sequence characteristics of OCPI2 gene were analyzed, and a phylogenetic tree was constructed using bioinformatics software. Real-time quantitative PCR was utilized to examine the expression characteristics of OCPI2 gene under herbivorous insect feeding and plant hormone treatment. The results were as follows: (1) The coding region of OCPI2 gene was 219 bp, encoding a protein of 72 amino acids. The OCPI2 protein had a molecular weight of 7.72 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.21, with no signal peptide and no transmembrane structure. (2) The OCPI2 protein was closely related to the homologous protein in Triticum urartu (EMS61613.1). (3) The OCPI2 gene contained a potato_inhibit conserved domain and belonged to the serine protease inhibitor family. (4) The expression of OCPI2 gene was induced by feeding from the rice striped stem borer (Chilo suppressalis) and the brown planthopper (Nilaparvata lugens), mechanical wounding, and methyl salicylate treatment, whereas methyl jasmonate treatment consistently suppressed OCPI2 gene expression. Taken together, these results suggest that OCPI2 gene may be involved in the induced defense response of rice to herbivorous insects. This study provides a theoretical reference for a deeper understanding of the function of OCPI2 gene in rice defense against insect herbivores.
Keywords
rice ； protease inhibitor ； OCPI2 ； gene cloning ； induced expression signature
