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葡萄是世界性的重要果树之一，也是继拟南芥、水稻、杨树之后完成全基因测序的第4种开花植物（杨光等，2010），具有非常强的季节性，即具有明显的生长期和休眠期（刘芳，2018）。休眠是植物生长发育过程中的一个暂停现象，是一种有益的生物学特性，是植物长期演化获得的一种适应环境条件及季节性变化的特性，其中芽休眠是最为常见的休眠方式（闵卓和房玉林，2016）。葡萄作为一种典型的落叶果树，休眠是葡萄生长发育过程中不可逾越的重要阶段，随着我国北方葡萄设施栽培面积的不断扩大，低温不足造成葡萄休眠期延长而推迟成熟造成萌芽不整齐、产量下降等突出问题。此外，随着葡萄市场竞争加大，促进葡萄打破休眠、提早萌芽，是目前葡萄栽培产业中亟待解决的一项关键技术问题（谭一婷等，2021）。单氰胺（cyanamide）是一种氰氨类化学试剂，近年来常常被用于打破葡萄休眠，起到促进葡萄芽提早萌发和发育整齐的作用，特别是应用于冬季低温积累量不足且湿度大的地区（Sudawan et al.，2016；Wang et al.，2016；牛歆雨等，2018），然而对单氰胺打破葡萄休眠的机制还有待进一步探讨。
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CBF（C-repeat Binding Factor）和FT（Flowering locus T）基因广泛存在于不同的植物中，并参与植物的生长发育、抗非生物逆境胁迫等多个阶段。FT是磷脂酸乙醇胺结合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）家族成员，具有保守的PEBP结构域（Hanano &Goto，2011），是光周期途径植物决定开花时间的关键基因（杨光等，2010），具有季节性变化（王云梦等，2022），在成花转变和生殖器官的发育过程中发挥重要作用（陈仲等，2011）。另外，FT基因在储藏器官发育（Navarro et al.，2015）、腋芽形成（Hiraola et al.，2013）、气孔开闭（Kinoshita et al.，2011）、植物及种子休眠（Carmona et al.，2007；Vergara et al.，2016）等方面也发挥重要作用。CBF属于AP2/ERF（APETALA2/ethylene response protein）类家族，能够与启动子中的核心片段相结合从而调控相关基因的转录水平，目前CBF被证明是植物抗冷途径的主要枢纽，通过调控下游大量抗冷基因的表达，增强植物的抗冷能力（吕胜男等，2011；赵峻丽等，2020）。另外，CBF还在干旱、高盐、极端高温等非生物胁迫方面起重要作用（Chen et al.，2016），以及还参与植物的生长（赵涛，2013）和休眠（Wisniewski et al.，2011）等过程，但目前CBF在植物休眠方面的研究较少。Wisniewski等（2011）将桃子CBF转录因子转至苹果中异位表达，首次发现该基因过表达导致短日照诱导的休眠；Saito等（2015）研究发现CBF可以调控休眠相关MADS-box（Dormancy-associated MADS-box，DAM）基因，从而影响植物的休眠，并且FT基因也参与此过程。综上所述， CBF与FT基因均对植物休眠起到重要作用（Carmona et al.，2007；Wisniewski et al.，2011；Saito et al.，2015；Vergara et al.，2016），并且联系紧密，但其是否也参与到单氰胺破除葡萄休眠这一过程中，值得深入探讨。
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‘水晶’葡萄（Vitis vinifera×V. labrusca‘Shuijing’）原产于美洲，成熟后呈黄绿色，具有肉厚多汁、含糖量高、适口性好及可溶性固形物较高等特点且有较高的营养价值（田竹希等，2021）。单氰胺常作为‘水晶’葡萄的破眠剂，促进葡萄提前萌芽，CBF和FT作为植物打破休眠过程中重要的调控因子，还未见其基因序列及蛋白功能在‘水晶’葡萄植物中被报道，因此本研究以‘水晶’葡萄为材料，进行单氰胺处理后，通过RT-PCR技术克隆获得参与‘水晶’葡萄芽休眠的CBF与FT基因cDNA全序列，并利用实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）技术对其进行表达量分析，以及结合喷施单氰胺后‘水晶’葡萄芽内过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和H2O2含量及氧自由基产生速率的测定分析，探讨单氰胺打破‘水晶’葡萄芽休眠的分子和生理生化机制，为解析单氰胺打破葡萄休眠的机理并进一步指导单氰胺的应用奠定理论基础。本研究旨在探讨以下问题：（1）VvFT1、VvFT2和VvCBF 蛋白理化性质、结构及物种间的进化关系；（2）单氰胺破除葡萄休眠过程中VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的表达模式变化；（3）单氰胺破除葡萄休眠过程中CAT、POD和SOD活性变化，MDA和H2O2含量变化及氧自由基产生速率变化。
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1 材料与方法
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1.1 材料与试剂
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‘水晶’葡萄来源于云南省弥勒市东风农场管理局的生长状况健康、一致的冬剪枝条，利用清水进行葡萄枝条扦插，每3 d对其喷施一次2.5%单氰胺（刘芳，2018；邱栋梁等，2022），以喷施清水作为对照（CK），分别在第0、第7、第14、第21、第28 天取‘水晶’葡萄芽立即利用液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱中保存。TPIzol提取液和DL 2 000 DNA Marker均购自宝日医生物技术（北京）有限公司。
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1.2 生理指标的测定
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利用双组分光光度法和硫酸钛-浓氨水显色法分别进行MDA和H2O2含量的测定，利用盐酸羟胺法进行氧自由基产生速率的测定，利用氮蓝四唑法、愈创木酚法和紫外吸收法分别进行SOD、POD和CAT活性的测定（邹琦，2000；高俊凤，2006；张志良等，2009）。
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1.3 葡萄芽总RNA的提取和cDNA的合成
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取‘水晶’葡萄芽于研钵中，加入适量液氮研磨成粉末后，取葡萄芽粉末迅速转移至2.0 mL灭菌离心管中，加入1 mL TPIzol提取液上下轻柔混匀后，加入200 μL氯仿于室温放置5 min，12 000 r·min-1、4℃条件下离心10 min；取上清液于1.5 mL灭菌离心管中，加入500 μL异丙醇后混匀，12 000 r·min-1、4℃条件下离心10 min，倒去滤液；加入1 mL 75%乙醇，用移液枪轻柔吹洗数下后倒去乙醇（该步骤重复2次），室温下放置2~3 min，风干沉淀，加DEPC水100 μL溶解RNA，用移液枪轻柔吹洗混匀，置于-80℃备用。cDNA第1链使用TaKaRa公司的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行逆转录合成，方法参照说明书，获得的cDNA马上进行后续PCR扩增或置于-80℃备用。
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1.4 VvFTs和VvCBF全长cDNA克隆
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以GenBank中多个FT（GenBank：JN214350.1、KP099711.1、JN214351.1、KF881011.1）和CBF（GenBank：HQ908653.1、JX464665.1、XM_021947969.1、KU587043.1） 同源基因序列进行比对，使用Premier 5.0设计引物并由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，相关引物碱基序列见表1。使用高保真酶PrimeSTAR HS® DNA Polymerase 进行PCR扩增，扩增体系（50 μL）：10 μL的5× PrimeSTAR Buffer（Mg2+ Plus），4 μL的dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each），0.5 μL的 PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U·μL-1），正向引物（F）和反向引物（R）各1 μL，2 μL的cDNA，31.5 μL的灭菌蒸馏水。PCR扩增条件：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，58℃复性10 s，72℃延伸60 s，30个循环；最后72℃延伸2 min。扩增结束后，PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上点样进行电泳检测，切胶回收获得的目的条带，利用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®试剂盒在目的条带3′端添加A碱基后，连接pMD20-T vector载体，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑出阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，最终获得2个‘水晶’葡萄FT基因，分别命名为VvFT1和VvFT2，获得‘水晶’葡萄CBF基因1个，命名为VvCBF。
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1.5 VvFT1、VvFT2和VvCBF基因生物信息学分析
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利用DNAMAN 8进行碱基序列的比对和蛋白质序列翻译；使用ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）进行蛋白质分子量和理论等电点分析；使用GOR4（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）和NetSurfP3.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetSurfP-3.0/）在线工具预测蛋白二级结构；使用SWISS-MODEL（http://www.swissmodel.expasy.org/interactive）进行蛋白质三级结构在线预测；使用NCBI中的CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）数据库对蛋白的保守结构域进行分析；使用MEGA-X软件，采用相邻连接方法（Neighbor-Joining，NJ）、Poisson模型、Complete deletion模式建树，Bootstrap值取1 000，进行系统进化树构建。
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1.6 VvFT1、VvFT2和VvCBF基因qRT-PCR检测
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用PrimeScriptTM RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒进行第1链cDNA的逆转录合成后，再使用TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）进行 qRT-PCR 反应，操作方法参照说明书。以UBQ基因作为内参基因（张永福等，2022），对单氰胺诱导后的‘水晶’葡萄芽的VvFT1、VvFT2和VvCBF基因进行qRT-PCR检测，引物序列见表1。
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2 结果与分析
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2.1 单氰胺喷施后‘水晶’葡萄芽中MDA、SOD、POD、CAT、H2O2和氧自由基产生速率变化
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MDA、SOD、POD、CAT、H2O2和氧自由基产生速率生理生化指标是芽萌发的重要指标，在芽萌发的过程中起到重要作用。本研究对单氰胺处理‘水晶’葡萄芽后分别在第0、第7、第14、第21、第28天进行生理生化指标的测定（图1）。由图1可知，单氰胺处理后葡萄芽的MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、H2O2含量和氧自由基产生速率均在不同时期得到提升。其中，单氰胺处理后葡萄芽的MDA含量、H2O2含量和氧自由基产生速率在第0、第7、第14、第21、第28天呈先上升后降低的趋势；但是未处理单氰胺的条件（对照，CK）下，MDA含量、H2O2含量和氧自由基产生速率在第0、第7、第14、第21、第28天呈上升趋势。单氰胺处理下，葡萄芽内MDA含量在第21天最高，H2O2含量在第7天最高，氧自由基产生速率则在第14天最高。但值得注意的是，单氰胺处理后的MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性、H2O2含量和氧自由基产生速率在第7、第14、第21、第28天均较CK高。单氰胺喷施后MDA含量在第7、第14、第21、第28天较CK分别提高了98.20%、96.22%、96.05%和47.29%（图1：A）；SOD和POD可通过分解活性氧来防止膜脂被氧化破坏，其活性与防止膜脂被氧化破坏的能力呈正相关，SOD活性在第7、第14、第21、第28天较CK分别提高了23.51%、49.73%、45.80%和52.78%（图1：B），POD活性在第7、第14、第21、第28天较CK分别提高了59.34%、41.03%、40.55%和43.00%（图1：C）；CAT活性在第7、第14、第21、第28天较CK分别提高了80.86%、136.18%、115.21%和100.65%（图1：D）；H2O2含量在第7、第14、第21、第28天较CK分别提高了67.51%、31.31%、20.88%和26.51%（图1：E）；氧自由基产生速率在第7、第14、第21、第28天较CK分别提高了149.48%、161.41%、80.39%和6.13%（图1：F）。可见，可通过喷施单氰胺诱导葡萄芽的MDA、SOD、POD、CAT、H2O2和氧自由基产生速率的生理生化反应从而使葡萄打破休眠，提前萌发，在单氰胺喷施‘水晶’葡萄后第28天葡萄芽生长明显较CK长（图2）。
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2.2 葡萄VvFT1、VvFT2和VvCBF基因全长cDNA克隆
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为探明单氰胺破除‘水晶’葡萄休眠的分子机制，本研究以单氰胺处理‘水晶’葡萄后第28天的葡萄芽作为材料提取其总RNA，逆转录后获得其cDNA为模板，用特异性引物进行VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的扩增。VvFT1和VvFT2扩增出的大小约为500 bp，VvCBF扩增出的大小约为800 bp，均与目标基因大小一致（图3）。将VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的克隆进行测序，最终获得VvFT1和VvFT2的基因序列为525 bp，VvCBF基因序列为826 bp，通过DNAMAN 8.0分析得出VvFT1和VvFT2基因编码174个氨基酸（aa），VvCBF基因在第712至第715核苷酸为终止密码子，因此VvCBF基因编码237 aa。
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2.3 VvFT1和VvFT2氨基酸序列的理化性质、蛋白结构预测、进化树及其氨基酸保守结构域分析
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2.3.1 VvFT1和VvFT2氨基酸序列的理化性质和蛋白结构预测分析
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利用ProtParam tool在线工具对VvFT1和VvFT2基因的多肽链氨基酸数目、分子式、等电点、相对分子量等进行预测。VvFT1基因共编码174 aa，分子式为C874H1359N247O256S4，分子质量为19.55 kDa，理论等电点（pI）为8.81，含2 740个原子；VvFT2基因共编码174 aa，分子式为C856H1335N245O263S6，分子质量为19.46 kDa，pI为6.11，含2 705个原子。利用GOR4和NetSurfP 3.0 在线分析软件对VvFT1和VvFT2基因编码的蛋白进行二级结构预测分析，结果显示在组成VvFT1蛋白的174个氨基酸中，无规则卷曲占62.64%、α-螺旋占9.77%、折叠延伸链占27.59%（图4：A）；在组成VvFT2蛋白的174个氨基酸中，无规则卷曲占70.11%、α-螺旋占2.30%、折叠延伸链占27.59%（图4：B）。利用SWISS-MODEL在线工具进行预测后发现，VvFT1（图4：C）和VvFT2（图4：D）蛋白的结果也包括无规则卷曲、α-螺旋和折叠延伸链，其中无规则卷曲含量，与二级结构预测结果一致。综上所述，VvFT1和VvFT2基因编码的蛋白结构中占比由高到低均为无规则卷曲、折叠延伸链、α-螺旋，无规则卷曲结构的主要作用是决定蛋白质功能，说明VvFT1和VvFT2蛋白在单氰胺破除葡萄休眠过程中可能具有重要功能。
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图1 单氰胺处理后‘水晶’葡萄芽中生理生化指标变化
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Fig.1 Physiological and biochemical indicator changes in buds of Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’ after cyanamide treatment
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2.3.2 VvFT1和VvFT2氨基酸保守结构域分析
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使用NCBI的CDD数据库预测葡萄 VvFT1和VvFT2蛋白的保守结构域，图5：A、B结果显示葡萄VvFT1和VvFT2蛋白的氨基酸序列具有PEBP超家族结构域，其底物结合位点为第70位至第119位氨基酸。同时，经过BLAST比对分析，选择与VvFT1同源性最高的2个FT，即荔枝 （Litchi chinensis，LcFT：AEU08960.1）和龙眼（Dimocarpus longan，DlFT2：ALA55998.1），氨基酸同源性分别为94.83%和93.68%，以及VvFT2同源性最高的2个FT，即荔枝（Litchi chinensis，LcFT：AEU08961.1）和龙眼（Dimocarpus longan，DlFT2：AHF27444.1），氨基酸同源性分别为95.98%和93.68%。利用DNAMAN 8软件进行氨基酸序列比对分析，图5：C结果显示 VvFT1和VvFT2的氨基酸序列包含DPPAP和GIHR模块，具有PEBP家族典型功能结构域，并且VvFT1和VvFT2均具有关键的保守氨基酸位点Tyr84（Y）和Cln139（Q），具有 FT 活性起关键作用的11个保守氨基酸残基序列（RQTxYAPGWRQ）。综上所述，利用NCBI中CDD数据库以及同源比对分析结果显示，VvFT1和VvFT2具有PEBP家族典型功能结构域，并且该结构域保守，说明该结构域对蛋白功能的发挥非常重要。
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图2 蒸馏水（A）和单氰胺（B）处理‘水晶’葡萄后第28天的发芽情况
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Fig.2 Germination of Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’ after treating with distilled water (A) and cyanamide (B) on the 28th day
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图3 ‘水晶’葡萄VvFT1、VvFT2和VvCBF基因扩增
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Fig.3 VvFT1, VvFT2 and VvCBF gene amplifications of Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’
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2.3.3 VvFT1和VvFT2蛋白进化树构建
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VvFT1和VvFT2序列分析表明，核苷酸同源性为90.29%，氨基酸同源性为83.30%，将获得的VvFT1和VvFT2蛋白序列BLAST比对后下载同源性最高的10种植物FT蛋白序列及葡萄中同源性高的2个FT蛋白序列，利用MEGA-X构建系统进化树。经过比对发现，与VvFT1同源性最高的FT蛋白序列依次为LcFT（AEU08960.1）、DlFT2（ALA55998.1）、欧洲栓皮栎（Quercus suber，QsFT：XP_023899320.1）、水青冈（Fagus crenata，FcFT：BAP28173.1）、枣（Ziziphus jujuba，ZjFT：XP_015873598.1）、糙叶山黄麻（Parasponia andersonii，PanFT：PON55382.1）、可可（Theobroma cacao，TcFT: XP_007028083.1）、银白杨（Populus alba，PaFT：KAJ6891859.1）、毛白杨（P. tomentosa，PtFT：AFU08240.1）、金银花（Lonicera japonica，LjFT：WGO49542.1）、葡萄（Vitis vinifera，VvFT：ABF56526.1）和VvFT（NP_001267907.1），与VvFT1蛋白同源性分别为94.83%、93.68%、86.78%、85.06%、85.63%、84.48%、84.48%、83.91%、83.91%、83.33%、80.46%和79.31%。与VvFT2同源性最高的FT蛋白序列依次为LcFT（AEU08961.1）、DlFT2（AHF27444.1）、欧洲栓皮栎、水青冈、番木瓜（Carica papaya，CpFT：XP_021911503.1）、枣、独脚金（Striga hermonthica，ShFT：CAA0821245.1）、毛果杨（Populus trichocarpa，PtFT：XP_002311264.1）、月季（Rosa chinensis，RcFT：XP_024189593.1）、枇杷（Rhaphiolepis bibas，RbFT2：ALA56300.1）、VvFT（ABF56526.1）和VvFT（NP_001267907.1），与VvFT2蛋白同源性分别为95.98%、 93.68%、8 5.63%、85.06%、84.48%、84.48%、84.48%、83.33%、83.33%、83.33%、81.03%和79.89%。FT的系统发生较为复杂，VvFT1和VvFT2与荔枝和龙眼聚成一支，遗传距离较近，而其余植物FT蛋白聚成一支（图6），这说明 FT 在物种之间发生分化较早且分化差异较高。
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图4 VvFT1和VvFT2蛋白二级和三级结构预测
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Fig.4 Secondary and tertiary structure predictions of VvFT1 and VvFT2 proteins
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图5 VvFT1和VvFT2 蛋白保守结构域预测结果和同源氨基酸序列比对
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Fig.5 Conservative domain prediction results and homologous amino acid sequence alignments of VvFT1 and VvFT2 proteins
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2.4 VvCBF氨基酸序列的理化性质、蛋白结构预测、进化树及其氨基酸保守结构域分析
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2.4.1 VvCBF氨基酸序列的理化性质和蛋白结构预测分析
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用ProtParam tool在线工具对VvCBF基因的多肽链氨基酸数目、分子式、等电点、相对分子量等进行预测。VvCBF基因共编码237 aa，分子式为C1158H1839N335O354S15，分子质量为26.60 kDa， pI为8.31，含3 701个原子。用GOR4对VvCBF基因编码的蛋白二级结构进行预测，图7：A结果显示在组成VvCBF蛋白中α-螺旋占32.91%、折叠延伸链占22.36%、无规则卷曲占44.73%。用SWISS-MODEL在线工具进行预测后发现，VvCBF蛋白中无规则卷曲和α-螺旋含量最多，而折叠延伸链含量最少，与二级结构预测结果一致（图7：B）。
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图6 VvFT1和VvFT2 蛋白系统进化分析
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Fig.6 Phylogenetic analysis of VvFT1 and VvFT2 proteins
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2.4.2 VvCBF氨基酸保守结构域分析
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使用NCBI的CDD数据库预测葡萄 VvCBF蛋白的保守结构域，图8：A结果显示葡萄VvCBF蛋白的氨基酸序列具有AP2超家族结构域，其DNA结合位点第58位至第86位氨基酸。同时，经过BLAST比对分析，选择与VvCBF同源性最高的2个CBF，即野扁桃（Prunus ledebouriana，PlCBF：AEB69782.1）和山桃（P. davidiana，PdCBF：AFU54607.1），氨基酸同源性分别为100%和95.40%。利用DNAMAN 8软件进行氨基酸序列比对分析，图8：B结果显示 VvCBF的氨基酸序列存在 AP2 DNA 结合域以及位于该结合域两端的特征序列 PKK/RAGRRVFKETRHP和DSAWR（典型的CBFs转录因子家族蛋白结构）。
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2.4.3 VvCBF蛋白进化树构建
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将获得的VvCBF蛋白序列进行BLAST比对分析后，下载同源性最高的10种植物CBF蛋白序列及葡萄中同源性高的2个CBF蛋白序列，利用MEGA-X构建系统进化树。经过比对发现，与VvCBF同源性最高的CBF蛋白均为蔷薇科植物，依次为PlCBF（AEB69782.1）、PdCBF（AFU54607.1）、甜樱桃（Prunus avium，PaCBF：XP_021803661.1）、梅（P. mume，PmuCBF：ANW82784.1）、光核桃（P. mira，PmCBF：AFU54606.1）、桃（P. persica，PpeCBF：XP_007209842.2）、樱花（P. yedoensis，PyCBF：PQQ14279.1）、扁桃（P. dulcis，PduCBF4：BBH03298.1）、杏（P. armeniaca，ParCBF：AWR88517.1）、樱桃（P. pseudocerasus，PpCBF：AIU39990.1）、VvCBF4（AFV73334.1）和VvCBF4（AIL00786.1），同源性分别为100%、95.40%、94.94%、94.94%、94.14%、94.14%、94.09%、94.09%、78.01%、74.69%、39.66%和39.66%。图9结果显示，VvCBF与PlCBF（AEB69782.1）聚为一支，PpCBF（AIU39990.1）和ParCBF（AWR88517.1）分别单独成一支，VvCBF4（AFV73334.1）和VvCBF4（AIL00786.1）分别单独成一支，其他植物CBF聚为一支，说明VvCBF与野扁桃CBF蛋白同源性最高及亲缘关系最近。
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2.5 单氰胺喷施后‘水晶’葡萄芽中VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的相对表达量
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通过qRT-PCR分析发现，喷施单氰胺后，葡萄的VvFT1和VvFT2基因在第7、第14、第21、第28天，均高于其CK。 ‘水晶’葡萄的VvFT1基因表达量在第7天较CK增加了135.88%，第14天增加了120.12%，第21天增加了47.13%，第28天增加了57.76%（图10：A）；VvFT2基因的表达量在第7天较CK增加了390.08%，第14天增加了142.32%，第21天增加了129.20%，第28天增加了64.90%（图10：B）；VvCBF基因的表达量在第7天较CK降低了26.45%，第14天降低了50.30%，第21天降低了39.87%，第28天降低了13.05%（图10：C）。植物的FT和CBF基因在植物休眠过程中起重要作用，并且FT与CBF基因在此过程中呈负相关。本试验结果显示，单氰胺喷施提高了VvFT1和VvFT2基因表达量，而降低了VvCBF基因的基因表达量，表明单氰胺喷施葡萄可诱导其葡萄FT基因表达量的增加和CBF基因表达量的降低，从而打破葡萄的休眠，促进葡萄提前萌发进入生长发育。
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图7 VvCBF蛋白二级和三级结构预测
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Fig.7 Secondary and tertiary structure predictions of VvCBF protein
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3 讨论与结论
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‘水晶’葡萄具有较高的营养价值，深受大众的喜爱（田竹希等，2021），单氰胺常作为‘水晶’葡萄的破眠剂，促进葡萄提前萌芽，但是目前FT和CBF在破除葡萄休眠方面的机制研究较少（Vergara et al.，2016）。本研究首先测定了单氰胺处理 ‘水晶’葡萄后芽内SOD、POD和CAT活性，MDA和H2O2含量及氧自由基产生速率的变化，并通过RT-PCR技术克隆得到其在单氰胺破除葡萄休眠过程中起重要作用的VvFT1、VvFT2和VvCBF基因，并对其进行了生物信息学分析和表达水平差异分析，为单氰胺破除葡萄休眠的生理和分子机制的研究奠定了基础。邵浩和马锋旺（2004）研究表明，CAT、POD、SOD、MDA、H2O2及氧自由基产生速率等生理生化反应是植物解除休眠过程中的重要指标，梨树在解除休眠的过程中，氧自由基产生速率和H2O2含量呈先升高后降低的趋势，SOD和POD活性呈上升趋势，这与本研究单氰胺处理的‘水晶’葡萄结果一致，但其CAT呈下降趋势，与本研究结果相反。POD活性和CAT是植物体内重要的H2O2相关抗氧化酶，能够将其分解为O2和H2O，构成抗氧化酶防御系统（Mittler，2002；谭一婷等，2021），在本研究中，单氰胺处理后葡萄芽的POD活性和CAT活性均升高且在第7、第14、第21、第28天均高于其CK，单氰胺喷施后第7天葡萄芽中H2O2含量达到最高值，后续逐渐下降，说明POD活性和CAT活性的升高有效地促进了H2O2分解，降低了H2O2的含量，有利于葡萄芽的萌发。
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图8 VvCBF蛋白保守结构域预测结果和同源氨基酸序列比对
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Fig.8 Conservative domain prediction results and homologous amino acid sequence alignments of VvCBF protein
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研究表明水仙花和猕猴桃的FT转录因子在调节其休眠过程中发挥重要作用（Varkonyi-Gasic et al.，2013；Feng et al.，2015），本研究也表明FT转录因子在单氰胺打破葡萄芽休眠的过程中起到重要作用。AP2/ERF超家族是一个大的植物特异性转录因子家族，成员众多，参与植物的生长、发育和逆境反应等重要过程，根据AP2结构域和其他DNA结合结构域的数量，将AP2/ERF 超家族转录因子分为4个家族，即AP2、ERF、RAV和Soloist家族，其中ERF家族又被划分为ERF和DREB亚家族，CBF转录因子则是DREB亚家族的一员（Mizoi et al.，2012; Shu et al.，2015）。吴家敏（2018）研究表明AP2/ERF 超家族中的ERF转录因子参与单氰胺打破葡萄休眠过程。然而，DREB亚家族转录因子是否也参与此过程却暂无报道。本研究证明了‘水晶’葡萄的CBF转录因子VvCBF也参与单氰胺打破葡萄休眠的过程，但目前，AP2/ERF 超家族的 AP2和RAV等转录因子是否也参与单氰胺打破葡萄休眠的过程，值得进一步研究。据报道CBF是植物冷胁迫和休眠过程中DAM（Dormancy-associated MADS-box）基因的上游反式因子，DAM可以直接调控FT转录因子的表达，说明CBF与FT之间可以通过DAM相互影响且呈负相关关系（Horvath et al.，2008；Saito et al.，2015），与本研究结果一致，在单氰胺打破‘水晶’葡萄芽休眠的过程中，VvFT1和VvFT2基因表达均随着时间增加而上调，而VvCBF基因表达随着时间增加而下调，VvFTs与VvCBF基因的表达呈负相关。
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图9 VvCBF 蛋白系统进化分析
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Fig.9 Phylogenetic analysis of VvCBF protein
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本研究通过BLAST分别下载与VvFT1、VvFT2和VvCBF蛋白的氨基酸同源性最高的10个相关蛋白，比对发现与VvFT1氨基酸同源性大于90%的仅有2个 [LcFT（AEU08960.1）、DlFT2（ALA55998.1）]，与VvFT2氨基酸同源性大于90%的也仅有2个 [LcFT（AEU08961.1）、DlFT2（AHF27444.1）]，这4个蛋白分属于荔枝和龙眼的FT基因且通过进化树分析发现VvFT1、VvFT2、LcFT（AEU08960.1）、DlFT2（ALA55998.1）、LcFT（AEU08961.1）和DlFT2（AHF27444.1）聚为一支，说明‘水晶’葡萄、荔枝和龙眼FT转录因子在进化上较近，但是功能上是否可实现互补需要进行后续的研究。经过比对发现与VvCBF氨基酸同源性大于90%的有8个，除PlCBF（AEB69782.1）目前被划分为蔷薇科李属（Orazov et al.，2022），其余9个CBF转录因子均归属于蔷薇科桃属植物，表明‘水晶’葡萄CBF与蔷薇科（特别是桃属）植物CBF转录因子在进化上具有重要联系。
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图10 单氰胺处理后‘水晶’葡萄芽VvFT1、VvFT2 和VvCBF基因的相对表达量变化
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Fig.10 Relative gene expression changes of VvFT1, VvFT2 and VvCBF in buds of Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’ after cyanamide treatment
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本研究通过cDNA克隆技术获得了‘水晶’葡萄VvFT1、VvFT2和VvCBF基因，并对其编码的蛋白做了较详细的生物信息学功能预测分析，为VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的功能研究起到参考作用；并利用qRT-PCR技术对VvFT1、VvFT2和VvCBF基因转录表达量进行了分析，发现VvFT1和VvFT2与VvCBF基因的表达量呈反比且受单氰胺处理的影响，说明VvFT1、VvFT2和VvCBF基因在单氰胺打破葡萄芽休眠的过程中起重要作用。在此基础上，本研究还对单氰胺处理葡萄后其芽内多项生理生化指标进行了测定，进一步从生理机制方面解释了单氰胺打破葡萄休眠的机制，为葡萄生产提供了理论指导。
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摘要
为探究单氰胺破除葡萄休眠的生理生化响应及分子调控机理，该研究以‘水晶’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’）为试验材料，测定单氰胺处理 ‘水晶’葡萄后芽内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性，丙二醛（MDA）和H2O2含量及氧自由基产生速率的变化，并通过RT-PCR技术克隆得到其葡萄芽的2个FT （Flowering locus T） 基因（VvFT1和VvFT2）和1个CBF（C-repeat Binding Factor）基因（VvCBF）的全长cDNA序列，分析其理化性质、系统进化、保守基序及结构域和单氰胺处理后其在葡萄芽中的表达水平差异等。结果表明：（1）生理生化指标分析表明，单氰胺处理后葡萄芽内SOD、POD和CAT活性，MDA和H2O2含量及氧自由基产生速率均明显增加。（2）‘水晶’葡萄VvFT1和VvFT2的cDNA全长为525 bp，编码174个氨基酸（aa）；VvCBF的cDNA全长为826 bp，编码237 aa。（3）同源性分析表明，‘水晶’葡萄VvFT1与荔枝（Litchi chinensis，LcFT：AEU08960.1）和龙眼（Dimocarpus longan，DlFT2：ALA55998.1）的氨基酸同源性最高，VvFT2与LcFT（AEU08961.1）和DlFT2（AHF27444.1）的氨基酸同源性最高。系统进化分析表明，VvFT1、VvFT2、LcFT（AEU08960.1，AEU08961.1）和DlFT2（ALA55998.1，AHF27444.1）聚为一支，亲缘关系最近；VvCBF与野扁桃（Prunus ledebouriana，PlCBF：AEB69782.1）的氨基酸同源性最高，系统进化分析表明VvCBF和PlCBF聚为一支，亲缘关系最近。（4）qRT-PCR分析表明，单氰胺处理后葡萄芽中VvFT1和VvFT2基因的表达量显著增加，而VvCBF基因的表达量显著降低。该研究较为全面地分析了VvFT1、VvFT2和VvCBF基因的系统进化和单氰胺处理后葡萄芽内各基因表达模式及生理生化指标变化，为单氰胺破除葡萄休眠的分子和生理机制研究提供了理论参考。
Abstract
To explore the responses of physiological and biochemical and mechanism of molecular regulatory for grape dormancy breaking with cyanamide, Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’ was used as experimental material in this study to determine the changes in activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), contents of malondialdedyde (MDA) and H2O2, and oxygen free radical production rate, and the full-length cDNA sequences of two FT (Flowering location T) genes (VvFT1 and VvFT2) and one CBF (C-repeat Binding Factor) gene (VvCBF) from its buds were cloned and obtained by RT-PCR technology, then their physicochemical properties, phylogenetic evolution, conserved motifs and domains, and expression levels differences in grape buds after cyanamide treatment were analyzed. The results were as follows: (1) The analysis of physiological and biochemical indicators showed that activities of SOD, POD and CAT, contents of MDA and H2O2, and oxygen free radical production rate in grape buds were significantly increased after treated with cyanamide. (2) The full-length cDNA sequences of VvFT1 and VvFT2 genes were 525 bp from Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’, encoding 174 aa amino acids, and the full-length cDNA sequences of VvCBF gene was 826 bp, encoding 237 aa amino acids. (3) The homology analysis showed that VvFT1 of Vitis vinifera × V. labrusca ‘Shuijing’ had the highest amino acid homology with Litchi chinensis (LcFT: AEU08960.1) and Dimocarpus longan (DlFT2: ALA55998.1), VvFT2 had the highest amino acid homology with LcFT (AEU08961.1) and DlFT2 (AHF27444.1). The phylogenetic analysis showed that VvFT1, VvFT2, LcFT (AEU08960.1, AEU08961.1) and DlFT2 (ALA55998.1, AHF27444.1) clustered into a branch, with the closest genetic relationship; VvCBF had the highest amino acid homology with Prunus ledebouriana (PlCBF: AEB69782.1), and the phylogenetic analysis showed that VvCBF and PlCBF clustered into a branch, with the closest genetic relationship. (4) qRT-PCR analysis showed that VvFT1 and VvFT2 expression levels were significantly increased in buds after treated with cyanamide, while VvCBF expression level was significantly decreased. This study comprehensively analyzed the phylogenetic evolution of VvFT1, VvFT2, and VvCBF genes, as well as the expression patterns of these genes and physiological and biochemical indicators in grape buds after treated with cyanamide, which provides a theoretical reference for the molecular and physiological mechanisms of grape dormancy breaking with cyanamide.
