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糖是真核生物和原核生物重要的能量来源。糖转运蛋白SWEETs是真核生物和原核生物中主要的转运蛋白,能够促进糖在细胞间的流动。SWEET家族基因及其同源物广泛分布于包含细菌和古生菌的几乎所有生命领域(Chen et al.,2015)。所有真核生物的SWEETs都是由7个预测的跨膜(7TM)结构域组成,其中3TM重复序列由连接螺旋连接起来。整个结构以3+1+3的拓扑结构排列在细胞膜上(Chen et al.,2010)。植物中,SWEETs主要定位于细胞质膜上,存在于不同细胞器官,如内质网、高尔基体和液泡(Feng &Frommer,2015)。定位于质膜上的SWEET转运蛋白可以将胞液中的糖转运到质外体,行使不同的功能,如花蜜分泌(Lin et al.,2014)、质外体韧皮部装载(Chen et al.,2015)、种子灌浆(Guan et al.,2008)、花粉营养(Sun et al.,2013)、病原体感染(Chen et al.,2010)以及非生物胁迫(Wu et al.,2023)等。
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木薯(Manihot esculenta)块根富含淀粉,是世界三大薯类作物之一,也是热带亚热带地区重要的粮食作物,全世界约有10亿人以木薯作为主要粮食(Cai et al.,2023)。木薯以蔗糖为主要运输物质。木薯光合产物的分配是糖通过韧皮部维管系统从气生叶向地下贮藏根的长距离运输过程。SWEET蛋白属于MtN3/saliva gene family,也称为MtN3/saliva/SWEET,可以转运己糖和蔗糖,并介导糖外流到质外体。木薯SWEET家族共有28个同源基因,根据其转运不同糖的特性,可以分为4个亚类。其中,对MeSWEET10a的研究最为深入。Zárate-Chaves等(2021)研究显示,地毯黄单胞菌的毒力可以通过转录激活因子TAL20特异性诱导木薯MeSWEET10a的表达,增加糖的积累并最终导致木薯细菌性枯萎病的蔓延。此外,MeSWEET1、MeSWEET3b、MeSWEET15a、MeSWEET15b及MeSWEET18也有报道。其中,木薯MeSWEET1基因定位于细胞膜上,在成熟叶片的表达量最高(刘秦等,2017);木薯MeSWEET3b主要转运半乳糖,黄单胞菌Xam 能够诱导其表达(朱柏光等,2022);木薯MeSWEET15a及MeSWEET15b基因可以转运蔗糖、葡萄糖、果糖和甘露糖,VIGS沉默能够增强木薯对干旱胁迫和盐胁迫的耐受性(Fan et al.,2023);木薯MeSWEET18主要转运果糖,VIGS沉默会导致其叶片中果糖含量的增加(薛晶晶等,2022,2023);GWAS分析发现MeSWEET18与木薯块根干物质含量紧密相关,该基因主要在木薯块根中发挥作用(Rabbi et al.,2022)。前人对木薯糖转运蛋白SWEET家族基因的研究多集中在基因克隆,糖转运特性分析及非生物胁迫的表达特性等,其调控木薯块根淀粉含量、干物率的作用机制还未深入研究。本研究前期研究发现,木薯糖转运蛋白MeSWEET17b与MeSWEET18亲缘关系最近,但其功能尚未报道。因此,本研究以木薯‘KU50’为研究材料,通过克隆、亚细胞定位、糖转运特性分析以及非生物胁迫等方法,探究木薯MeSWEET17b的蛋白质性质、糖转运特性以及非生物胁迫下的表达变化。拟探讨与MeSWEET18亲缘关系最近的MeSWEET17b在木薯中的表达情况,从而为糖转运蛋白SWEETs在木薯中的功能研究提供依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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本研究采用生长于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃的‘KU50’种质作为研究材料,分别取‘KU50’形成期(植后4个月)、膨大期(植后7个月)及成熟期(植后10个月)叶片、叶柄、茎杆和块根。非生物胁迫主要是将生长20 d的‘KU50’水培苗,分别放入含有8 g·L-1 NaCl、100 mmol·L-1甘露醇及10% H2O2的溶液中进行盐、干旱和氧化处理,各处理时间分别为0 h(对照,CK)、12 h、24 h和36 h。低温处理则将水培苗直接放入植物光照培养箱采用15℃ 24 h,后降至4℃ 24 h进行处理。采集的样本立即在液氮中冷冻并储存-80℃冰箱,每个样本重复3次。
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1.2 方法
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1.2.1 总RNA提取与cDNA合成
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总RNA的提取参照RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen)的操作说明进行。cDNA第一链的合成参照RevertAid RT逆转录试剂盒(Thermo)的操作说明进行。
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1.2.2 MeSWEET17b基因全长cDNA扩增
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以Phytozome12.0中Manihot esculenta v7.1数据库的MeSWEET17b序列设计引物(表1),以‘KU50’的cDNA为模板进行序列克隆。全长cDNA的扩增体系含PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL、MeSWEET17b-F(10 μmol·L-1)2.5 μL、MeSWEET17b-R(10 μmol·L-1)2.5 μL、cDNA模板0.5 μL、灭菌水补足50 μL。扩增程序:95℃预变性5 min; 95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min,共34个循环;72℃延伸10 min。0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物,回收纯化目的条带,克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector载体上测序。
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1.2.3 生物信息学分析
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利用NCBI网站ORF Finder软件对获得的KU50 cDNA序列进行开放阅读框(open reading frame,ORF)预测,同时翻译成蛋白序列;ProtParam软件分析该蛋白的分子量与等电点;NCBI在线软件CDD分析蛋白的保守结构域;TMHMM Server v.2.0在线软件进行跨膜结构域分析;ProtScale在线软件预测该氨基酸序列的疏水性/亲水性;SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在线软件预测蛋白的二级结构。从拟南芥TAIR 数据库下载所有SWEET的蛋白序列,利用MEGA 5.0软件,选择邻接模型(neighbour-joining,NJ),并进行1 000次Bootstrap统计学检验,构建包括MeSWEET17b蛋白序列在内的木薯和拟南芥SWEET蛋白的系统进化树。利用DNAMAN软件比对MeSWEET17b与AtSWEET16、 AtSWEET17的序列同源性。
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1.2.4 MeSWEET17b亚细胞定位
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使用含有pCAMBIA1302表达载体同源序列的引物(表1)扩增MeSWEET17b不含终止密码子的CDS序列,利用重组克隆试剂盒ClonExpress Ⅱ One Step Cloning(Vazyme)将 MeSWEET17b亚克隆至 pCAMBIA1302-GFP 空载体上,构建亚细胞定位载体 35S∷MeSWEET17b-GFP,以35S∷GFP 作为对照。将重组质粒转化农杆菌感受态细胞 GV3101,挑取单菌落用YEP液体培养基(含50 μg·mL-1 Kana,25 μg·mL-1 Rif),28℃ 220 r·min-1进行活化后扩大培养直至菌液OD600在0.8~1.0间。将菌液置于离心机中,5 000 r·min-1离心10 min后收集菌体沉淀。用15 mL侵染液(10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 MES pH 5.8、100 μmol·L-1 AS)洗涤菌体,重复洗涤一次。用侵染液重悬菌体,调OD600约为0.8,黑暗静置活化2~3 h,侵染烟草叶片,25℃黑暗培养48~72 h,通过荧光共聚焦激光扫描显微镜观察,拍照。
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1.2.5 实时荧光定量PCR分析
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采用Thermo公司的CFX实时荧光定量PCR系统,实验操作按仪器使用说明书进行。将cDNA稀释10倍作为RT-qPCR分析的模板。10 μL反应体系包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Green qPCR Mix、0.8 μL 10 μmol·L-1 MeSWEET17b-qPCR引物、灭菌水补足10 μL。PCR反应程序:95℃预变性30 s,95℃ 10 s、60℃ 20 s共40个循环,循环完成后进行产物熔解曲线分析。以MeActin作为内参基因,以2-△△Ct算法进行基因的相对定量表达分析。
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1.2.6 MeSWEET17b的糖转运特性分析
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EBY.VW4000酵母是一种己糖转运功能缺陷型酵母突变体,此菌株无法在己糖为唯一碳源的尿嘧啶(ura)缺陷型选择培养基SD-ura平板上生长,可以在麦芽糖为唯一碳源的选择培养基SD-ura平板上恢复生长。将MeSWEET17b的CDS序列构建到酵母功能穿梭载体 pDR196(表1)上,使用YeastmakerTM Yeast Transformation System 2 kit 酵母转化试剂盒(Clontech)的聚乙二醇/醋酸锂高效酵母转化法将重组后的MeSWEET17b-pDR196质粒转化到EBY.VW4000酵母菌中。在选择培养基SD-ura + 2%麦芽糖平板上划线培养,倒置于 30℃培养箱中培养 3~5 d。挑单菌落放入SD-ura + 2%麦芽糖液体培养基中过夜摇菌(30℃,220 r·min-1)。待 OD600 为 1 左右时,停止摇菌。取 1 mL 菌液加入 1.5 mL 无菌离心管中,室温下,高速离心15 s,收集菌体,弃上清。加入 1 mL 无菌超纯水,重悬菌体,再次高速离心 15 s,收集菌体,弃上清。如此清洗重悬2~3次菌体,尽量降低液体培养基的影响。取4 μL菌液为×1倍,依次稀释×10倍、×100倍、×1 000 倍和×10 000 倍,均匀点涂到施加不同唯一碳源的SD-ura 选择培养基上(SD-ura + 2%麦芽糖、SD-ura + 2%葡萄糖、SD-ura + 2%果糖、SD-ura + 2%蔗糖),倒置30℃培养箱培养 3~5 d,观察生长情况。
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1.2.7 分析方法及数据处理
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采用Excel 2021分析数据,GraphPad Prism 5.0软件作图以及Dunnett's 检验。
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2 结果与分析
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2.1 MeSWEET17b基因全长CDS克隆及蛋白质结构特性分析
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通过RT-PCR扩增及测序,获得MeSWEET17b 基因编码框序列726 bp,编码242个氨基酸(图1 : A),蛋白分子质量为26.32 kDa,理论等电点为7.72,不稳定系数为40.54,属于不稳定类蛋白。通过NCBI 在线软件CDD 分析发现,该蛋白N端含有MtN3_slv蛋白结构域,含有2个PQ-loop superfamily。TMHMM Server v.2.0在线软件预测显示,该蛋白含有7个跨膜结构域,是典型的膜蛋白(图1: B);ProtScale预测表明,MeSWEET17b蛋白属于疏水性蛋白(图1: C);SOPMA分析显示,MeSWEET17b蛋白二级结构由49.79%α-螺旋、27.39% 延伸链、4.56%β-转角和18.26%无规则卷曲组成。
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2.2 MeSWEET17b 的系统进化树分析及氨基酸序列比对
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对木薯糖转运蛋白SWEETs和拟南芥SWEET蛋白进行系统进化树分析,发现MeSWEET17b与拟南芥AtSWEET16和AtSWEET17位于同一进化枝上,属于第四亚类(Clade Ⅳ)(图2: A)。采用DNAMAN软件对MeSWEET17b、AtSWEET16和AtSWEET17氨基酸序列进行比对,结果显示MeSWEET17b和AtSWEET16的同源性达到51.24%,MeSWEET17b和AtSWEET17的同源性达到53.72%,含有两个明显的PQ-loop superfamily结构(图2: B)。
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2.3 MeSWEET17b 的亚细胞定位
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将35S∷GFP和35S∷MeSWEET17b-GFP重组质粒转化农杆菌感受态细胞GV3101,并侵染烟草叶片,在荧光共聚焦显微镜下观察其在烟草中的表达情况,结果显示35S∷GFP在细胞膜和细胞核中均能观察到荧光信号,而 35S∷MeSWEET17b-GFP只在细胞膜上存在荧光信号,推测 MeSWEET17b定位于细胞膜(图3)。
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图1 MeSWEET17b的核苷酸序列和蛋白质结构特性
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Fig.1 Nucleotide sequence and protein structure property of MeSWEET17b
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2.4 MeSWEET17b 的糖转运特性
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为验证 MeSWEET17b 的糖转运特性,将pDR196和重组后的MeSWEET17b-pDR196质粒转化至以麦芽糖作为唯一碳源的己糖转运缺陷型酵母 EBY.VW4000 中。将含有pDR196 和MeSWEET17b-pDR196的转化酵母按照1、10-1、10-2、10-3、10-4稀释,分别点涂于含有2%麦芽糖(对照)、2%葡萄糖、2%果糖及2%蔗糖等不同碳源的选择培养基SD-ura平板上,30℃,倒置培养3~5 d,观察生长情况。由图4可知, pDR196和MeSWEET17b-pDR196均能在2%麦芽糖为唯一碳源的SD-ura平板上生长;同时,MeSWEET17b-pDR196也能在2%果糖为唯一碳源的SD-ura平板上生长,推测MeSWEET17b主要转运果糖。
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2.5 MeSWEET17b 在木薯不同器官不同发育时期的表达
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分别取‘KU50’形成期、膨大期及成熟期叶片、叶柄、茎杆和块根材料,提取总RNA后,进行RT-qPCR分析。由图5可知:MeSWEET17b在木薯叶片中的相对表达量较低,在成熟期时降到最低;在叶柄中的相对表达量随着木薯的生长持续上升,在成熟期时达到最大;在膨大期和形成期时的茎杆中相对表达量无差异,在成熟期时呈显著上升趋势;在木薯块根膨大期时的相对表达量为最高,随着块根生长,相对表达量低于形成期。
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图2 MeSWEET17b的系统进化树及氨基酸序列比对
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Fig.2 Phylogenetic tree of MeSWEET17b and sequence alignment of amino acids
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2.6 MeSWEET17b在非生物胁迫下的表达分析
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将‘KU50’茎杆水培培养20 d后,进行干旱、盐、氧化以及低温胁迫,干旱、盐和氧化胁迫处理时间分别为0 h、12 h、24 h、36 h,低温胁迫采用15℃ 24 h,后降至4℃ 24 h的处理方式。采集每个时间点的叶片、叶柄、茎杆和须根进行RT-qPCR表达分析。RT-qPCR分析结果(图6)显示,干旱胁迫和盐胁迫下,随着处理时间的延长,MeSWEET17b的相对表达量呈先上升后下降的趋势;当干旱胁迫24 h时,MeSWEET17b在叶片、茎杆和须根的相对表达量达到最高,与0 h相比,叶片和茎杆在处理24 h时相对表达量分别提高了11.17倍和20.95倍;盐胁迫12 h时,MeSWEET17b在叶片和茎杆中的表达较对照分别提高了42.46倍和3.62倍;氧化胁迫下,MeSWEET17b在须根中的相对表达量最高,24 h时较对照提高了1 876倍且叶片和须根中的相对表达量均呈先上升后下降的趋势,而叶柄和茎杆的相对表达量则呈先下降再上升的趋势,至36 h达到最大值;低温(15℃)处理24 h,MeSWEET17b在叶柄、茎杆和须根中的相对表达量呈上升趋势,低温(4℃)处理24 h后,叶柄和须根中的相对表达量进一步上调,但其在叶片中的相对表达量则呈先下降再上升的趋势。
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3 讨论与结论
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糖在植物的生理代谢、生长发育等方面具有重要作用,不仅是植物生长和细胞新陈代谢的能量来源,也是细胞的重要信号分子(Liu et al.,2019);而糖转运蛋白SWEET基因能够调控细胞内外以及器官间的糖含量,影响植物的源库关系(Yin et al.,2009),进而协调植物生长发育及环境响应(Yu et al.,2012)。以木薯‘KU50’叶片cDNA为模板,扩增MeSWEET17b的CDS序列,与Manihot esculenta v7.1数据库中AM560的序列进行比对,结果发现无碱基差异,表明MeSWEET17b在木薯中高度保守。利用RT-qPCR分析MeSWEET17b在‘KU50’不同发育期的叶片、叶柄、茎杆和块根的表达情况,发现MeSWEET17b在叶柄中高表达,其成熟期的相对表达量达到最大,在叶片、茎杆和块根中的相对表达量均较低。与木薯栽培种‘TME204’不同组织/器官中的转录组结果一致(Wilson et al.,2017)。体外酵母检测发现MeSWEET17b主要转运果糖,推测木薯MeSWEET17b主要负责将叶柄中聚集的果糖进行外排,在木薯的‘流’器官中发挥作用。烟草瞬时表达显示MeSWEET17b主要定位于细胞膜,是典型的膜蛋白,与MeSWEET1(刘秦等,2017),以及MeSWEET15a和MeSWEET15b(Fan et al.,2023)的研究结果一致。
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图3 MeSWEET17b的亚细胞定位
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Fig.3 Subcellular localization of MeSWEET17b
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图4 MeSWEET17b的糖转运特性
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Fig.4 Sugar transport properties of MeSWEET17b
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图5 MeSWEET17b在木薯不同器官不同发育时期的表达分析
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Fig.5 Expression analysis of MeSWEET17b in different organs of cassava at different developmental stages
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系统进化树分析表明,MeSWEET17b 位于Clade Ⅳ,与拟南芥 AtSWEET16 和 AtSWEET17 属于同一进化分支。MeSWEET17b与木薯MeSWEET18亲缘关系最近,氨基酸序列同源性达到82.79%。木薯MeSWEET18主要转运果糖,VIGS沉默MeSWEET18后,其沉默株系叶片的果糖含量增多(薛晶晶等,2022,2023)。拟南芥AtSWEET17在叶片的果糖分配上发挥着重要作用,并且AtSWEET17 沉默株系表现为果糖积累功能紊乱、植株发育不良等(Chardon et al.,2013)。对MeSWEET17b的糖转运特性进行分析,发现其主要转运果糖,与MeSWEET18和 AtSWEET17 主要影响果糖积累的研究结果一致。
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图6 MeSWEET17b在木薯不同器官非生物胁迫下的表达分析
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Fig.6 Expression analysis of MeSWEET17b in different organs of cassava under abiotic stresses
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前人已有较多研究表明,SWEET家族基因在非生物胁迫下的表达情况。例如,苹果糖转运蛋白基因MdSWEET17转化番茄后,能够增强番茄对干旱的耐受性,同时积累更多的果糖(Lu et al.,2019);过表达拟南芥AtSWEET17和AtSWEET16会导致冷胁迫下叶片液泡中果糖积累减少(Chardon et al.,2013);定位于液泡膜上的果糖特异性转运蛋白SWEET17能够影响干旱条件下拟南芥侧根的生长(Valifard et al.,2021);茶树CsSWEET16基因参与糖在液泡膜上的分配,能够影响拟南芥低温胁迫下的耐受性(Wang et al.,2018);百合LoSWEET14基因在干旱、低温、盐等非生物胁迫及脱落酸处理下的表达显著增加, LoSWEET14基因过表达烟草株系显著增强了对干旱和低温等非生物胁迫及脱落酸的敏感性,但其与拟南芥AtSWEET10 亲缘关系最近,主要转运蔗糖(Zeng et al.,2022)。本研究对木薯‘KU50’水培苗进行盐、干旱、氧化和低温处理,对处理不同时间的叶片、叶柄、茎杆和须根等器官进行RT-qPCR分析,结果发现:非生物胁迫下,MeSWEET17b 在叶片、叶柄、茎杆和须根等器官的相对表达量随着处理时间的延长呈显著性变化;干旱胁迫下,MeSWEET17b在叶片和茎杆中的相对表达量变化差异最大;盐胁迫下,MeSWEET17b在叶片和须根中的相对表达量变化最为显著;氧化和低温胁迫下,MeSWEET17b在须根中的相对表达量呈现飞跃式上升,在叶柄中的相对表达量随着处理时间的延长呈极显著上升趋势。MeSWEET17b在叶柄中相对表达量最高,可能主要作用于叶柄的糖转运。因此,推测木薯MeSWEET17b可能主要在氧化胁迫和低温胁迫下起作用。
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因此,基于以上研究结果,在后续研究中,将利用木薯原生质体对MeSWEET17b进行亚细胞定位,明确其定位的具体细胞类型。分析MeSWEET17b启动子序列中与非生物胁迫、糖信号等相关的顺式作用元件,构建pMeSWEET17b∷GUS载体转化木薯,采用组织化学染色法对转基因植株中GUS基因的表达情况进行分析。对获得的MeSWEET17b过表达株系及Crispr Cas9基因编辑株系的叶片、叶柄、茎杆及块根的糖含量进行测定,并分析MeSWEET17b以及糖代谢相关基因的表达趋势;同时,选择差异倍数明显的株系进行转录组分析及非生物胁迫研究,筛选调控MeSWEET17b的转录因子,深入研究木薯MeSWEET17b的基因功能,为进一步研究糖转运蛋白SWEETs在木薯中的功能提供理论依据。
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摘要
木薯 (Manihot esculenta) 是热带亚热带地区重要的粮食作物。糖转运蛋白SWEETs能够促进糖在细胞间的流动,在植物生长发育过程中起着重要作用。为明确 SWEET 家族基因在木薯生长发育过程中的功能,该研究以木薯‘KU50’为实验材料,采用基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、体外酵母检测及RT-qPCR等方法研究木薯MeSWEET17b的基因特性。结果表明: (1) MeSWEET17b基因开放阅读框为726 bp,编码242个氨基酸,定位于细胞膜;MeSWEET17b蛋白与AtSWEET16、AtSWEET17 亲缘关系较近,含有7个跨膜结构域,属于疏水性蛋白。(2) 体外酵母检测表明MeSWEET17b主要转运果糖。(3) RT-qPCR结果表明,MeSWEET17b在叶柄和茎杆中表达趋势基本一致,成熟期相对表达量最高,在叶片中相对表达量较低,在块根膨大期相对表达量最高,随着块根生长发育,相对表达量急速下降。(4) 对‘KU50’水培苗进行高盐(8 g·L-1 NaCl)、干旱(100 mmol·L-1甘露醇)、氧化(10% H2O2)和低温(15 ℃ 24 h,后降至4 ℃ 24 h)等非生物胁迫处理。RT-qPCR结果显示,干旱胁迫下,MeSWEET17b在叶片和茎杆中的相对表达量变化差异最大;盐胁迫下,MeSWEET17b在叶片和须根中的相对表达量变化最显著;氧化和低温胁迫下,MeSWEET17b在须根中和叶柄中的相对表达量随着处理时间的延长呈极显著上升趋势。该研究为进一步研究糖转运蛋白SWEETs在木薯中的作用机制提供依据。
Abstract
Cassava (Manihot esculenta) is an important food crop in tropical and subtropical regions. Sugar transporter protein SWEETs facilitate the flow of sugar between cells and play an important role in plant growth and development. In order to clarify the function of SWEET family genes in cassava, cassava‘KU50’ was used as material in this study, and the gene properties of MeSWEET17b were studied by gene cloning, bioinformatics analysis, subcellular localization, in vitro yeast detection and RT-qPCR, etc. The results were as follows: (1) The open reading frame of MeSWEET17b was 726 bp, encoding 242 amino acids, and located in the plasma membrane. MeSWEET17b had the closer genetic relationship with AtSWEET16 and AtSWEET17, containing 7 transmembrane domains, and belonging to hydrophobic protein. (2) MeSWEET17b mainly transport fructose through the in vitro yeast detection. (3) The results of RT-qPCR showed that the expression trend of MeSWEET17b in stem was basically consistent with in petiole, and the expression was the highest at maturity. The relative expression of MeSWEET17b was relatively low in leaves, and the highest in the expansion stage of tuberous root, while decreased rapidly with the growth of tuberous roots. (4) The ‘KU50’ seedlings were subjected to abiotic stress treatments such as high salt (8 g·L-1 NaCl), drought (100 mmol·L-1 mannitol), oxidation (10% H2O2) and cold (15 ℃ for 24 h, then dropped to 4 ℃ for 24 h). RT-qPCR showed that the relative expressions of MeSWEET17b in leaf and stem had the greatest difference under drought stress. The relative expressions of MeSWEET17b in leaf and fibrous root changed most significantly under salt stress; under oxidation and cold stress, the relative expressions of MeSWEET17b in fibrous root and petiole increased significantly with the extention of treating time. This study provides a theoreticac reference for further studying the function mechanism of sugar transporter protein SWEETs in cassava.