在过去的20年里，世界范围内的高温、干旱等自然灾害发生次数与持续时间显著增加，严重影响了人类粮食安全。大豆（Glycine max）作为一种重要的粮油饲兼用作物，为人类和动物提供了丰富的植物蛋白质和油脂等营养物质，其生长受外界环境严重影响。利用现代生物信息学和生物技术手段挖掘参与大豆逆境胁迫响应的关键基因并加以利用，以提高大豆对逆境胁迫的耐受性，是提高大豆产量与品质的重要手段。

表观遗传调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA调控等（Peixoto et al.，2020），在保证生命体的正常生长、发育与繁衍等方面起重要作用（Liang et al.，2020；Turgut-Kara et al.，2020；Citovsky，2022；杨涛等，2022）。组蛋白赖氨酸甲基化修饰是由特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferases，HKMTs）所催化，并且这样的甲基化修饰可以是单甲基化（me1）、双甲基化（me2）和三甲基化（me3）（Lachner et al.，2003；Liu et al.，2010；张淼等，2022）。通常情况下，组蛋白H3第4位赖氨酸（K4）的me3（H3K4me3）和H3K36me3与基因转录激活有关；H3K9me2和H3K27me3与基因转录抑制有关（Stillman，2018）。

HKMTs是一类含有SET（Suppressor of variegation，Enhancer of zeste，Trithorax）结构域的家族。SET结构域是由130个氨基酸组成的保守结构域，在真核生物中广泛存在（Liu et al.，2019；Zhou et al.，2020）。已知拟南芥中至少存在49个含有SET结构域的SDG（SET DOMAIN GROUP）蛋白成员，并被细分为7个亚族（Ng et al.，2007）。其中TrxG（Trithorax Group）亚族包括5个ARABIDOPSIS TRITHORAX 1-5（ATX1-5）蛋白成员、2个ARABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED（ATXR）蛋白成员ATXR3和ATXR7（Chen et al.，2017；Pinon et al.，2017）。拟南芥TrxG基因家族被证明参与了植物开花时间调控，根、叶、花器官以及孢子体、配子体发育，种子休眠，逆境胁迫响应等（Shafiq et al.，2014；Berr et al.，2015；Lee et al.，2021；Ornelas-Ayala et al.，2022）。然而，目前有关其在大豆中的同源基因家族GmTrxG成员的鉴定及参与逆境胁迫响应的生物学功能却未见报道。

本研究以大豆为研究材料，利用生物信息学和分子生物学技术手段对GmTrxG基因家族开展其理化性质、保守结构域以及表达模式分析，拟探讨以下问题：（1）大豆中GmTrxG基因家族成员数量、染色体位置分布及理化性质；（2）GmTrxG基因家族成员系统进化树、保守结构域、基因特征、表达模式等；（3）筛选特异性响应高温、低温、盐害、干旱胁迫以及茉莉酸（jasmonic acid，JA）和水杨酸（salicylic acid，SA）激素诱导的GmTrxG基因成员。本研究对于进一步解析大豆GmTrxG基因的功能及其响应逆境胁迫的作用机制具有重要参考意义，也可为耐逆大豆新种质的创制提供新的遗传资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究选用栽培大豆品种“湘春2701”作为实验材料，于25℃ 恒温、70% 湿度、中日照（12 h光照/12 h黑暗）条件下的植物生长室内生长。待大豆幼苗生长至第1个三出复叶完全展开时，模拟高温、低温、盐害、干旱以及激素（JA、SA）处理。具体如下：（1）将大豆幼苗分别置于40℃和4℃的光照培养箱中以模拟高温和低温胁迫；（2）分别使用150 mmol·L^-1的NaCl和10% PEG6000溶液浇灌大豆幼苗以模拟盐害和干旱胁迫；（3）对大豆幼苗叶片分别喷施200 μmol·L^-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和2 mmol·L^-1水杨酸（SA）溶液以模拟JA和SA激素处理。对于模拟高温、低温、盐害、干旱胁迫的大豆幼苗分别于0、24、48 h取样；而JA和SA处理的大豆幼苗分别于0、4、8 h取样。以上实验均包含3次独立的生物学重复。

1.2 TrxG家族蛋白成员的获得与鉴定

以拟南芥TrxG蛋白序列（ATX1-5、ATXR3和ATXR7）分别作为参考序列，在Phytozome数据库（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）中进行检索和比对分析。将获得的可能同源蛋白序列于SMART数据库（http://smart.embl-heidelberg.de/）和NCBI中CDD在线预测网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?）进行结构域组成分析，确定大豆GmTrxG蛋白成员，并依据其与相应拟南芥TrxG蛋白的亲缘关系远近依次以a、b、c、d进行命名。

1.3 染色体位置、基因结构、结构域组成以及蛋白理化性质分析

在Phytozome数据库中获取大豆GmTrxG家族成员基因ID、转录本数量、染色体上分布位置、基因序列、CDS序列、氨基酸序列等。利用在线工具GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）绘制基因结构图。利用SMART网站在线分析各蛋白的结构域组成特征。利用Expasy在线数据库（https://web.expasy.org/protparam/）分析各成员蛋白的相对分子质量和等电点等理化性质。

1.4 系统进化树的构建

运用Clustal X 1.83软件对拟南芥和大豆TrxG家族成员的氨基酸序列进行多重序列比对。使用MEGA 7.0软件中的比邻法（neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，设置参数如下：校验参数Bootstrap method 为500；替换模型为Poisson model；缺口设置为Pairwise deletion。

1.5 TrxG基因家族成员在不同组织、器官中的表达模式分析

从Phytozome数据库中收集大豆GmTrxG基因家族成员在不同组织、器官（包括根、根尖、侧根、茎、茎尖、叶、花、种子等）中的FPKM数据，利用TBtools软件进行数据分析并绘制基因表达热图。

1.6 实时荧光定量PCR检测

Trizol法提取不同胁迫处理下的大豆幼嫩叶片总RNA，利用反转录试剂盒（Fermantas，K1622）合成cDNA。以合成的cDNA为模板，使用SYBR Green Master mix（Applied Biosystems，A25742）进行实时荧光定量PCR检测。PCR体系如下：2×SYBR Green Master mix 10 μL；正反向引物F和R各0.4 μL；cDNA模板1 μL；ddH₂O 8.2 μL。利用CFX96 C1000 Touch（伯乐公司，美国）荧光定量 PCR仪进行PCR扩增反应，反应程序：预热95℃，2 min；预变性95℃，40 s；40个循环：变性95℃，10 s；退火和延伸60℃，30 s。使用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。大豆GmActin（Glyma.18G290800）基因作为内参（Jiang et al.，2022），本研究中所用到的引物如表1所示。

2 结果与分析

2.1 大豆TrxG基因家族成员的鉴定及理化性质分析

在大豆中共鉴定到15个拟南芥TrxG同源蛋白成员（表2），其中拟南芥ATXR3/SDG2和ATX3/SDG14在大豆中的同源蛋白成员各有4个，分别是GmSDG2a/b/c/d和GmSDG14a/b/c/d；ATX2/SDG30、ATX4/SDG16和ATXR7/SDG25同源蛋白成员各有2个，分别是GmSDG30a/b、GmSDG16a/b和GmSDG25a/b；ATX5/SDG29同源蛋白成员仅1个，即GmSDG29。GmTrxG基因编码的氨基酸长度为982~2 394 aa。GmSDG29蛋白的同分异构体数量最多，共有10种。5个蛋白（GmSDG2a/b/c/d和GmSDG30a）的等电点在6.22~6.95之间，为酸性蛋白；其余10个蛋白的等电点在7.72~9.03之间，为碱性蛋白。鉴定到的15个GmTrxG蛋白不稳定系数介于56.27~76.10之间，为不稳定蛋白。亲水性分析结果表明15个GmTrxG蛋白均为亲水性蛋白。

2.2 大豆TrxG蛋白家族系统进化树、保守结构域和基因结构分析

系统进化树和蛋白质结构域组成分析结果显示，大豆GmTrxG蛋白成员可被细分为3个亚族（I、Ⅱ、Ⅲ）（图1：A）。其中，I类亚家族仅含有GmSDG2同源蛋白，共4个成员，各蛋白均只含有1个SET结构域；Ⅱ类亚族含有GmSDG25同源蛋白共2个成员，均含有SET结构域和post-SET结构域各1个外，此外，GmSDG25a还含有1个GYF（glycine-tyrosine-phenylalanine）结构域；Ⅲ类亚族含有GmTrxG同源蛋白共9个成员，这类亚族蛋白成员均含有1个SET结构域、1个post-SET结构域和多个PHD（the plant homeodomain）结构域，此外，GmSDG30a还含有1个FYRC（“FY-rich” domain C-terminal）结构域（图1：B）。基因结构分析结果显示，GmSDG14a/b/c/d、GmSDG16a/b和GmSDG29基因各含有23个外显子，GmSDG30a/b含有24个外显子，GmSDG2a/b/c/d含有19个外显子，GmSDG25a/b含有14个外显子（图1：C）。

2.3 大豆TrxG基因家族成员在不同组织、器官中的表达模式分析

基于转录组数据，GmTrxG基因家族成员在不同组织、器官中的表达模式如图2所示。在根中，GmSDG25a和GmSDG25b的表达量较低，而GmSDG30a表达量最高；在侧根中，GmSDG14c和GmSDG14d的表达量最高，其余基因表达量都较低；在茎中，几乎所有GmTrxG基因的表达量都较低，其中GmSDG16a表达量最低；在叶和花器官中，绝大多数GmTrxG基因的表达量都较高，仅GmSDG25a和GmSDG25b在叶中表达量较低，以及GmSDG14c和GmSDG14d在花中表达量较低；在种子中，GmSDG14a表达量最高，而GmSDG2c、GmSDG2d和GmSDG14c表达量较低；在根尖中，GmSDG14c和GmSDG14d的表达量较高，其余GmTrxG基因表达量均较低；在茎尖中，除GmSDG14d、GmSDG16b和GmSDG29表达量较低外，其余GmTrxG基因表达量均较高，并且GmSDG2a表达量最高。

2.4 大豆TrxG基因家族成员在不同胁迫处理下的表达情况分析

利用qRT-PCR技术分析了GmTrxG基因家族成员在不同胁迫处理下的表达情况，结果如图3所示。在高温（40℃）胁迫下，除GmSDG2b/2c/2d和GmSDG25a/25b外，其余GmTrxG基因均表现出较之对照（CK-0 h）先升高（24 h处高表达）后下降（48 h处低表达）的表达趋势（图3：A）。GmSDG2b/2c/2d和GmSDG25a/25b在高温处理48 h后的表达量显著高于处理24 h后的表达量；而GmSDG14a基因的表达水平在高温处理24 h后显著上升，处理48 h后又显著降低且低于对照。

在低温（4℃）胁迫下，GmSDG2b/2c和GmSDG14c在处理24 h和48 h后的表达量均显著高于对照；GmSDG2d、GmSDG14b/14d、GmSDG29以及GmSDG30a/30b在处理24 h后其表达量显著上升，而在处理48 h后又显著下降且均显著低于对照；其余GmTrxG基因的表达量在处理24 h和48 h后均较之对照显著降低（图3：B）。

在盐胁迫下，除GmSDG2b、GmSDG14c和GmSDG25a/25b基因的表达量在处理24 h和48 h后均显著高于对照以外，其余GmTrxG同源基因均表现出在处理24 h后轻微上升而在处理48 h后显著降低的表达趋势，并且在盐胁迫48 h后各基因的表达量均显著低于对照（图3：C）。

在PEG6000模拟干旱胁迫下，9个GmTrxG同源基因（GmSDG2a/2b/2c/2d、GmSDG14b/14c/14d和GmSDG25a/25b）的表达量在处理24 h和48 h后均高于对照；而其余6个GmTrxG同源基因的表达量在处理24 h和48 h后均表现为持续降低，并显著低于对照（图3：D）。

2.5 TrxG基因家族成员在茉莉酸和水杨酸处理下的表达情况分析

通过分析GmTrxG基因家族成员在不同激素（JA、SA）诱导下的表达模式，结果如图4所示。在JA处理下，除GmSDG2b/2c/2d和GmSDG14c/14d基因的表达量在处理4 h和8 h后均高于对照以及GmTrxG14a在处理4 h和8 h后均低于对照外，其余GmTrxG基因均表现出在处理4 h后的基因表达量显著高于对照，而在处理8 h后的基因表达量明显下降（图4：A）。在SA处理下，除GmSDG14a基因在处理4 h和8 h后的表达量均低于对照以外，其余GmTrxG基因在处理4 h和8 h后，均表现出先显著升高（4 h处）后降低（8 h处）的表达趋势。其中，在处理4 h后，GmTrxG基因的表达量较之对照显著升高；而在处理8 h后，除GmSDG2b和GmSDG25b基因相较于处理4 h后基因表达量降低但仍显著高于对照外，其余GmTrxG基因的表达量均低于对照（图4：B）。

3 讨论与结论

本研究共鉴定到15个大豆TrxG蛋白成员，其中拟南芥ATX5/SDG29在大豆中仅有1个同源蛋白成员GmSDG29，很可能是由于大豆在由古四倍体演变成二倍体的过程中发生了基因的丢失或重组造成的。结构域组成分析发现，大豆TrxG蛋白家族中Ⅱ、Ⅲ类亚族蛋白均含有post-SET结构域，而post-SET结构域对于SET功能结构域酶活性中心的形成与发挥具有促进作用。Ⅲ类亚族蛋白结构域的组成较为丰富，包含了至少2个PHD结构域。PHD结构域是一种进化上保守的锌指结构域，由50~80个氨基酸残基组成，被认为是组蛋白甲基化修饰密码的重要“解读器”之一，在植物生长发育过程中起重要作用。

本研究中基于转录组数据的表达模式结果显示，绝大多数GmTrxG基因在茎尖、叶、花中的表达量较高，暗示着大豆TrxG家族基因很可能参与了花器官的形成、花芽分化以及成花转变等过程。前人研究表明拟南芥ATX1/SDG27、ATX2/SDG30以及水稻中ATX1的直系同源基因OsTrx1参与植物开花调控（Shafiq et al.，2014；Choi et al.，2014；Berr et al.，2015）。姜玲等（2024）也发现含有GmSDG25a/GmSDG25b的转基因拟南芥株系表现出晚于拟南芥sdg25突变体开花，接近于野生型（Col-0）开花的表型，说明GmSDG25a和GmSDG25b具有调控植物开花的功能，这暗示着GmTrxG家族其他成员很可能也具有调控植物开花的生物学功能。

拟南芥ATX4/SDG16和ATX5/SDG29能直接促进ABA信号通路中负调控因子AHG3染色质上H3K4me3的累积进而负调控干旱胁迫反应（Liu et al.，2018），以及ATXR7/SDG25和ATX1/SDG27参与高温胁迫应答反应（Song et al.，2021）。茶树组蛋白H3K4甲基转移酶基因CsSDG36在拟南芥中过表达会降低植株对高渗胁迫的耐受性（Chen et al.，2021），说明不同物种中的TrxG同源基因在植物耐逆胁迫中起作用。本研究也证实了大豆GmTrxG基因家族成员能特异性地响应高温、低温、盐、干旱等逆境胁迫。

在大豆中开展抗逆基因的挖掘对于培育耐逆大豆新种质具有重要意义。本研究首次分析了大豆GmTrxG基因家族成员在高温、低温、盐、干旱以及不同激素（JA、SA）诱导下的表达模式，从中筛选到7个受逆境胁迫特异性高表达的GmTrxG基因成员，GmSDG2a/b/c/d、GmSDG14c和GmSDG25a/b，为后续基因功能验证及耐逆大豆新种质的创制提供参考。

参考文献