澳洲坚果（Macadamia integrifolia）是一种高经济价值的常绿坚果树，原产于澳大利亚东海岸的热带雨林。因其优质的可食用性，在世界各地的热带和亚热带无霜区被进行商业种植（Yang et al.，2023）。澳洲坚果果仁的主要成分是脂肪、蛋白和多种微量元素等（Wojdylo et al.，2022）。前期研究表明，澳洲坚果果仁的营养成分含量在不同澳洲坚果种质之间变化较大，果仁内的变异系数由高到低依次为Ca＞Zn＞P＞Mg＞可溶性糖＞Fe＞蛋白质＞氨基酸＞K＞脂肪，主成分分析可将主要营养成分聚为4个，即氨基酸组分因子、矿物质因子、脂肪因子、蛋白质因子，累积贡献率为87.91%（谭秋锦等，2021a）。可见，蛋白组分在澳洲坚果果实营养成分中具有重要作用。然而，在澳洲坚果研究中，对脂肪酸（Richards et al.，2020）和微量元素营养的研究较多（de Silva et al.，2023），但对蛋白质含量及其调控的研究较少。蛋白质作为重要的生命大分子，除了提供营养价值外，还作为转录因子（Zumajo-Cardona et al.，2023）、酶（Gabrielli et al.，2022）、蛋白复合体（Gisriel et al.，2022）参与植物生长发育和抗逆等多种生物过程。

其中，R2R3-MYB转录因子MYB44参与逆境抗性和多种植物激素传导调控，是植物激素信号交互的关键转录因子（Wang et al.，2023）。在拟南芥基因组中，AtMYB44属于第22亚组，保守基序为22.1 （TGLYMSPxSP）和22.2 （GxFMxVVQEM IxxEVRSYM）（Stracke et al.，2001），通过与PYL9、WRKY70等蛋白结合从而调控拟南芥等植物的抗逆反应、参与乙烯和茉莉酸等激素信号传导过程，其自身亦受转录和翻译后调节。例如，AtMYB44提高拟南芥对桃蚜的抗性是通过激活乙烯信号途径EIN2来实现（Liu et al.，2011）；MYB44竞争性抑制MYB340-bHLH2-NAC56复合体形成进而调控紫瓤甘薯花青素的生物合成（Wei et al.，2020）；AtMYB44启动子区域核小体密度低，便于多种信号的转录因子调控其表达（Nguven &Cheong，2018）。在调控其他蛋白的相关研究中，发现牡丹PsMYB44通过抑制二氢黄酮醇-4-还原酶基因表达负调节花瓣斑点分布（Luan et al.，2023）。来自中国野生紫葡萄的VaMYB44转录因子负调控转基因拟南芥和葡萄植株的耐寒性（Zhang et al.，2022）。综上可知，MYB44转录因子可能参与澳洲坚果中果实营养成分含量的调控。本研究以广西壮族自治区重要经济果树澳洲坚果为研究对象，依托澳洲坚果高低果仁蛋白质含量差异显著品种的转录组数据和澳洲坚果‘桂热1号’品种基因组数据（Xia et al.，2022），采用转录组学、基因克隆和生物信息学等方法，通过鉴定果仁中差异显著基因的结构与功能，拟探讨以下问题：（1）澳洲坚果果仁中与营养成分形成相关的主效调控基因是哪些种类；（2）基因具有哪些特异性的结构与功能；（3）不同澳洲坚果品种果仁蛋白质含量积累与基因表达量的关系如何。本研究对MYB转录因子22亚家族成员MiMYB44L进行结构分析、表达分析以及表达量与蛋白质含量之间的相关分析等，为深入开展澳洲坚果营养成分的转录调控研究打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021—2023年在广西壮族自治区农业科学院广西南亚热带农业科学研究所澳洲坚果种质资源圃进行。该地区属南亚热带季风气候，热量丰富，雨量充沛，日照充足。选取不同果仁蛋白质含量差异显著的10个品种‘JW’‘SH’‘A16’‘桂热1号’‘B7’‘B4’‘皇家大果’‘B3’‘A38’和‘A4’果仁为材料测定蛋白质含量并提取RNA。根据本单位自主研发的主推品种‘桂热1号’基因组数据、‘桂热1号’和‘A4’果仁转录组数据筛选和克隆MiMYB44L基因。

1.2 MiMYB44L克隆与表达规律分析

基因克隆采用MiMYB44L-F1 5′-TCCGTTTCTCTCATCTTCTC-3′和MiMYB44L-R1 5′-GTCTGTCTTCCATCTTCAATC-3′这对引物进行克隆。荧光定量MiACTIN为内参基因和相应的荧光定量引物为 MiMYB44L-QF5′-AATCGCTCGTCTCCTCTC-3′和 MiMYB44L-QR 5′-GGCTTGAACCACCTGAAC-3′； MiACTIN-QF5′-TCTTCATTGCCTGCACTCCAGA-3′和 MiACTIN-QR 5′-TTCCACCTGAATGCCGTCTAGC-3′。在美国Bio-rad（伯乐）公司CFX96荧光定量PCR仪中进行反应。反应程序参照宋海云等（2023）的方法，并使用2^-ΔΔCt方法分析处理荧光定量数据。

1.3 澳洲坚果蛋白质含量测定

蛋白质含量测试依据中华人民共和国国家标准《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》GB/T5009．5—2016中的凯氏定氮法进行测定（谭秋锦等，2021a）。

1.4 统计分析

采用Origin pro 2021科技绘图软件和Office365进行数据整理。所有基因表达实验数据均为3次生物重复和3次技术重复的平均值和标准误。采用SPSS 27版本对数据进行单因素方差分析、多重比较分析和相关分析（宋海云等，2023）。

2 结果与分析

2.1 澳洲坚果‘桂热1号’和‘A4’果仁转录组分析

采用北京百迈客生物科技有限公司的Illumina高通量测序平台对澳洲坚果高蛋白质含量品种‘桂热1号’和低蛋白质含量品种‘A4’果仁的转录组进行分析。共获得39.34 Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到5.92 Gb，Q30碱基百分比在94.06%及以上。‘桂热1号’比‘A4’果仁上调基因1 667个，下调基因1 798个。进一步采用GO和KEGG富集分析发现差异基因主要在淀粉和糖代谢、氨基酸生物合成和碳代谢路径（图1：A）。随后发现一个差异基因gene-LOC122077931，编码R2R3-MYB转录因子MYB44L，在‘桂热1号’中表达量显著高于其在‘A4’果仁中的表达量（图1：B）。

2.2 MiMYB44L的生物信息学分析

根据澳洲坚果高蛋白质含量品种‘桂热1号’和低蛋白质含量品种‘A4’果仁的转录组分析结果，从中筛选到一个差异显著的MYB转录因子。进一步搜索‘桂热1号’基因组设计引物在澳洲坚果‘桂热1号’品种果仁中克隆了MiMYB44L基因。该基因核苷酸全长1 165 bp，cDNA编码ORF长度999 bp，编码332个氨基酸（图2）。其编码蛋白分子量36.3 kDa，等电点8.19，分子式为C₁₅₇₂H₂₄₈₆N₄₆₄O₅₀₀S₁₃，总原子数5 035，不稳定系数62.96，是不稳定蛋白，脂肪指数67.26，亲水性值-0.636，为疏水性蛋白。

为进一步分析MiMYB44L蛋白的结构和特殊的基序，采用NCBI在线工具和MEME分析网站进行生物信息学分析。结果显示，澳洲坚果MiMYB44L与蒂罗花（Telopea speciosissima）的TsMYB44和荷花（Nelumbo nucifera）的NnMYB44蛋白序列相似度最高，聚为一个亚族（图3）。含有8个特征的基序：1. HRAFTPEEDETIIRAHARFG NKWATIARLLSGRTDNAIKNHWNSTLKRKC；2. DRIKGPWSPEEDEALQKLVQKHGPRNWSLISKSIPGRS GKSCRLRWCNQL；3. QFFSAEFLAVMQEMIRKEVR NYMSGJEQN；4. NPSSPSGSDVSDSSLPVMSSSHVY RPVARTGGVLPPVQTIE；5. CLQAEGIRNAVVKRIG ISKIE；6. DPPTSLSLSLPGSDS；7. HSQQPLKRSASA GAATPVSG；8. MASTRKDV。这说明其结构与植物MYB44家族蛋白序列一致。

经过对蛋白保守结构域分析发现（图4），MiMYB44L与其他植物的MYB在功能域序列方面相似度高，均含有SANT superfamily结构域。其特征为在8~173氨基酸序列中含有MDRIKGPWSPE EDDSLQKLVQKHGPRNWSLISKSIPGRSGKSCRLRW CNQLSPQVEHRAFTPEEDETIIRAHAKFGNKWATIA RLLSGRTDNAIKNHWNSTLKRKCSSMvddaSDDAQA HQPLKRSNSAGAAVAPVSSLYFNSPSSPSGSDVSDSS LPVMSSSHVY序列。MYB超家族蛋白具有转录、RNA加工和修饰、细胞分裂和染色体分割等作用。SANT结构域结合端粒DNA串联重复序列的串联拷贝是加帽复合体的一部分。对于包含G/C丰富基序 [C2-3 A （CA）1-6]的重复序列，其结合是序列依赖性的。该结构域也发现于与DNA结合的调节性转录抑制物复合物中，在所有物种中极端保守。蛋白特性结果（图5）显示，MiMYB44L蛋白为疏水性蛋白，不含有跨膜结构域和信号肽，主要含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点。

在蛋白保守结构域分析的基础上，进一步分析了MiMYB44L蛋白的二级和三级结构。MiMYB44L蛋白二级结构具体如下：α螺旋为86个氨基酸，占比25.90%；延长链为19个氨基酸，占比5.72%；β转角为10个氨基酸，占比3.01%；随机卷曲为217个氨基酸，占比65.36% （图6）。

分析‘桂热1号’‘A38’‘JW’等10个品种澳洲坚果果仁中的蛋白质含量表明，蛋白质含量间存在显著性差异。进一步提取10个品种果仁的RNA分析表明，MiMYB44L在‘JW’‘SH’等高蛋白质含量品种中表达量最高，在‘A4’‘B4’等品种中表达量最低（图7）。蛋白质含量和表达量的相关系数为0.54（P=0.002），达到极显著水平。

3 讨论

研究转录因子调控澳洲坚果蛋白质含量的分子机制和栽培技术的报道较少，但是国内外已经开展了相关的生理与分子生物学研究。如Yang等（2023）在研究澳洲坚果早期花序的代谢物和内源激素含量变化规律中发现，随着果实的生长，包括脂类、糖类和醇类、氨基酸、有机酸和核苷酸在内的大部分差异累积代谢物在果实中显著降低，除氨基酸外，大部分差异累积代谢物在叶轴中显著增加，与弱花序相比，强花序果实中以脂质为主进行积累，叶轴中则积累脂质、核苷酸和糖。谭秋锦等（2021b）在澳洲坚果种质资源收集的基础上，也对不同品种的营养成分进行研究，发现果仁营养成分均以脂肪为主。其中，‘GR1’种质的脂肪含量最高为78 g·100g^-1，‘A4’ 种质的脂肪含量最低为69.90 g·100g^-1，果实品质性状间存在显著相关性。据此，推测调控澳洲坚果果实蛋白质含量的因子也是调控果仁其他营养成分的因子。MYB44是一个多功能的转录因子，也是众多植物激素信号下游的关键调控因子。最新研究表明，在拟南芥中，MYB44通过促进EIN2和MPK3/6的表达来调控病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫（PTI）（Wang et al.，2023）。在拟南芥根中韧皮部移动的MYB44负性调节磷酸转运蛋白1的表达，从而调节植物对低磷胁迫的耐受 （Olukayode et al.，2023）。植物激素脱落酸信号途径关键转录因子ABI5通过调控MYB44的稳定性促进热激胁迫诱导的黄瓜叶绿素降解（Liu et al.，2023）。除了在拟南芥等模式植物中发现和证明MYB44的新功能，在热带乔木中也相继证明了MYB44的多样性作用，如在橡胶树中证明HbMYB44受多种激素信号诱导 （Qin et al.，2022）。在油菜中证明BcMYB44既能调控花青苷合成又能调控对干旱的抗性（Hao et al.，2022）。可见，MYB44保守的结构赋予了其在不同植物中具有类似的功能。本研究中，克隆MiMYB44L蛋白具有保守的SANT结构域，与蒂罗花和荷花的MYB44划分为一类。分子结构分析证明了它是植物MYB44转录家族的成员之一。果仁中蛋白质含量分析和表达分析之间具有极显著的相关性，说明MiMYB44L可能是澳洲坚果中蛋白质含量的调控因子。

随着遗传学和分子生物学技术的进步，可引入更多和更新的研究方法鉴定其在澳洲坚果中的功能。尽管植物中暂没发现MYB44转录因子直接调控蛋白质含量的报道，但在芥菜中，已经证明靶向沉默BjMYB28转录因子基因直接调控芥菜低硫代葡萄糖苷系的发育（Augustine et al.，2013）。最近，采用系统发育、共线性和生化分析相结合的方法，鉴定并研究了月桂科植物特有的柠檬醛生物合成基因簇，包含MYB44作为转录因子和两个乙醇脱氢酶（ADHs）作为修饰酶，它们来源于物种特异性串联和近端复制事件（Zhao et al.，2023）。牡丹PsMYB44氨基酸序列的C端有一个完整的影响花青素生物合成的C2基序，其聚集在MYB44L转录抑制分支中。PsMYB44位于细胞核中，其时空表达模式与斑点形成呈负相关（Luan et al.，2023）。可见，可以采用进化、转基因等新技术证明MiMYB44L在澳洲坚果果仁营养成分合成中具有的转录调控作用。下一步，可采取进化分析方法分析不同物种中MYB44的进化关系并分析复制事件。提取10个蛋白质含量差异显著品种的基因组DNA，扩增每个品种基因组中的MiMYB44L基因全长，分析外显子和内含子结果，并与蛋白质、脂肪酸等营养含量进行相关性分析。构建了带有35s × 2pro强启动子和GFP标签的pGREEN载体，进行烟草瞬时表达实验证明该基因的功能。在本研究的基础上，建立澳洲坚果的遗传转化体系，采用过表达和敲除MiMYB44L基因的方法证明其对蛋白质等营养成分含量的调控，对促进澳洲坚果品质育种的发展具有重要意义。

4 结论

MiMYB44L蛋白含有R2R3-MYB家族特征的SANT结构域，是典型的R2R3-MYB转录因子。MiMYB44L基因在澳洲坚果高蛋白质含量品种中的表达量显著高于低蛋白质含量品种，相关系数为0.54，达到极显著水平。

参考文献