蛋白质糖基化修饰在动植物糖信号转导过程中扮演着关键角色，对于维持细胞内环境平衡以及生长发育调控至关重要。蛋白质氧连糖基化（O-glycosylation）是糖信号转导的关键机制，其中O-岩藻糖基化修饰是蛋白质转录翻译后糖基化修饰的主要部分之一，该环节主要表现在将岩藻糖残基结合到N-聚糖、O-聚糖以及糖脂分子上（Park et al.，2020）。在动物体内，O-岩藻糖基化修饰普遍存在且具有特异性，已经被证实与动物胚胎发育、细胞迁移、肿瘤生长、病灶转移等重要生理活动密切相关（Ajima et al.，2017; Chabanais et al.，2018; Leng et al.，2018）。植物中有关蛋白质糖基化的工作开展相对较晚，目前仅在模式植物中报道较多。Aizezi等（2023）研究显示，拟南芥中有两种O-糖基化修饰，是由SPINDLY（SPY）及其同源蛋白SECRET AGENT（SEC）分别介导的细胞内蛋白的岩藻糖（O-fucose）和乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化修饰。SPY已被证实是一种作用于核质蛋白的新型O-岩藻糖基转移酶（protein O-fucosyltransferase），在植物的生长发育中起到关键作用。SPY为糖基转移酶GT41家族成员（Cui et al.，2014），尽管与人源N-乙酰氨基葡萄糖转移酶OGT高度同源，但与人源OGT功能存在差异。除植物以外，SPY同源蛋白还存在于原核生物、原生生物和藻类中，表明SPY所催化的蛋白发生O-岩藻糖基化修饰对于上述物种调控胞内蛋白功能可能具有重要作用（Zhu et al.，2022）。已有的研究显示，SPY能够通过参与植物响应赤霉素、细胞分裂素等内源激素信号及转导过程来调节植物生长、发育和生殖等生理过程（Bi et al.，2023），在植物的种子萌发（Liang et al.，2018）、茎的生长（An et al.，2012）、开花诱导（Tseng et al.，2004）等过程中发挥着重要作用。SPY还参与调控植物光信号（Zentella et al.，2017）、生物钟与节律（Wang et al.，2020; Xu et al.，2022）、应答生物与非生物胁迫（Qin et al.，2011）等过程。此外，SPY突变体的多效性表型表明SPY可能在调节多种细胞途径的关键蛋白中发挥作用（Steiner et al.，2012）。

玉米（Zea mays）是禾本科玉蜀黍属1年生草本植物，是世界上分布最广泛的粮食作物之一，其不仅是我国畜牧业、养殖业和水产养殖业等行业的重要饲料来源，而且还是食品、医疗卫生和轻工业以及化工业等行业的重要原料（高文成等，2016；许青青等，2023）。目前，有关作物中蛋白糖基化的研究还鲜有报道。Xu等（2019）对小麦的研究显示，O-GlcNAc信号能够通过调控冬小麦VRNs加速春化作用，进而促进开花，揭示了O-GlcNAc对于作物开花，乃至结实的重要作用。当前，尚未见有关作物蛋白O-岩藻糖基化修饰的报道。因此，本研究以玉米为研究对象，拟探讨：（1）ZmSPY进化关系、蛋白质结构特征与理化性质；（2）ZmSPY蛋白亚细胞定位特征；（3）ZmSPY对外源激素信号的应答及其在激素调控网络中的潜在功能。本研究结果将为禾本科植物中岩藻糖基转移酶基因ZmSPY的功能挖掘提供理论基础，也为植物蛋白的O-岩藻糖基化修饰相关研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

B73玉米与本生烟草（Nicotiana tabacum）培养于大连工业大学生物工程学院温室；大肠杆菌（Escherichia coli）XL-10 Gold以及根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101由本实验室保藏；定位载体pBIGD-GFP为本实验室构建保藏；植物RNA提取试剂TRIzol、DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司；2×TransStart Top Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、M-MLV反转录酶、Ex Taq DNA Polymerase、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、琼脂糖凝胶、DNA回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；GA、ABA、IAA、6BA购自北京索莱宝科技有限公司；所需引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 ZmSPY生物信息学分析

使用DTU Health Tech网站中的TMHMM、SignalP、YinOYang-1.2功能来预测蛋白质结构和功能、跨膜结构域、信号肽、糖基化位点等；使用SOPMA网站预测蛋白质的二级结构；使用Phyre2在线网站预测蛋白质的三级结构；使用Expasy-ProScale网站对蛋白质进行亲疏水性预测分析；使用DNAMAN 8.0软件对蛋白质序列进行多序列比对；使用MEGA 11.0软件的ClustalW算法进行序列比对，并以Maximum-Likelyhood法构建多种植物间的系统进化树；使用Wolf Psort网站进行亚细胞定位的预测。

1.2.2 ZmSPY基因的克隆和亚细胞定位载体的构建

从NCBI数据库中获得玉米ZmSPY的核苷酸FASTA序列，使用Primer Premier 5.0软件设计目的基因克隆所需引物（表1），送至北京六合华大基因科技有限公司合成。利用TRIzol法提取玉米B73根系的总RNA，选取完整性较好和纯度较高的RNA，通过Reverse Transcriptase M-MLV反转录酶将其反转录为cDNA。以此为模板使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase和特异性引物扩增ZmSPY基因编码区全长片段，通过1%的琼脂糖凝胶检测PCR产物。

将目的片段胶块切下，并回收纯化，使用BamHⅠ和KpnⅠ两种内切酶同时酶切纯化后的PCR产物与亚细胞定位所需的pBIGD-GFP载体，通过T4 DNA连接酶将ZmSPY片段与pBIGD-GFP载体按照3∶1的比例于16℃下过夜连接，连接完成后通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞，并将菌体涂布至LB-Kan抗性的平板上，挑取生长状态较好的单菌落于LB-Kan液体培养基中培养约4 h，待菌液浑浊后，以此为模板进行菌落PCR鉴定，选择阳性菌液扩大培养，提取重组质粒pBIGD-ZmSPY-GFP，并进行酶切鉴定，最后送至北京六合华大基因科技有限公司进行全长测序。

1.2.3 农杆菌转化和烟草侵染

参照CaCl₂法制备根瘤农杆菌GV3101感受态细胞，将pBIGD-GFP（对照质粒）与pBIGD-ZmSPY-GFP质粒分别转入感受态细胞，经验证正确后保藏菌种备用。另取200 μL菌液接种于50 mL含Kan（50 mg·mL^-1）、Gen（40 mg·mL^-1）和Rif（20 mg·mL^-1）LB液体培养基中，并加入10 mmol·L^-1 MES和20 mmol·L^-1乙酰丁香酮，在28℃和180 r·min^-1条件下扩大培养至OD₆₀₀在0.6左右，将菌体重悬于侵染缓冲液（5 g·L^-1葡萄糖、50 mmol·L^-1 MES、2 mmol·L^-1 Na₃PO₄·12H₂O，100 μmol·L^-1 ACE）中，调菌液OD₆₀₀在1.2左右，28℃孵育3 h，用注射器将侵染液注射至本生烟草叶片中，避光培养2~3 d，通过激光共聚焦显微镜观察烟草表皮细胞，判断ZmSPY蛋白的定位情况。

1.2.4 实时荧光定量PCR表达分析

通过RT-qPCR检测ZmSPY表达量的变化，从而探究其对不同激素处理的响应。分别于培养液中施加100 μmol·L^-1的赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、6-氨苄基嘌呤（6BA）、脱落酸（ABA），处理玉米B37根系3、6、12 h。提取总RNA，进行反转录，并稀释cDNA浓度至100 ng·uL^-1左右，以此为模板，以ZmUBQ为内参基因，使用实时荧光定量PCR检测ZmSPY基因的表达量。反应体系（20 μL）：TransStart Top Green qPCR Super Mix 10 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH₂O 7.2 μL。按照反应体系于冰上加样至96孔板，每个基因检测3组平行。实时荧光定量PCR设定程序如下：95℃ 5 min；变性95℃ 20 s，退火50℃ 15 s，延伸72℃ 15 s，以上循环45次；72℃继续延伸10 min。待程序运行完成后，将目标基因和内参基因扩增所得的Ct值，代入公式2^-△△Ct，计算得出基因的相对表达量，并进行分析。

1.2.5 数据分析

所有指标的检测至少重复进行3次，实验结果以平均值±标准差（$\stackrel{-}{x}\pm s$）表示，并作图。

2 结果与分析

2.1 ZmSPY保守结构域与氨基酸序列比对分析

通过NCBI网站的Conserved Domain Search Service（CD Search）模块对ZmSPY蛋白进行结构域分析，由图1: A可知，ZmSPY归属于TPR和SPY超家族，主要由TPR（tetratricopeptide repeats）结构域以及C端的催化结构域（catalytic domain）构成。之后，利用NCBI数据库检索获得拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）、高粱（Sorghum bicolor，Sb）、水稻（Oryza sativa，Os）、小麦（Triticum aestivum，Ta）等植物的SPY蛋白质序列，并进行多序列比对分析。由图1: B可知，不同物种中SPY蛋白高度保守，不同物种间的序列差异主要集中于蛋白结构的C末端附近。

2.2 ZmSPY蛋白质进化树分析

为了探究SPY在不同物种之间的亲缘关系及玉米ZmSPY的潜在生物学功能，使用MEGA11.0软件构建关于SPY蛋白的系统进化树。由图2可知，8个物种被分为两大类，玉米、高粱、柳枝稷（Panicum virgatum）、小麦、水稻、拟南芥为一组；狗尾草（Setaria viridis）、小米（Setaria italica var. germanica）为一组。其中，玉米与同为禾本科植物的高粱属同一支，说明氨基酸序列一致性最高，亲缘关系最近；其次玉米与禾本科植物柳枝稷进化关系密切。

2.3 ZmSPY蛋白质生物信息学分析

Expasy-ProtParam分析结果显示，ZmSPY共由911个氨基酸组成，分子式为C₄₄₇₆H₇₀₄₀N₁₂₀₄O₁₃₅₁S₅₄，相对分子质量约为101.07 kD，理论等电点为5.62，正负电荷残基总数分别为111和92，不稳定系数为39.45（＜40），脂溶性指数为87.85，总平均亲水性为-0.20。分析蛋白质的二级、三级结构，可为蛋白功能研究提供基础支撑（耿柳婷等，2023）。ZmSPY蛋白质的二级结构预测结果（图3: A）显示，ZmSPY蛋白由58.62%的α-螺旋、7.24%的延伸链、5.93%的β-转角和28.21%的无规卷曲共同组成。ZmSPY蛋白质的三级结构预测结果（图3: B）显示，α-螺旋是ZmSPY蛋白的主要构成元件。

Expasy-ProScale预测结果（图4: A）显示，ZmSPY蛋白属于亲水性蛋白，在氨基酸序列第334个位点处，亲水性最高；在氨基酸序列第145个位点处，疏水性最高。TMHMM 2.0 Server预测结果显示，ZmSPY蛋白不存在跨膜结构域。YinOYang1.2 Server预测结果（图4: B）显示，ZmSPY蛋白共有33个糖基化位点。Wolf Psort预测ZmSPY蛋白的亚细胞定位结果显示，该蛋白可能定位于细胞核、细胞质中，并且定位于细胞核的可能性更大。

2.4 ZmSPY基因的克隆和亚细胞定位研究

蛋白质的功能、代谢以及相互作用都与其亚细胞定位密切相关，成熟的蛋白质只有运输至特定的亚细胞结构或区域才能发挥正确的生物学功能（Wang &Balint-Kurti，2015）。Wolf Psort预测结果显示，ZmSPY蛋白定位于细胞核的可能性更大。为了验证此结果，通过GFP融合蛋白表达法来确定ZmSPY蛋白的亚细胞定位。通过克隆获得ZmSPY基因编码区全长片段（图5: A），大小为2 736 bp。连接、转化，挑取单菌落验证及提质粒酶切验证，结果显示PCR扩增片段、酶切片段的长度与目的片段大小一致（图5: B、C），表明成功构建了由农杆菌（GV3103）介导的pBIGD-ZmSPY-GFP表达载体。通过农杆菌转化使其在烟草表皮细胞中瞬时表达，结果（图6）显示对照组（pBIGD-GFP）胞内呈现分散非特异性的荧光信号，实验组（pBIGD-ZmSPY-GFP）仅在细胞核上观察到特异性的荧光信号，与细胞核经DAPI染色后呈现的蓝色荧光信号重叠，表明ZmSPY蛋白定位于细胞核中。

2.5 外源激素处理对ZmSPY基因表达量的影响

为探究ZmSPY可能参与的生物学过程，我们采用不同外源激素处理玉米根系，通过RT-qPCR检测ZmSPY表达量的变化，结果（图7）显示在受到不同外源激素（GA、IAA、6BA、ABA）处理后，ZmSPY表达水平随处理时间的变化表现出不同的变化趋势。在GA实验组的处理下，ZmSPY表达量始终表现为下调趋势，并且下调趋势随处理时间增长逐渐减弱。IAA、6BA实验组变化趋势一致，ZmSPY表达量整体呈现出随处理时间的增长先下调后上调的趋势。短时间（3 h）内ZmSPY基因表达水平均呈现下调趋势，其中受IAA处理的玉米根系中ZmSPY表达量下调幅度最为明显，当外源激素处理时间到达6 h及以上时，ZmSPY表达量转为上调且上调趋势逐渐升高。ABA实验组与IAA、6BA实验组变化趋势类似，不同之处在于当外源激素处理时间到达12 h时，ZmSPY表达量才转为上调且上调趋势不显著。以上结果表明，ZmSPY能够响应GA、IAA、6BA、ABA多种外源激素信号，并且表现出不同的应答模式。

3 讨论

蛋白质O-糖基化修饰是实现蛋白质功能多样化、动态调节胞内信号与细胞生理状态的关键过程（Zhang et al.，2019）。SPY同源蛋白广泛存在于许多物种，包括原核生物、原生生物、藻类和所有植物，本研究针对玉米SPY的结构和序列分析发现，ZmSPY蛋白C端的催化结构域包含N端（N-Cat）和C端（C-Cat），二者均具有GT41亚家族成员典型的Rossmann式折叠，此种结构能够增强酶与蛋白质底物结合的亲和力（Kawai et al.，2011）。C端催化结构域是SPY行使O-岩藻糖基化修饰功能的关键区域，该处差异可能使其结合蛋白质多样化，并动态调节其信号整合和生理状态。针对拟南芥SPY蛋白质晶体结构解析的研究显示，SPY的N-末端无序肽含有反式自体岩藻糖基化位点（trans auto-fucosylation sites），能够抑制其自身活性（Kumar et al.，2023）。基于SPY序列与进化的高度保守性，推测ZmSPY的N-末端无序肽也可能行使相似的生物学活性。此外，ZmSPY蛋白的TPR结构域包含12个TPR重复序列，能够在空间上形成一个狭长的超螺旋结构。TPRs超螺旋内壁上的一系列天冬氨酸负责结合底物蛋白，位于TPRs超螺旋中部的赖氨酸和丝氨酸参与，并决定SPY对蛋白质底物的选择性（Zhu et al.，2022）。Kumar等（2023）对拟南芥SPY的研究显示，其TPRs 1-5能够通过干扰蛋白质底物结合动态调节SPY的活性。同理，对于ZmSPY的TPRs结构域的深入研究也将进一步揭示玉米O-岩藻糖基化修饰的底物选择特征。

尽管SPY与人源OGT拥有高度同源的序列结构特征，但SPY被证实在植物中发挥新型核质蛋白O-岩藻糖基转移酶的功能，与OGT功能相异（Zhu et al.，2022）。Vasudevan和Haltiwanger（2014）的研究显示，大多数催化蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基发生O-岩藻糖基化修饰，主要由定位于内质网的蛋白O-岩藻糖基转移酶介导。在拟南芥中的研究结果显示，SPY于核质均可表达，并且主要存在于细胞核内（Zentella et al.，2023）。本文在玉米中的研究结果显示，ZmSPY也主要定位于细胞核。类SPY（SPY-like）蛋白在组织器官水平丰富的表达，说明O-岩藻糖基化修饰应是调节植物细胞内蛋白质功能广泛的蛋白质翻译后修饰方式。现有的研究结果显示，植物O-岩藻糖基化修饰的蛋白主要包括转录因子、核蛋白、激酶，以及涉及信号转导、新陈代谢等生理过程的关键蛋白（Mutanwad &Lucyshyn，2022），这些蛋白大部分为核内蛋白，暗示SPY介导O-岩藻糖基化修饰的区室化倾向。胞内生理生化过程的区室化现象在植物体中广泛存在，其可能对于提高产物稳定性（Zhang &Fernie，2021）、降低酶抑制效应（Alam et al.，2017），并防止不必要的催化串扰（Knudsen et al.，2018）具有重要意义。因此，我们推测SPY的核内定位可能有助于其识别且糖基化底物，从而稳定有效地调控植物体O-岩藻糖基化修饰水平稳定。

Jia和Yin（2017）的研究表明SPY在植物激素信号转导过程中发挥了重要作用。在拟南芥中，过表达SPY能够抑制种子的萌发，以及茎的伸长，并造成开花延迟和雄性不育等，呈现出GA生物合成缺陷表型（Bi et al.，2021）。在转基因矮牵牛花中，外源施加GA能够解除SPY异源表达对GA反应的抑制（Izhaki et al.，2010），进一步说明SPY与GA激素信号之间的密切关联。Sun等（2021）的研究结果显示，GA信号转导核心抑制因子DELLA受到SPY介导的O-岩藻糖基化修饰后形成活性更高的开放构象，进而促进DELLA与生长相关转录因子的结合，抑制植物生长发育。本研究实时荧光定量PCR的结果显示，外源施加GA处理能够降低ZmSPY的表达。此外，受到IAA、6BA和ABA处理后，玉米植株ZmSPY表达水平均随时间延长呈现先下调后上调的表达趋势，暗示ZmSPY与这些植物激素可能存在复杂的交互关系，并且可能通过介导植物激素信号网络的动态过程参与玉米的生长发育与胁迫应答，其内在机制仍需更为深入详细的研究。

参考文献