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血叶兰（Ludisia discolor）是兰科（Orchidaceae）血叶兰属多年生草本植物，因其根状茎匍匐，茎节明显，好似蚕卧于石上，因此又名“石蚕”“石上藕”（林振兴，2012）。血叶兰为常绿植物，既可赏花又可观叶，国内主要分布于海南、广东、广西、福建等地，喜生于山坡或沟谷常绿阔叶林阴湿处（中国科学院中国植物志编辑委员会，1999）。血叶兰全草入药，为药食同源植物，其味甘微涩、性凉（黄泽豪和沈贤娟，2013），《中华本草》记载其功效：“润肺、健脾、安神，主治肺结核咯血、神经衰弱、食欲不振等”（国家中医药管理局《中华本草》编委会，1999），海南黎族同胞常将适量血叶兰用水煎服或洗净后生咀服或捣汁服（戴好富和梅文莉，2010）。前期仅采用高效液相色谱法对血叶兰及其近缘种金线莲（Anoectochilus roxburghii）进行指纹图谱对比，发现血叶兰中含有芦丁、水仙苷、槲皮素、异槲皮苷等黄酮及其苷类化合物（杨漪等，2021; 王沙等，2023），至今尚未有对血叶兰中具体化学成分以及药理活性的相关报道。因此，为深入了解血叶兰中的化学成分，探究其活性物质，本研究对血叶兰乙醇提取物石油醚萃取相进行了GC-MS检测分析，同时对乙酸乙酯萃取相进行分离纯化，并对分离得到的单体化合物进行抗炎和抗氧化活性测试，为血叶兰资源的开发利用提供一定依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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血叶兰成年植株样品于2022年6月购自福建省热带作物科学研究所，人工栽培种。经福建省热带作物科学研究所郑涛研究员鉴定其为兰科血叶兰属血叶兰（Ludisia discolor）。凭证标本（XYL202206）存放于海南大学热带农林学院。
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1.2 仪器与试剂
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Heidolph Laborta20大型旋转蒸发仪（德国 Heidolph 公司）；安捷伦1260分析型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；安捷伦1260半制备型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；半制备色谱柱C18（4.6 mm ID×250 mm，日本 COSMOSIL 公司）；7820-5977气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦科技公司）；EYELA N-1300旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；BD-100A自动接样器（上海青浦沪西仪器厂）；Bruker AV-500型超导核磁仪（德国 Bruker 公司）；BP221S万分之一分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；ELX-800 酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；薄层层析硅胶板和层析柱硅胶G（60~80目，200~300目，青岛海洋化工集团公司）；MCI柱色谱小孔树脂（日本东京三菱化学公司）；凝胶Sephadex LH-20（德国 Merck 公司）；维生素C（德国 Sigma-Aldrich 公司）；Trolox（美国 MedChemExpress 公司）；K2S2O8、DPPH（上海麦克林生化科技有限公司）；ABTS（北京索莱宝科技有限公司）；实验室所用常规试剂均为分析纯。
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1.3 样品的提取
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血叶兰样品（鲜重30.0 kg）切成约1 cm的小段后用95%乙醇室温下浸提4次，得到465.5 g提取物，加入适量纯水制成悬浊液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得到石油醚萃取物39.8 g、乙酸乙酯萃取物40.1 g、正丁醇萃取物254.5 g。
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1.4 GC-MS分析条件
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气相色谱条件：采用HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）弹性石英毛细管柱；柱子的初始温度50℃，以5℃·min-1的速度升温到310℃，保持10 min；汽化室温度250℃；载气为高纯度的氦气（99.999%），流速1.0 mL·min-1；进样量1.0 μL，采用的进样方式为不分流进样，溶剂延迟时间4 min。
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质谱条件：电子轰击离子源（EI），能量70 eV，接口温度280℃，EI温度230℃，四极杆的温度150℃，调谐方式为标准调谐，电子倍增电压1 718 kV，质量扫描范围m/z 20~800（刘欣怡等，2022）。
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1.5 化合物的分离
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将乙酸乙酯萃取物（40.1 g）经硅胶减压柱色谱，以石油醚∶乙酸乙酯 [100∶1→1∶1，V/V（下同）]和氯仿∶甲醇（100∶1→1∶1）混合溶剂依次进行梯度洗脱，经薄层层析色谱（TLC）检测，合并后得到23个组分（Fr.1-Fr.23）。
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Fr.8（252.6 mg）经Sephadex LH-20 色谱柱以氯仿∶甲醇（1∶1）洗脱后得到3个组分（Fr.8.1-Fr.8.3）。Fr.8.1（33.1 mg）经硅胶柱色谱以石油醚∶乙酸乙酯（40∶1）为洗脱剂，分离得到化合物 13（8.2 mg）；Fr.8.2（49.0 mg）经硅胶柱色谱以石油醚∶氯仿∶异丙醇（100∶100∶0.01）为洗脱剂，分离得到化合物 14（5.9 mg）；Fr.8.3（170.5 mg）经反复正向硅胶柱色谱、Sephadex LH-20 色谱柱（甲醇），分离得到化合物12（2.9 mg）和化合物15（38.6 mg）；剩余组分（40.5 mg）经半制备高效液相色谱（C18柱，甲醇∶水=23∶77恒梯度洗脱；流速 4 mL·min-1；检测波长 210 nm），得到化合物 11（23.0 mg，tR=16.2 min）和化合物10（3.4 mg，tR=7.0 min）。Fr.10（135.5 mg）依次经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）、正向硅胶柱色谱（石油醚-乙酸乙酯60∶1）分离纯化，得到化合物 9（12.4 mg）；剩余组分（8.0 mg）经半制备高效液相色谱（C18柱，甲醇∶水= 40∶60恒梯度洗脱；流速 4 mL·min-1；检测波长 280 nm），分离得到化合物 7（0.5 mg，tR=35.0 min）。Fr.11（113.0 mg）依次经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）、半制备高效液相色谱（C18柱，甲醇∶水= 30∶70恒梯度洗脱；流速 4 mL·min-1；检测波长 280 nm），分离得到化合物 8（0.5 mg，tR=16.0 min）。Fr.13（153.0 mg）依次经Sephadex LH-20（甲醇）、正向硅胶色谱柱（氯仿）分离纯化，得到化合物 6（3.0 mg）。Fr.16（4.2 g）经小孔吸附树脂柱（MCI）以甲醇∶水（1∶9→1∶0）梯度洗脱得到11个组分（Fr.16.1-Fr.16.11）。Fr.16.2（34.0 mg）经硅胶柱色谱以氯仿为洗脱剂，得到组分Fr.16.2.1（9.8 mg），经半制备高效液相色谱（C18柱，甲醇∶水= 40∶60恒梯度洗脱；流速 4 mL·min-1；检测波长 230 nm），分离得到化合物 2（3.2 mg，tR=15.4 min）和化合物1（4.5 mg，tR=17.2 min）；Fr.16.4（210.4 mg）依次经Sephadex LH-20（甲醇）、半制备高效液相色谱（C18柱，甲醇∶水= 23∶77恒梯度洗脱；流速 4 mL·min-1；检测波长 210 nm），分离得到化合物 3（1.7 mg，tR=27.0 min）、化合物4（2.2 mg，tR=31.2 min）和化合物5 （3.0 mg，tR=49.1 min）。
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1.6 抗炎活性测试
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抗炎活性测试参考胡梦君（2017）的实验方法进行测试。
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选取RAW 264.7细胞，空白组为含脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的培养基，对照组为槲皮素，阴性对照组为DMSO，实验组加入单体化合物。用酶标仪在540 nm波长下每组平行测定3次，计算NO的抑制率。将初筛活性良好的化合物倍半稀释5个梯度，分别计算其抑制率，并计算其IC50。抑制率的公式如下：
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抑制率（%）=（A2-A1）/（A2-A0）×100；
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式中：A0表示空白对照组（不加LPS）吸光度值；A1表示实验组的吸光度值；A2表示阴性对照组（加LPS）的吸光度值。
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1.7 DPPH法抗氧化能力测试
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准确配制0.1 mol·mL-1 DPPH储备液，冷藏储存。配制维生素C（200 μg·mL-1）DMSO溶液作为阳性对照，称取样品用DMSO溶液溶解并配制成样品溶液（200 μg·mL-1）作为待测样品组，将对照组和待测组均稀释7个梯度。
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将稀释7个浓度的待测溶液分别取320 μL于1.5 mL离心管中，再加入320 μL DPPH储备液，摇匀后避光放置30 min，取200 μL加入96孔板中，重复3次；若样品颜色较深则需要减去样品本底吸收，本底组为320 μL DMSO溶液，加入乙醇溶液320 μL，取200 μL于96孔板中，重复3次。利用酶标仪检测在517 nm波长下每个孔的OD值（Hu et al.，2018）。
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计算化合物抗氧化能力的公式如下：
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式中：OD本底表示本底的吸光度值；OD样品表示待测样品的吸光度值；OD空白表示空白的吸光度值。
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1.8 TEAC法测定ABTS·+清除活性
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称取19.54 mg的ABTS·+溶于5 mL双蒸水中，3.32 mg的K2S2O8溶于88 μL双蒸水中，将两种溶液充分混匀后30℃避光处理12 h后，加入约200 mL蒸馏水稀释，通过酶标仪检测在734 nm波长处的吸光度，直至稀释到其OD值为（0.70 ± 0.02），配制成ABTS·+溶液。配制trolox（200 μg·mL-1）DMSO溶液作为阳性对照，称取样品用DMSO溶液溶解并配制成样品溶液（200 μg·mL-1）作为待测样品组，将对照组和待测组均稀释7个梯度。
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将稀释的7个浓度的待测液体分别取160 μL于1.5 mL离心管中，再加入480 μL ABTS·+溶液，摇匀后避光放置6 min，取200 μL加入96孔板中，重复3次；若样品颜色较深则需要减去样品本底吸收，本底组为160 μL DMSO溶液，加入乙醇溶液320 μL，取200 μL于96孔板中，重复3次。利用酶标仪检测在734 nm波长下每个孔的OD值（Payet et al.，2005）。
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计算化合物抗氧化能力的公式同1.7。
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2 结果与分析
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2.1 石油醚相GC-MS分析结果
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按上述GC-MS条件对石油醚萃取相的化学成分进行分析，得到总离子流色谱图（图1）。运用峰面积归一法计算化合物的相对百分含量，所鉴定出的化学成分及其含量分析结果见表1，共鉴定出17个化学成分，占总相对含量的81.35%。结果显示，相对含量较高的化学成分为棕榈酸甲酯（13.50%）、亚油酸甲酯（12.73%）、亚麻酸甲酯（8.74%）、2-单棕榈酸甘油（5.28%），共占相对含量的40.25%。其中，2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）为塑化剂（程畅等，2021），可能由于在样品初期提取时用塑料桶浸泡所致。GC-MS结果显示石油醚相的主要成分均为脂肪酸类化合物。
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2.2 结构鉴定
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利用硅胶、Sephadex LH-20 柱色谱和半制备高效液相色谱等各种色谱技术对乙酸乙酯萃取相进行分离纯化得到15个化合物，经质谱和核磁共振波谱分析，化合物结构鉴定如图2所示。
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图1 血叶兰石油醚萃取相GC-MS分析的总离子流量图
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Fig.1 GC-MS total ion flow diagram of petroleum ether phase from Ludisia discolor
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化合物1 淡黄色粉末（甲醇），分子式为C20H22O6，ESI-MS m/z: 359.4 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 6.71（1H，d，J =8.0Hz，H-5），6.69（1H，d，J =2.0 Hz，H-2），6.68（1H，d，J =8.0 Hz，H-5′），6.60（1H，dd，J =8.0，2.0 Hz，H-6），6.58（1H，d，J =1.9 Hz，H-2′），6.53（1H，dd，J =8.0，1.9 Hz，H-6′），4.18（1H，dd，J =9.0，7.1 Hz，H-9a′），3.94（1H，dd，J =9.1，7.4 Hz，H-9b′），3.81（3H，s，3′-OCH3），3.80（3H，s，3-OCH3），2.91（1H，dd，J =14.0，5.4 Hz，H-7a），2.84（1H，dd，J =14.0，7.0 Hz，H-7b），2.68（1H，m，H-8），2.55（2H，d，J =8.3 Hz，H-7′），2.51（1H，m，H-8′）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 181.6（C-9），149.0（C-3），149.0（C-3′），146.4（C-4），146.4（C-4′），131.4（C-1′），130.8（C-1），123.1（C-6），122.2（C-6′），116.2（C-5′），116.1（C-5），113.9（C-2），113.3（C-2′），72.9（C-9′），56.4（3-OCH3），56.4（3′-OCH3），47.8（C-8），42.6（C-8′），38.9（C-7′），35.4（C-7）。以上数据与文献（程艳刚等，2022）报道的基本一致，故鉴定化合物1为罗汉松脂素。
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化合物2 无色油状（甲醇），分子式为C20H22O6，ESI-MS m/z: 359.4 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 6.97（2H，d，J =1.9 Hz，H-2，2′），6.83（2H，dd，J =8.1，1.9 Hz，H-6，6′），6.79（2H，d，J =8.1 Hz，H-5，5′），4.73（2H，d，J =4.0 Hz，H-7，7′），4.25（2H，m，H-9a，9′a），3.88（6H，s，3-OCH3，3′-OCH3），3.85（2H，d，J =3.4 Hz，H-9b，9′b），3.16（2H，m，H-8，8′）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 149.1（C-3，3′），147.3（C-4，4′），133.8（C-1，1′），120.1（C-6，6′），116.1（C-5，5′），111.0（C-2，2′），87.6（C-7，7′），72.6（C-9，9′），56.4（3-OCH3，3′-OCH3），55.4（C-8，8′）。以上数据与文献（In et al.，2015; 魏云霞等，2023）报道的基本一致，故鉴定化合物2为（+）-松脂素。
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化合物3 白色粉末（甲醇），分子式为C11H18N2O3，ESI-MS m/z: 249.3 [M + Na]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 4.22（1H，ddd，J =9.5，6.6，2.1 Hz，H-9），4.09（1H，d，J =2.3 Hz，H-6），3.59（1H，m，H-3a），3.53（1H，m，H-3b），2.34（1H，m，H-5a），2.18（1H，m，H-10），2.07（1H，d，J =9.2 Hz，H-4a），2.03（1H，d，J =14.6 Hz，H-4b），1.96（1H，m，H-5b），1.46（1H，m，H-11a），1.34（1H，m，H-11b），1.09（3H，d，J =7.2 Hz，H-12），0.95（3H，t，J =7.5 Hz，H-13）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 172.4（C-1），167.2（C-7），61.3（C-6），60.0（C-9），46.2（C-3），37.1（C-11），29.6（C-5），25.5（C-10），23.2（C-4），15.6（C-12），12.6（C-13）。以上数据与文献（Yang et al.，2009）报道的基本一致，故鉴定化合物3为callyspongidipeptide A。
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注： — 表示未鉴定的化合物。
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Note: — indicates unidentified compounds.
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图2 化合物1-15结构
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Fig.2 Structures of compounds 1-15
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化合物4 白色粉末（甲醇），分子式为C11H18N2O2，ESI-MS m/z: 233.3 [M + Na]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 4.28（1H，ddd，J =9.3，7.0，1.8 Hz，H-9），4.15（1H，t，J =5.8 Hz，H-6），3.53（2H，m，H-3a，3b），2.34（1H，m，H-5a），2.07（1H，m，H-11），2.03（1H，s，H-4b），1.99（1H，m，H-10a），1.95（1H，m，H-5b），1.91（1H，d，J =3.4 Hz，H-4a），1.54（1H，d，J =8.0 Hz，H-10b），0.99（3H，d，J =6.3 Hz，H-12），0.97（3H，d，J =6.3 Hz，H-13）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 172.8（C-1），168.9（C-7），60.3（C-6），54.7（C-9），46.4（C-3），39.4（C-10），29.1（C-5），25.8（C-11），23.6（C-4），23.3（C-12），22.2（C-13）。以上数据与文献（张梦雪等，2021）报道的基本一致，故鉴定化合物4为环-[（S）-脯氨酸-（R）-亮氨酸]。
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化合物5 白色粉末（甲醇），分子式为C13H22O3，ESI-MS m/z: 227.3 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 6.91（1H，d，J =16.0 Hz，H-7），6.36（1H，d，J =16.0 Hz，H-8），3.85（1H，tt，J =11.6，4.6 Hz，H-4），2.30（3H，s，H-10），2.12（1H，m，H-6），1.71（2H，m，H-5），1.44（2H，m，H-3），1.07（3H，s，H-11），0.87（3H，s，H-12），0.83（3H，d，J =6.8 Hz，H-13）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 200.8（C-9），154.4（C-7），131.6（C-8），78.9（C-1），67.2（C-4），45.7（C-3），41.0（C-2），39.6（C-5），35.3（C-6），27.4（C-10），25.9（C-11），25.2（C-12），16.5（C-13）。以上数据与文献（Pauli et al.，1990；何珊等，2015）报道的基本一致，故鉴定化合物5为epi-boscialin。
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化合物6 黄色油状（甲醇），分子式为C16H22O4，ESI-MS m/z: 265.3 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 7.75（2H，d，J =5.7 Hz，H-3，5），7.65（2H，d，J =5.7 Hz，H-2，6），4.31（4H，t，J =6.6 Hz，H-9，9′），1.59（4H，m，H-10，10′），1.33（4H，m，H-11，11′），1.00（6H，t，J =7.5 Hz，H-12，12′）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 169.3（C-7，7′），133.6（C-1），132.4（C-4），132.3（C-2，6），129.9（C-3，5），66.7（C-9，9′），30.8（C-10，10′），20.3（C-11，11′），14.4（C-12，12′）。以上数据与文献（孙玉林等，2013）报道的基本一致，故鉴定化合物6为对苯二甲酸二丁酯。
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化合物7 无色晶体（甲醇），mp 138~140℃，分子式为C10H10O3，ESI-MS m/z: 201.2 [M + Na]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 7.64（1H，d，J =15.9 Hz，H-7），7.46（2H，d，J = 8.6 Hz，H-2，6），6.80（2H，d，J = 8.6 Hz，H-3，5），6.32（1H，d，J =15.9 Hz，H-8），3.79（3H，s，OCH3）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 168.9（C-9），162.6（C-4），146.8（C-7），131.2（C-3，5），126.5（C-1），116.0（C-2，6），114.3（C-8），51.7（C-OCH3）。以上数据与文献（龚小见等，2009）报道的基本一致，故鉴定化合物7为对香豆酸甲酯。
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化合物8 白色晶体（甲醇），mp 132~135℃，分子式为C8H8O2，ESI-MS m/z: 137.2 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 7.90（2H，d，J = 8.8 Hz，H-2，6），6.84（2H，d，J = 8.8 Hz，H-3，5），2.54（3H，s，CH3）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 197.8（C-7），161（C-4），132.2（C-2，6），131.6（C-1），116.4（C-3，5），26.3（C-8）。以上数据与文献（Lu et al.，2009; 马宏宇等，2010）报道的基本一致，故鉴定化合物8为对羟基苯乙酮。
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化合物9 白色晶体（甲醇），mp 114~122℃，分子式为C7H8O2，ESI-MS m/z: 125.1 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 7.16（2H，d，J =8.5 Hz，H-2，6），6.74（2H，J =8.5 Hz，H-3，5），4.48（2H，s，7-CH2）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 153.7（C-1），129.8（C-4），129.8（C-2，6），115.7（C-3，5），65.1（-CH2）。以上数据与文献（张伟和宋启示，2010）报道的基本一致，故鉴定化合物9为对羟基苯甲醇。
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化合物10 白色粉末（甲醇），分子式为C7H6O2，ESI-MS m/z: 123.1 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 9.53（1H，s，-CHO），7.63（2H，d，J =8.6 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J =8.6 Hz，H-3，5）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 192.1（-CHO），163.4（C-4），131.7（C-2，6），130.1（C-1），115.7（C-3，5）。以上数据与文献（徐寅鹏等，2013）报道的基本一致，故鉴定化合物10为对羟基苯甲醛。
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化合物11 白色粉末（甲醇），分子式为C8H8O3，ESI-MS m/z: 175.1 [M + Na]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 9.74（1H，s，-CHO），7.44（1H，br s，H-2），7.43（1H，d，J =7.8 Hz，H-6），6.94（1H，d，J =7.8 Hz，H-5），3.92（3H，s，3-OCH3）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 192.8（-CHO），155.2（C-4），149.8（C-3），130.9（C-1），128.0（C-2），116.4（C-5），111.3（C-6），56.4（3-OCH3）。以上数据与文献（陈根振等，2022）报道的基本一致，故鉴定化合物11为香草醛。
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化合物12 白色粉末（甲醇），分子式为C8H10O2，ESI-MS m/z: 139.2 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH: 7.15（2H，d，J =8.5 Hz，H-3，5），6.76（2H，d，J =8.5Hz，H-2，6），4.33（2H，s，H-7），3.31（3H，s，OCH3）; 13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δC: 158.3（C-1），130.8（C-3，5），130.0（C-4），116.1（C-2，6），75.5（C-7），57.8（C-OCH3）。以上数据与文献（刘新桥等，2011）报道的基本一致，故鉴定化合物12为4-（甲氧基甲基）苯酚。
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化合物13 白色结晶（氯仿），mp 136~140℃，分子式为C29H50O，ESI-MS m/z: 415.7 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δH: 3.55（1H，tt，J =11.5，4.8 Hz，H-3），5.37（1H，m，H-6），1.03（3H，s，H-19），0.94（3H，d，J =6.6 Hz，H-21），0.86（3H，t，J =7.5 Hz，H-29），0.85（3H，d，J =6.8 Hz，H-27），0.82（3H，d，J =6.8 Hz，H-26），0.71（3H，s，H-18）; 13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δC: 140.9（C-5），121.9（C-6），72.0（C-3），56.9（C-14），56.2（C-17），50.3（C-9），46.0（C-24），42.5（C-13），42.4（C-4），39.9（C-12），37.4（C-1），36.7（C-10），36.3（C-20），34.1（C-22），32.1（C-8），32.0（C-7），31.8（C-2），29.3（C-23），28.4（C-16），26.6（C-25），24.5（C-15），23.2（C-28），21.2（C-11），20.0（C-27），19.6（C-19），19.2（C-21），18.9（C-26），12.1（C-18），12.0（C-29）。以上数据与文献（徐寅鹏等，2013）报道的基本一致，故鉴定化合物13为β-谷甾醇。
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化合物14 白色粉末（氯仿），分子式为C14H28O2，ESI-MS m/z: 229.4 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δH: 2.37（2H，t，J =7.5 Hz，α-CH2），1.65（2H，m，β-CH2），0.90（3H，t，J =6.9Hz，14-CH3）; 13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δC: 179.4（C-1），34.1（C-2），32.1（C-12），29.9~29.2（C-4~11），24.8（C-3），22.1（C-13），14.3（C-14）。以上数据与文献（郭华等，2018）报道的基本一致，故鉴定化合物14为肉豆蔻酸。
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化合物15 白色晶体（氯仿），mp 61~62.5℃，分子式为C16H32O2，ESI-MS m/z: 257.4 [M + H]+。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δH: 2.37（2H，t，J =7.5 Hz，H-2），1.65（2H，m，H-3），1.25（24H，m，12×CH2，H-4~15），0.91（3H，td，J =6.8，4.7 Hz，H-16）; 13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δC: 179.8（C-1），34.2（C-2），32.1（C-3），29.9~29.2（C-4~13），24.8（C-14），22.8（C-15），14.3（C-16）。以上数据与文献（郭华等，2018）报道的基本一致，故鉴定化合物15为棕榈酸。
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2.3 生物活性测试
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对化合物1-6和化合物8-12进行抗炎活性筛选，以抑制LPS诱导RAW 264.7产生NO为模型，以槲皮素 [IC50 =（9.32±0.36） μmol·L-1]为阳性对照。初筛时化合物浓度为100 μmol·L-1，对抑制率大于50%（图3：A）的苯丙素类化合物1和化合物2进行复筛，测得其IC50值分别为（37.76±2.68） μmol·L-1和（53.14±1.63） μmol·L-1。
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用DPPH法对血叶兰中分离得到的化合物1-12进行抗氧化作用测试，以维生素C [IC50 =（6.01±0.17） μg·mL-1]为阳性对照。先对化合物进行初筛，浓度为200 μg·mL-1，继而对清除率大于50%（图3：B）的化合物1和化合物2进行复筛，测得其IC50值分别为（51.22±1.07） μg·mL-1和（79.22±7.44） μg·mL-1。用TEAC法对分离得到的化合物1-12进行抗氧化作用测试，以trolox [IC50 =（34.65±0.53） μg·mL-1]为阳性对照。先对化合物进行初筛，浓度为200 μg·mL-1，再对清除率大于50%（图3:C）的化合物进行复筛，并测定其IC50值。其结果表明，化合物7、化合物9和化合物12均具有清除ABTS·+自由基的能力，其IC50值分别为（41.36±0.40） μg·mL-1、（56.23±3.39） μg·mL-1和（50.72±2.24） μg·mL-1；苯丙素类化合物1和化合物2则表现出较强的活性，其IC50值分别为（2.21±0.01） μg·mL-1和（3.58±0.17） μg·mL-1。化合物7、化合物9和化合物12在DPPH法测试中未检测到抗氧化能力，可能是由于不同检测方法中化合物对不同的自由基清除力不同，因此有待进一步用其他方法验证。
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3 讨论与结论
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对血叶兰的石油醚萃取相进行GC-MS分析结果显示其相对含量较高的化学成分为棕榈酸甲酯（13.50%）、亚油酸甲酯（12.73%）、亚麻酸甲酯（8.74%）、2-单棕榈酸甘油（5.28%），占相对含量的40.25%，均为脂肪酸类化合物。
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从血叶兰的乙酸乙酯萃取相中分离鉴定了15个化合物，分别是罗汉松脂素（1）、（+）-松脂素（2）、callyspongidipeptide A（3）、环-[（S）-脯氨酸-（R）-亮氨酸]（4）、epi-boscialin（5）、对苯二甲酸二丁酯（6）、对香豆酸甲酯（7）、对羟基苯乙酮（8）、对羟基苯甲醇（9）、对羟基苯甲醛（10）、香草醛（11）、4-（甲氧基甲基）苯酚（12）、β-谷甾醇（13）、肉豆蔻酸（14）和棕榈酸（15），均为首次从血叶兰中分离得到。在抗炎活性方面，化合物1和化合物2具有较弱的抗炎活性，其IC50值分别为（37.76±2.68）μmol·L-1和（53.14±1.63）μmol·L-1。
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图3 化合物对NO的产生抑制率（A），对DPPH 自由基清除率（B）和对ABTS·+清除率（C）
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Fig.3 NO inhibition rate (A) , DPPH free radical clearance rate (B) , ABTS·+ clearance rate (C) of compounds
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天然物质的抗运动性疲劳活性的内在机理主要包括抑制神经递质的累积、增加机体能量物质储备、维持氧化还原稳态、减少代谢物堆积等（倪冰倩等，2023）。植物活性物质的抗氧化与抗疲劳性具有相关性（薛勇闯等，2020）。石鹤坤等（2016）研究表明血叶兰的提取液具有较好的抗运动性疲劳活性，李秋静等（2021）通过多酚含量测定、DPPH清除率测定等证明血叶兰60%醇提液在体内外具有明显的抗氧化活性。本研究对分离得到的化合物进行了抗氧化活性测试，其中化合物1、化合物2、化合物7、化合物9和化合物12均显示具有一定的抗氧化活性，而这些化合物结构上均属于酚类化合物，进一步明确了血叶兰中的抗氧化活性成分，也为后续的深入研究提供了化学结构基础。在ABTS·+清除活性测试中，化合物9和化合物12显示出一定的抗氧化活性，通过构效关系分析表明，化合物8-12结构相似，但化合物9和化合物12具有对羟基苯乙基基团。因此推测，对羟基苯乙基基团可能是该类化合物的抗氧化活性基团。
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血叶兰为血叶兰属（Ludisia）的旗舰物种，兼具观赏和药用价值，极具开发潜力。目前，对血叶兰的研究主要集中在生物学性状（李洪燕等，2014）、物候（吴文碟等，2019）、野生资源分布状况（张泽宏等，2014）、菌根研究（Poobathy et al.，2019）以及栽培研究现状（陈耀丽等，2023）等。本研究从血叶兰乙醇提取物的乙酸乙酯相中分离得到的化合物结构多样，包括甾体类、脂肪酸类、酚酸类、苯丙素类、环二肽类、萜类等，后续将继续对血叶兰中的化学成分进行分离纯化并进行相关生物活性测试，进一步完善其在化学成分和生物活性方面的研究。
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参考文献
-
CHEN GZ, WANG HD, PEI D, et al. , 2022. Chemical components of antioxidant extract in Olea europaea pomace [J]. Guihaia, 42(9): 1498-1506. [陈根振, 王蝴蝶, 裴栋, 等, 2022. 油橄榄果渣抗氧化部位化学成分的研究 [J]. 广西植物, 42(9): 1498-1506.
-
CHEN YL, YOU YP, ZHONG YF, et al. , 2023. A primary study on the aseptic seeding and rapid propagation of Hainan Li nationality medicinal plant Ludisia discolor [J]. Trop For, 51(1): 40-45. [陈耀丽, 尤燕平, 钟云芳, 等, 2023. 海南黎药血叶兰的无菌播种及高效繁育技术初探 [J]. 热带林业, 51(1): 40-45. ]
-
CHENG C, LU LX, PAN L, et al. , 2021. Determination of 7 antioxidants in rubber seal gaskets for food contact by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. J Instr Anal, 40(7): 1074-1079. [程畅, 卢立新, 潘嘹, 等, 2021. 液相色谱-串联质谱法测定食品接触橡胶密封垫圈中7种抗氧化剂 [J]. 分析测试学报, 40(7): 1074-1079. ]
-
CHENG YG, TAN JY, LI JL, et al. , 2022. Chemical constituents from the ethyl acetate layer of aerial parts of Polygala tenuifolia [J]. Chin Med Mat, 45(2): 331-334. [程艳刚, 谭金燕, 李建丽, 等, 2022. 远志地上部分乙酸乙酯层化学成分研究 [J]. 中药材, 45(2): 331-334. ]
-
DAI HF, MEI WL, 2010. Records of Li Folk Medicine: Vol. 2 [M]. Beijing: Science and Technology of China Press: 234-235. [戴好富, 梅文莉, 2010. 黎族药志（第二册） [M]. 北京: 中国科学技术出版社: 234-235. ]
-
Editorial Committee of Flora Reipublicae Popularis, CAS, 1999. Florae Reipublicae Popularis Sinicae: Vol. 18 [M]. Beijing: Science Press: 157. [中国科学院中国植物志编辑委员会, 1999. 中国植物志: 第 18 卷 [M]. 北京: 科学出版社: 157. ]
-
Editorial Committee of the Chinese Materia Medica of the State Administration of Traditional Chinese Medicine, 1999. Chinese Materia Medica: Vol. 8 [M]. Shanghai: Shanghai Scientific & Technical Publishers : 737. [国家中医药管理局《中华本草》编委会, 1999. 中华本草（第八册） [M]. 上海: 上海科学技术出版社: 737. ]
-
GONG XJ, ZHOU X, CAI ZW, et al. , 2009. Studies on chemical constituents of Evodia rutaecarpa [J]. Chin J Chin Mat Med, 34(2): 177-179. [龚小见, 周欣, 蔡宗苇, 等, 2009. 黔产吴茱萸化学成分研究 [J]. 中国中药杂志, 34(2): 177-179. ]
-
GUO H, DIAO QP, ZHANG B, et al. , 2018. Chemical constituents from Pholiota nameko [J]. Chin Med Mat, 41(2): 350-352. [郭华, 刁全平, 张博, 等, 2018. 光滑环锈伞的化学成分研究 [J]. 中药材, 41(2): 350-352. ]
-
HE S, JIANG Y, TU PF, 2015. Chemical constituents from Cinnamomum cassia [J]. Chin J Chin Mat Med, 40(18): 3598-3602. [何珊, 姜勇, 屠鹏飞, 2015. 肉桂的化学成分研究 [J]. 中国中药杂志, 40(18): 3598-3602. ]
-
HU HB, LIANG HP, LI HM, et al. , 2018. Isolation, purification, characterization and antioxidant activity of polysaccharides from the stem barks of Acanthopanax leucorrhizus [J]. Carbohydr Polym, 196: 359-367.
-
HU MJ, 2017. The anti-inflammatory effect and mechanism of flavonoids in exocarpiun citri grandis on LPS-induced RAW 264. 7 cell [D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University: 45-49. [胡梦君, 2017. 化橘红黄酮对LPS诱导的RAW 264. 7细胞的抗炎作用及其机制探究 [D]. 武汉: 华中农业大学: 45-49. ]
-
HUANG ZH, SHEN XJ, 2013. Pharmacognostic identification of folk-herb Gongshisong in Southern Fujian, China [J]. Subtrop Plant Sci, 42(4): 288-292. [黄泽豪, 沈贤娟, 2013. 闽南民间药公石松的生药鉴定 [J]. 亚热带植物科学, 42(4): 288-292. ]
-
IN SJ, SEO KH, SONG NY, et al. , 2015. Lignans and neolignans from the stems of Vibrunum erosum and their neuroprotective and anti-inflammatory activity [J]. Arch Pharm Res, 38(1): 26-34.
-
LI HY, LUO MN, HUANG SM, et al. , 2014. Microstructural analysis and characterization of Ludisia discolor [J]. Jiangsu Agric Sci, 42(11): 275-277. [李洪燕, 罗曼妮, 黄少漫, 等, 2014. 血叶兰显微结构分析与性状描述 [J]. 江苏农业科学, 42(11): 275-277. ]
-
LI QJ, CHEN YQ, LIN MZ, et al. , 2021. Study on antioxidant activity of the extract from Ludisia discolor [J]. Chin Med Modern Distance Educ Chin, 19(10): 156-159. [李秋静, 陈育青, 林美珍, 等, 2021. 公石松提取液抗氧化研究 [J]. 中国中医药现代远程教育, 19(10): 156-159. ]
-
LIN ZX, 2012. Research progress on ornamental southern medicinal resource of Ludisia discolor [J]. Fujian Sci Technol Trop Crops, 37(2): 4-5. [林振兴, 2012. 观赏南药资源血叶兰的研究进展 [J]. 福建热作科技, 37(2): 4-5. ]
-
LIU XQ, WAN DR, YUAN QY, 2011. Chemical constituents from Pleione bulbocodioides [J]. Chin J Hosp Pharm, 31(19): 1649-1650. [刘新桥, 万定荣, 袁桥玉, 2011. 中药独蒜兰的化学成分 [J]. 中国医院药学杂志, 31(19): 1649-1650. ]
-
LIU XY, WANG YL, WANG H, at al. , 2022. GC-MS analysis of chemical constituents of volatile oil from four kinds of agarwood tree leaves [J]. Chin J Trop Crops, 43(1): 196-206. [刘欣怡, 王雅丽, 王昊, 等, 2022. 4种沉香树叶片挥发油化学成分GC-MS分析 [J]. 热带作物学报, 43(1): 196-206. ]
-
LU XL, SHEN YH, ZHU YP, et al. , 2009. Diketopiperazine constituents of marine Bacillus subtilis [J]. Chem Nat Compd, 45(2): 290-292.
-
MA HY, SUN Y, LÜ AL, at al. , 2010. Isolation and identification of chemical constituents from Artemisia capillaries Thunb. [J]. Chin J Chin Mat Med, 20(1): 61-63. [马宏宇, 孙奕, 吕阿丽, 等, 2010. 茵陈蒿化学成分的分离与鉴定 [J]. 中国药物化学杂志, 20(1): 61-63. ]
-
NI BQ, LI XT, ZHANG CN, et al. , 2023. Research progress in molecular mechanism of anti-exercise fatigue activity of natural substances [J]. Food Res Dev, 44(10): 208-214. [倪冰倩, 李秀婷, 张成楠, 等, 2023. 天然物质抗运动性疲劳活性分子机理的研究进展 [J]. 食品研究与开发, 44(10): 208-214. ]
-
PAULI N, SEQUIN U, WALTER A, 1990. Boscialin and boscialin 4′-O-glucoside, two new compounds isolated from the leaves of Boscia salicifolia Oliv [J]. Helv Chim Acta, 73(3): 578-582.
-
PAYET B, ALAIN S, SMADJA J, 2005. Assessment of antioxidant activity of cane brown sugars by ABTS and DPPH radical scavenging assays: determination of their polyphenolic and volatile constituents [J]. J Agric Food Chem, 53(26): 10074-10079.
-
POOBATHY R, ZAKARIA R, MURUGAIYAH V, et al. , 2019. Surface sterilization and micropropagation of Ludisia discolor [J]. Biocatal Agric Biotechnol, 22: 101380.
-
SHI HK, QIU YL, CHEN KJ, et al. , 2016. Screening of Gongshisong's active sites for anti-sports fatigue [J]. Chin Pharm, 27(10): 1343-1346. [石鹤坤, 邱韵玲, 陈开杰, 等, 2016. 公石松抗运动性疲劳的活性部位筛选 [J]. 中国药房, 27(10): 1343-1346. ]
-
SUN YL, CHEN Y, XU XY, et al. , 2013. Secondary metabolites of marine-derived fungus Penicillium oxalicum SCSGAF 0023 and their antifouling and enzyme-inhibitory activities [J]. Nat Prod Res Dev, 25(1): 1-6. [孙玉林, 陈茵, 徐新亚, 等, 2013. 海洋真菌Penicillium oxalicum SCSGAF 0023的次生代谢产物及其抗污损和酶抑制活性研究 [J]. 天然产物研究与开发, 25(1): 1-6. ]
-
WANG S, XUE MH, ZHANG Y, et al. , 2023. Comparison of flavonoid constituents between Gongshisong and Anoectochilus roxburahii [J]. Fujian Test Anal, 32(2): 1-4. [王沙, 薛梅花, 张颖, 等, 2023. 公石松与金线莲中黄酮类化合物成分对比研究 [J]. 福建分析测试, 32(2): 1-4. ]
-
WEI YX, WANG XY, WANG WH, et al. , 2023. Active components of latent HIV activation in leaves and branches of Wikstroemia chamaedaphne [J]. Chin Trad Herb Drugs, 54(2): 465-472. [魏云霞, 王修艺, 王雯皓, 等, 2023. 河朔荛花枝叶中激活潜伏HIV的活性成分研究 [J]. 中草药, 54(2): 465-472. ]
-
WU WD, HE SH, SONG XQ, et al. , 2019. Floral phenology and breeding system of Ludisia discolor (Orchidaceae) in Hainan [J]. Mol Plant Breed, 17(5): 1667-1672. [吴文碟, 何淑慧, 宋希强, 等, 2019. 海南血叶兰开花物候及其繁育系统 [J]. 分子植物育种, 17(5): 1667-1672. ]
-
XU YP, SHI JM, GUO MM, et al. , 2013. Chemical constituents in ethyl acetate fraction of Abelmoschus esculentus [J]. Nat Prod Res Dev, 25(1): 56-59. [徐寅鹏, 石金敏, 郭明明, 等, 2013. 黄秋葵乙酸乙酯部位化学成分的研究 [J]. 天然产物研究与开发, 25(1): 56-59. ]
-
XUE YC, ZHOU YL, CHEN GL, 2020. Study on antioxidant activity and anti-fatigue activity of Solanum nigrum extract [J]. Cereals Oils, 33(11): 126-128. [薛勇闯, 周永玲, 陈国亮, 2020. 龙葵果提取物抗氧化活性及抗疲劳作用的研究 [J]. 粮食与油脂, 33(11): 126-128. ]
-
YANG B, DONG JD, ZHOU XF, et al. , 2009. Proline-containing dipeptides from a marine sponge of a Callyspongia species [J]. Helv Chim Acta, 92(6): 1112-1117.
-
YANG Y, HUANG XX, ZHANG JJ, et al. , 2021. Study on UPLC fingerprint of Anoectochilus roxburghii and its related species Ludisia discolor [J]. Guangzhou Chem Ind, 49(15): 134-137. [杨漪, 黄晓萱, 张嘉嘉等, 2021. 金线莲及其近缘品血叶兰UPLC指纹图谱研究 [J]. 广州化工, 49(15): 134-137. ]
-
ZHANG MX, LI HH, SHAO F, et al. , 2021. Secondary metabolites from a marine sponge-derived actinomycete Streptomyces parvulus MA1076 [J]. Mar Fish, 43(4): 464-472. [张梦雪, 李欢欢, 邵峰, 等, 2021. 海绵共附生放线菌Streptomyces parvulus MA1076的次级代谢产物研究 [J]. 海洋渔业, 43(4): 464-472. ]
-
ZHANG ZH, HONG LC, SUN LQ, 2014. Resources investigation and exploitation measures of the plant Gongshisong [J]. J Yibin Univ, 14(6): 46-48. [张泽宏, 洪丽纯, 孙连青, 2014. 药用经济植物公石松的资源调查及开发利用 [J]. 宜宾学院学报, 14(6): 46-48. ]
-
ZHANG W, SONG QS, 2010. Chemical compoment analysis on Gastrodia elata Blume cultivated in Guizhou Dafang forest [J]. Chin Trad Herb Drug, 41(11): 1782-1785. [张伟, 宋启示, 2010. 贵州大方林下栽培天麻的化学成分研究 [J]. 中草药, 41(11): 1782-1785. ]
-
摘要
为探究血叶兰（Ludisia discolor）的化学成分和生物活性，该研究利用气相色谱-质谱（GC-MS）分析乙醇提取物石油醚萃取相的化合物，利用硅胶、Sephadex LH-20和半制备高效液相等多种色谱技术对乙酸乙酯萃取相进行分离纯化，运用质谱和核磁共振波谱分析鉴定化合物结构，并对分离得到的化合物进行抗炎和抗氧化活性测试。结果表明：（1）从石油醚萃取相中共鉴定出17个化合物，其中棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、2-单棕榈酸甘油4个化合物具有较高的相对含量。（2）从乙酸乙酯萃取相中分离得到15个化合物，其结构分别鉴定为罗汉松脂素（1）、(+)-松脂素（2）、callyspongidipeptide A（3）、环- [(S)-脯氨酸-(R)-亮氨酸]（4）、epi-boscialin（5）、对苯二甲酸二丁酯（6）、对香豆酸甲酯（7）、对羟基苯乙酮（8）、对羟基苯甲醇（9）、对羟基苯甲醛（10）、香草醛（11）、4-(甲氧基甲基)苯酚（12）、β-谷甾醇（13）、肉豆蔻酸（14）和棕榈酸（15），化合物1-15均为首次从血叶兰中分离得到。（3）化合物1和化合物2具有一定抑制LPS诱导RAW 264.7产生NO的作用，其IC50分别为（37.76±2.68）和（53.14±1.63） μmol·L-1 [阳性对照槲皮素IC50 值为（9.32±0.36） μmol·L-1]；抗氧化结果显示，化合物1和化合物2对DPPH自由基具有一定清除能力，IC50值分别为（51.22±1.07）和（79.22±7.44） μg·mL-1 [阳性对照维生素C IC50值为（6.01±0.17） μg·mL-1]；同时，这两个化合物对ABTS·+自由基表现出强于阳性对照trolox [IC50 =（34.65±0.53） μg·mL-1]的清除能力，其IC50值分别为（2.21±0.01）和（3.58±0.17） μg·mL-1。该研究丰富了血叶兰的化学成分，进一步明确了其抗氧化和抗炎活性成分，为后续药理活性的深入研究提供了化学结构基础。
Abstract
In order to explore the chemical constituents and their biological activities of Ludisia discolor, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) was carried out to analyze the chemical constituents of petroleum ether fraction of ethanol extracts. Meanwhile, the compounds were isolated from the ethyl acetate fraction by using various column chromatography including silica gel, Sephadex LH-20, and semi-preparative HPLC. MS and nuclear mgnetic resonance (NMR) spectroscopic analysis were used to identify the structure of the compounds. And then the isolated compounds were tested for anti-inflammatory with RAW 264.7 cells, and antioxidant activities were carried out with DPPH and ABTS·+ free radical scavenging ability. The results showed as follows: (1) A total of 17 compounds were identified from the petroleum ether fraction of L. discolor, in which, methyl palmitate, methyl linoleate, methyl linolenic acid, and 2-monopalmitin had a relatively high content. (2) A total of 15 compounds were isolated from the ethyl acetate fraction, their structures were identified as matairesinol (1), (+)-pinoresinol (2), callyspongidipeptide A (3), cyclo- [(S)-Pro-(R)-Leu] (4), epi-boscialin (5), dibutyl terephthalate (6), methyl 4-hydroxycinnamate (7), 1-(4-hydroxyphenyl) ethanone (8), 4-hydroxybenzyl alcohol (9), p-hydroxy-benzaldehyde (10), vanillin (11), 4-(methoxym-ethyl) phenol (12), β-sitosterol (13), tetradecanoic acid (14), and palmitic acid (15), respectively. Compounds 1-15 were isolated from L. discolor for the first time. (3) Phenylpropanoid compounds 1 and 2 showed moderate inhibition on NO production from RAW 264.7 cells induced by LPS, with IC50 values of (37.76 ± 2.68) μmol·L-1 and (53.14 ± 1.63) μmol·L-1 [(quercetin as the positive control, with IC50 value of (9.32 ± 0.36) μmol·L-1], respectively. Antioxidant results showed that compounds 1 and 2 had moderate DPPH free radical scavenging ability, with IC50 values of (51.22 ± 1.07) μg·mL-1 and (79.22 ± 7.44) μg·mL-1 [vitamin C as the positive control, with IC50 value of (6.01±0.17) μg·mL-1], respectively. Meanwhile, they had stronger ABTS·+ free radical scavenging ability than the positive control trolox [IC50 = (34.65 ± 0.53) μg·mL-1], with IC50 values of (2.21 ± 0.01) μg·mL-1 and (3.58 ± 0.17) μg·mL-1, respectively. Overall, this study enriched the chemical constituents of L. discolor, and it was further clarified that phenolic compounds are the active antioxidant constituents in L. discolor, and phenylpropanoid compounds have certain anti-inflammatory activities, which provides a chemical structure basis for subsequent in-depth pharmacological research.
