植物纤维素合酶是由36个单体组成的玫瑰状复合体，其单体主要由纤维素合成酶基因家族成员编码，纤维素（cellulose）是植物细胞壁的主要成分（姚敦义和王静之，1988），在细胞生长、分化、信号转导等过程中起到重要作用（解盛等，2021）。纤维素合酶（cellulose synthases A，CesA）是合成纤维素的酶（Doblin et al.，2002），本质上属于糖基转移酶，最初在革兰氏阴性细菌醋杆菌中被鉴定（Wong et al.，1990）。高等植物纤维素合成酶复合体中，有不少于3种CesA亚型参与（Doblin et al.，2002），CesA亚基彼此相互作用形成高级复合物。迄今为止，CesA基因家族已在模式植物拟南芥（Pear et al.，1996）、水稻（Huang et al.，2015）、烟草（徐宗昌和孔英珍，2017）中鉴定出来，其中拟南芥CesA基因的研究最为深入（Richmond，2000）。拟南芥基因组拥有10个CesA基因（CesA1-10），它们编码与细菌纤维素合成酶同源的蛋白（Pear et al.，1996）; 生细胞壁的形成需要3种类型的CesA亚基（CesA4/不规则XYLEM5 [IRX5]，CesA7/IRX3和CesA8/IRX1）（Hernández-Blanco et al.，2007），CesA3基因突变使纤维素合成水平降低，通过茉莉酸和乙烯等信号通路激活木质素合成和防御反应（Caño-Delgado et al.，2003）; 在水稻基因组中共鉴定到11个OsCesA 基因，水稻中的赤霉素信号转导可以通过促进纤维素的合成，进而影响水稻植株节间的发育（Huang et al.，2015）; 此外，烟草基因组中鉴定出21个NtCesA基因，NtCesA7、NtCesA9、NtCesA11、NtCesA16、NtCesA18等基因主要参与烟草次生细胞壁纤维素的合成（徐宗昌和孔英珍，2017）。除模式植物外，玉米（Appenzeller et al.，2004）、棉花（孟成生等，2012）、巨龙竹（王文治等，2021）、紫花苜蓿（刘希强等，2018）、罗布麻（解盛等，2021）等多种非模式植物中也鉴定出CesA基因。从玉米中鉴定出12个不同的ZmCesA基因，在初级或次级细胞壁合成的独特细胞类型中表达（Doblin et al.，2002）。棉花中鉴定出18个CesA基因（孟成生等，2012）; 巨龙竹中鉴定出45个CesA基因（王文治等，2021）。紫花苜蓿盛花期CesA基因表达水平显著提高，纤维素含量大幅增加（刘希强等，2018）。罗布麻CesA基因家族包含的大量光响应、胁迫响应、激素响应等元件，在植株生长发育与抗逆防御方面发挥着作用（解盛等，2021）。

白菜（Brassica rapa var. glabra）属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）2年生草本植物，原产于我国，栽培历史悠久，年种植面积180万hm²左右（张凤兰等，2021），是人们日常餐桌上必不可少的蔬菜。2011年，白菜全基因组测序工作完成（Wang et al.，2011），2017年获得了升级的v2.5版本（Cai et al.，2017），2018年获得了白菜参考基因组v3.0新版本（Zhang et al.，2018），为后续开展白菜基因研究奠定了坚实的基础（Chen et al.，2020）。目前，CesA基因家族在白菜中还未进行深入鉴定与分析。本研究以白菜的全基因组序列为研究区域，依托在线软件与qRT-PCR分析，采用生物信息学方法，通过对CesA基因家族的结构、进化特征、组织表达等进行系统鉴定，拟探讨以下问题:（1）白菜CesA基因家族的遗传进化规律;（2）该家族成员的理化性质;（3）该家族成员的基因结构、蛋白质二级结构及保守结构域;（4）该家族成员在各组织中的表达模式以及在盐胁迫下的表达模式。

1 材料与方法

1.1 基因家族成员鉴定及理化性质分析

根据拟南芥已经鉴定的10个CesA基因序列，通过BLAST在白菜基因组（B. rapa var. glabra genome v1.5）中搜索候选的白菜CesA家族成员，并通过综合分析确定候选基因。使用TBtools软件（Chen et al.，2020）结合Expasy（Wang et al.，2012）（https://www.expasy.org/）分析白菜CesA基因家族的蛋白质分子量（molecular weight，MW）、等电点（pI）等理化性质。

1.2 基因结构及保守结构域分析

利用TBTools软件绘制白菜CesA基因结构图; 利用MEME（Kumar et al.，1994）（http://meme-suit.org/tools/meme）在线预测CesA蛋白质基序。TBtools软件（https://github.com/）绘制可视化MEME结构，并进行基因结构分析。

1.3 基因在染色体上的分布及共线性关系分析

通过白菜基因组数据库对鉴定获得的CesA基因家族成员进行染色体分析，利用TBTools软件作图进行分析。使用BLAST比对，合并、建库、蛋白对比; 运行MCScanX（Bolser et al.，2003），进行下游分析及可视化作图，从而进行共线性分析，得到共线性图。

1.4 亚细胞定位预测和蛋白质二级与三级结构分析

使用WoLF PSORT（http://www.genscript.com/wolf-psort.html）进行亚细胞定位PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）进行蛋白二级结构分析。利用Phyre2（Kelley et al.，2015）（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/ html/page.cgi?id=index）对白菜CesA蛋白进行三级结构预测。

1.5 白菜CesA基因家族成员蛋白跨膜螺旋与三级结构预测

利用TMHMM Server v2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对白菜CesA蛋白跨膜螺旋进行预测。

1.6 C白菜CesA基因表达分析

以“蛋黄白”白菜品种为实验材料。提取30 d苗龄的根、茎、叶和80 d苗龄的花和果荚的RNA，进行组织特异性表达分析。挑选生长状况相近的白菜幼苗浸泡于用Hoagland营养液配制的150 mmol·L^-1 NaCl溶液中，12 h后进行材料的RNA提取，并以正常水培幼苗为对照，进行盐胁迫下基因表达分析。

使用qPrimerDB-qPCR Primer Database（https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/）（Li et al.，2017）设计qRT-PCR引物，以BraActin 2为内参基因（表1）。使用RNA提取试剂盒提取样品总RNA，使用HiScript Ⅱ QRT SuperMix for qPCR试剂盒反转录得到cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行定量实验。反应体系20 μL:2 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，SYBR 10 μL，用灭菌dd H₂O补至20 μL。PCR反应程序:95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火22 s，进行40个循环。基因的相对表达量以2^-ΔΔCt法计算。所得数据通过TBtools进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 白菜CesA基因家族成员的鉴定与理化性质分析

经筛选鉴定，得到16个白菜CesA基因家族成员（表2），分析结果表明白菜CesA家族蛋白等电点介于4.76~9.12之间，酸性蛋白与碱性蛋白的数量相近，分别为7个和9个。分子量介于17.76 kD~122.67 kD之间。Bra011865的氨基酸数目最多，Bra004814、Bra010691蛋白的氨基酸数目显著少于其他成员。

2.2 白菜CesA家族基因系统进化分析

许多物种中都有CesA家族同源基因的进化与表达（表3）。为了解白菜CesA基因家族与拟南芥CesA基因家族之间的进化关系，利用MEGA-X软件，对两者的CesA基因家族成员进行的系统进化分析（图1）结果表明，白菜CesA基因家族与拟南芥CesA基因家族有相近的进化关系。CesA基因可以分为4个亚族，共发现有5个白菜CesA（Bra006407、Bra012578、Bra033714、Bra011865、Bra006036）与拟南芥CesA具有高度同源性，表明这5对基因具有高度的亲缘关系。通过对基因分化时间预测，在基因进化的角度推测以CesA1出现时间最早。

2.3 白菜CesA家族基因的结构和保守结构域分析

利用TBtools对16个白菜CesA基因家族成员进行基因结构分析（图2）。该家族成员大都包含4~14个内显子。其中5个基因含有14个CDS序列，3个基因含有13个CDS序列，4个基因含有12个CDS序列，Bra033714含11个CDS序列，Bra010691含6个CDS序列，Bra004814含有5个CDS序列，Bra036008含有4个CDS序列。表明部分家族基因结构间存在较大差异，具有丰富的多样性。

利用MEME/MAST程序进行蛋白保守结构域分析（图3），共鉴定到10种motif，大部分成员含有相同的motif组成。均含有一个保守的motif 1; Bra011345基因中含有motif 1~10及一个重复的motif 6; Bra011865基因中含有motif 1~10及一个重复的motif 8，推测具有差异的基因在白菜生长周期中发挥不同于其他的作用。利用DNAMAN对白菜CesA进行氨基酸序列进比对（图4）显示，除了Bra010691、Bra036008和Bra004814，其余家族基因都含有CesA蛋白典型DDD-QXXRW 保守功能域，与拟南芥CesA蛋白具有相同的保守功能域（Delmer，1999）。

注: 拟南芥ID栏为物种基因家族对应同源基因; — 表示无对应基因。

Note: ID column of Arabidopsis thaliana is the corresponding homologous gene of the species gene family; — indicates no corresponding genes.

2.4 白菜CesA家族染色体定位与共线性分析

利用TBtools绘制出白菜CesA家族基因的染色体分布图（图5）。CesA基因不均匀地分布于A01、A02、A03、A05、A06、A08、A09七条染色体上，Bra036008定位于scaffold上。

利用TBtools对16个白菜CesA基因家族成员与拟南芥进行分析，共鉴定到7对共线性基因对（图6）。大多数白菜CesA家族成员都可找到在拟南芥中的直系同源基因，仅Bra010691和Bra004814无与之对应的共线性的基因。

2.5 亚细胞定位预测和蛋白质二级结构分析

基因的亚细胞定位有助于我们进一步了解其功能。利用WoLF PSORT在线网站进行亚细胞定位分析，发现绝大多数白菜CesA定位在质膜上，与纤维素合酶的作用机制相符。蛋白质二级结构是多肽链在空间的三维排列中的一个高级组织层次，了解CesA蛋白的结构有助于预测其分子功能。利用PRABI在线网站对白菜CesA蛋白进行分析，发现CesA基因家族成员的蛋白质二级结构含有大量无规则卷曲、α-螺旋和延伸链结构及少量的β-转角（表4）。

2.6 白菜CesA家族成员蛋白跨膜结构域预测

利用TMHMM对白菜CesA家族成员蛋白的跨膜结构进行预测结果（图7）显示:除Bra010691、Bra036008、Bra004814蛋白外，其余家族成员蛋白在C端均含有6个完整的跨膜结构域，且每个组成跨膜结构域的氨基酸数量与位置均相似，据此推测其可能有相同的结构和功能，而Bra010691、Bra036008、Bra004814可能因为发生突变，相应功能发生变化，而导致跨膜结构缺失。仅有Bra005845、Bra006036、Bra024324、Bra028768、Bra031904、Bra033714、Bra037793蛋白在近N端均含有2个完整的跨膜结构域。

2.7 白菜CesA基因家族表达分析

通过qRT-PCR分析CesA在根、茎、叶、花、果荚中表达水平，使用TBtools将这些基因进行可视化分析（图8）。结果表明CesA基因在根、茎、叶、花、果荚中均有不同程度的表达，且在茎部表达量较高。Bra011865、Bra023952和Bra029874在茎、叶、花和果荚中表达量均显著高于在根中的表达水平，其中，Bra029874的表达量最为显著，在茎、叶、花中表达量为在根中表达量的6~7倍。

通过qRT-PCR分析CesA在正常与150 mM·L^-1 NaCl胁迫状态下的表达水平，结果表明大部分CesA基因对盐处理有一定程度的响应，其中Bra011865的2 h和6 h处理组，与Bra010691的6 h处理组响应最为显著，Bra024324、Bra028768及Bra023952也有比较明显的响应（图9）。

3 讨论与结论

纤维素是植物细胞壁形成的主要成分，通过参与细胞形态建成，调控细胞发育，参与多种胞内信号转导途径，从而影响植物体的生长发育。植物纤维素合酶是由36个单体组成的，本质为糖基转移酶的玫瑰状复合体。Doblin等（2002）研究显示，纤维素合酶的主要功能是负责在质膜上催化纤维素的生物合成，高等植物纤维素合成酶复合体中，存在3种以上CesA亚型参与，其亚基之间相互作用形成高级复合物。本研究鉴定到16个白菜CesA基因，对白菜和拟南芥CesA基因家族共线性分析显示，两者的进化关系较近，而聚类在同一分支上的基因，如Bra023952、Bra011345与ATCesA1（AT4G32410）聚类在同一分支上，可能具有相似的生物学功能。对白菜CesA基因家族成员进行的理化性质分析表明，蛋白等电点介于4.76~9.12之间，对酸性及碱性环境适应性均较好。16个家族成员定位在7条染色体上，其中ChrA03上最多，且Bra036008定位在scaffold上。Nawaz等（2019）的研究表明，家族成员蛋白有8个完整的跨膜结构域，各种植物来源的CesA基因在序列水平上有些差异。本研究中，白菜CesA家族成员多数有8个完整的跨膜结构域，其中C端有6个，近N端有2个，多数成员具有类似的保守结构域组成，表明其功能存在相似性。CesA蛋白跨膜区在膜上形成一个通道用于分泌葡萄糖链，在分泌通道的活性区域的附近，DDD残基与QXXRW保守结构域行使催化糖链合成的功能（Richmond，2000），本研究显示，白菜CesA基因家族大部分成员均含有DDD-QXXRW结构域，与现有报道的拟南芥与烟草等具有相同的结构域，存在进化上的保守性。

CesA在转录水平调控纤维素合成，编码序列中内含子的有无及其在序列中的位置造成了CesA基因间的差异（Richmond，2000）。已有研究显示，烟草中鉴定出21个CesA基因家族成员中有12~16个内含子（徐宗昌和孔英珍，2017），水稻中鉴定出11个家族成员中有1~13个内含子（王振怡等，2015），铁皮石斛（兰晓天等，2019）和巨龙竹（王文治等，2021）中均含有较多内含子。本研究对基因结构的分析显示，白菜CesA基因家族成员都有3~13个内含子，因其内含子较多，基因进化保守性降低，转录时出现可剪接突变的概率较高，因此CesA基因家族之间在结构上存在差异，具有丰富的多样性。植物中存在多种纤维素合成酶基因，不同基因作用在不同部位，表达的功能有差异。南荻的MlCesA7参与初级细胞壁的形成，MlCesA4、MlCesA9则参与次级细胞壁的形成（李遥等，2021）; 杉木的Cl CesA1参与木材次生壁形成，ClCesA2参与细胞初生壁的形成（庞景等，2015）; 琯溪蜜柚中，CrCesA2-2基因参与初生壁纤维素合成调控，CrCesA4、CrCesA7-1、CrCesA8参与了次生壁纤维素的积累（代亚兰等，2021）; 罗布麻的AvCesA2、AvCesA3参与初生细胞壁纤维素合成，AvCesA5、AvCesA8、AvCesA10参与次生细胞壁纤维素合成（解盛等，2021）。本研究对二级结构的分析显示，除Bra036008和Bra004814外，白菜CesA基因家族成员均定位在质膜上，表明该基因家族与细胞壁纤维素合成相关。CesA基因具有组织表达的特异性，兰晓天等（2019）对铁皮石斛CesA基因进行分析得出，De10015261、De10044519、De10126237基因只在铁皮石斛的根中表达，De10015633、De10018596只在茎中表达，De10002966在根、叶、花中均有表达。本研究中，16个白菜CesA家族基因在根茎叶花果荚中表达的个数和表达量均不相同，其中茎中表达量相对较高，尤其Bra011865、Bra023952和Bra029874在茎、叶、花中显著表达。Zhang等（2016）的研究表明，AtCesA6在拟南芥盐胁迫耐受性中发挥重要作用。在本研究中，大部分CesA基因对盐胁迫存在一定程度的响应，其中Bra010691的6 h处理组响应最为显著，表明该家族成员参与非生物胁迫的信号应答（徐宗昌和孔英珍，2017）。

注: 关于亚细胞定位数值根据分选信号、氨基酸组成和功能域数，经KNN算法而得到; 数值表示所占比例; “—”表示无数值。

Note: Values of subcellular localization is obtained according to sorting signals, amino acid composition and functional motifs from KNN. The numerical value represents the proportion column; — represents the absence of a value.

目前，对白菜CesA基因家族还没有进行系统的功能鉴定，许多基因的功能尚未发掘。本研究利用生物信息学方法对白菜CesA基因家族进行了全基因组鉴定，并对其进化关系、基因结构、顺式作用元件等进行分析，为进一步探究白菜生长发育机制奠定了基础。

参考文献