华重楼（Paris polyphylla var. chinensis）为百合科重楼属多年生草本植物，是我国传统名贵中药，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊等功效，是我国云南白药、宫血宁、百宝丹、热毒清、季德盛蛇药、抗病毒颗粒、总皂苷片等许多著名中成药的主要原料（袁理春等，2004; 汤海峰等，1998），具有重要的开发应用价值。根际是土壤—根系—微生物三者紧密结合、相互影响的场所（Butler et al.，2003）。根际微生物的适当生长可刺激植物根系的生长，增加根系的吸收面积，促进植物对各种元素的吸收，同时根际土壤微生物也是衡量土壤肥力和养分的重要指标（王静等，2015; 李航等，2016; 全鑫等，2016）。药用植物产生的黄酮、生物碱、萜类等次级代谢产物丰富，在生长过程中很容易释放到土壤中，从而引起植物根际土壤理化性质的改变，最终导致根际微生物的变化（Nihorimbere et al.，2011）。不同植物以及同一植物不同的生长发育时期，或者同一植物的不同基因型之间，对营养元素的偏好和吸收程度不同，其根系分泌物组成、分泌量和累积程度也存在着较大的差异，从而使根际土壤微生物结构发生改变（Garbeva et al.，2008; 韩玉竹等，2010）。魏志华等（2010）对2年生和10年生连翘根际微生物和土壤酶活性进行的研究结果表明，随着连翘生长年限的延长，根际微生物总量呈上升趋势，其中细菌和真菌数量增加，放线菌数量减少。大多药用植物连作障碍研究均表明，连作会使药用植物根际微生物从高肥力的“细菌型土壤”向低肥力的“真菌型土壤”转变或者破坏了根际微生物种群的平衡（李琼芳，2006; 何江华等，2008; 乔卿梅等，2009）。根际微生物群落结构失调及病原菌数量增加是造成药用植物连作障碍的主要原因（李勇等，2010）。因此，研究不同生长年限药用植物生长发育对根际土壤微生物群落多样性的影响，对了解药用植物根际土壤状态、促进植株生长、防治地下病虫害及提高药材品质等有十分重要的意义。

华重楼生长周期长，通常从种子到药材需要8~10 a时间，长时间的单一化种植极易引发连作障碍，导致华重楼的品质和产量难以得到保障。近年来，华重楼根际微生物的研究主要是关于不同栽培环境和不同品种等方面（周浓等，2015; 张静等，2016; 郑梅霞等，2020），而对不同生长发育期华重楼与根际微生物多样性变化的研究较少，土壤微生物群落组成结构变化与华重楼生长年限的关系仍不清楚。鉴于此，本研究采集不同生长年限野生华重楼的根际土壤，利用Illumina高通量测序技术对土壤细菌16S rRNA和真菌18S序列进行测序，对不同生长年限野生华重楼根际微生物群落组成结构及多样性进行研究，探讨华重楼生长发育对其定植地微生物群落组成和多样性的影响规律，为人工栽培华重楼及探寻其根茎病害发生的生理生态机制及相应的生物防治方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集和处理

华重楼每年冬季地上部茎秆倒伏，根茎上会留下刻痕，常规可以按根茎上刻痕的数量来判断不同生长年限（苏海兰等，2020）。土样采集按照鲍士旦的方法（鲍士旦，2000），2018年9月在广西金秀县华重楼野外自然分布区采用随机多点混合的原则，每个采样点选取生长健康、长势一致、刻痕数相同（1个刻痕代表生长1 a）的华重楼10株，收集根系及附着其上0~0.5 cm的土壤作为根际土，将混匀的根际土壤放入无菌塑料袋中，用标签记录采样的信息，放入户外保鲜箱后立即带回实验室，每个采样点3次重复。每个土壤样品采集后分成2份:一份置于-80℃下保存，用于土壤DNA提取及后续的细菌16S rRNA和真菌18S rRNA测序; 另一份室内自然风干，研磨，过2 mm筛，用于土壤理化性质测定。由于野生华重楼生长年份的不可控性，根据本次采样的实际情况结合重楼主要药用成分重楼皂苷的积累规律（张烨等，2011; 王琳娜等，2018），因此选择3年生、5年生、7年生和9年生4个不同生长年限华重楼的根际土样开展土壤微生物多样性研究，土壤信息如表1所示。

1.2 根际土壤微生物群落组成及多样性分析

1.2.1 土壤微生物DNA的提取、PCR扩增和测序

土壤微生物总DNA使用上海生工生物工程股份有限公司的土壤基因组DNA快速抽提试剂盒提取; 提取后DNA样品用干冰寄送到上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。整个上机流程，包括PCR的扩增、 PCR产物的混样和纯化及文库的构建。对细菌V3~V4区进行扩增的引物采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。扩增程序:95℃预变性3 min; 95℃变性30 s; 53℃退火30 s; 72℃延伸45 s; 持续28个循环周期; 72℃延伸10 min。对真菌V5~V7区进行扩增的引物采用SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。扩增程序:95℃预变性3 min; 95℃变性30 s; 53℃退火30 s; 72℃延伸45 s; 持续37个循环周期; 72℃延伸10 min。扩增产物利用美吉生物Illumina平台进行测序。

1.2.2 微生物组测序数据质控与分析

对测序得到的原始数据进行拼接质控，得到有效数据。采用Uparse软件平台进行OTU（operational taxonomic units）聚类和物种信息分析。OTU聚类步骤:（1）对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量;（2）去除没有重复的单序列;（3）按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列;（4）将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析。

1.2.3 根际土壤微生物组成分析

基于测序的数据，利用Mothur软件分析不同随机抽样下的Alpha多样性反映微生物群落的丰富度和多样性，包括Ace、Chao、Simpson和Shannon等指数。其中，Ace和Chao指数反映样本中群落的丰富度，Simpson和Shannon指数反映群落的多样性，Ace、Chao和Shannon指数越大，Simpson指数越小，说明样品的物种多样性越高; 利用R语言工具生成土壤微生物群落柱形图; Venn图可用于统计多组或多个样本中所共有和独有的OTU数目，采用R语言工具和作图生成。

1.2.4 根际土壤微生物群落结构差异性分析

通过对不同样品微生物群落间进行Beta多样性分析，探索不同样品间群落组成的相似性或差异性; 用Qiime数据分析流程计算Beta多样性距离矩阵，用R语言进行UPGMA聚类分析并作树状图。

1.3 根际土壤理化性质测定

土壤理化性质测定参照《土壤农化分析》（鲍士旦，2000）。全氮（凯氏定氮法）、全磷（钼锑显色法）、全钾（火焰光度法）、土壤有机碳（重铬酸钾水合加热法）、铵态氮和硝态氮（定氮仪法）、速效磷（盐酸-氟化铵法）、速效钾（浸提+原子吸收法）和pH值。

1.4 不同微生物物种与土壤理化因子相关性分析

基于土壤DNA测序及土壤理化分析的数据，利用R语言工具计算所选微生物物种与环境因子之间的相关性系数（Spearman等级相关系数、Pearson相关系数等），将获得的数值矩阵通过热图直观展示。通过颜色变化反映二维矩阵或表格中的数据信息，颜色深浅表示数值的大小。

2 结果与分析

2.1 不同生长年限华重楼根际土壤微生物群落的多样性分析

2.1.1 细菌群落的多样性分析

供试土壤样品的细菌和真菌群落丰度指数（Ace、Chao）和多样性指数（Shannon、Simpson）如表显示（表2）。其中，细菌Ace和Chao指数均随着生长年限的增加呈先升高后下降的趋势且各年份间差异显著，峰值均出现在第7年，表明华重楼根际土壤中细菌丰富度随着株龄的增加呈先升高后下降的趋势，在第7年时华重楼根际土壤中细菌丰富度最高，在第3年时细菌丰富度最低。

Shannon和Simpson指数各年份间差异显著，随着生长年限发生明显的起伏波动。在华重楼生长至第5年时，Shannon指数降至最低，而Simpson指数升至最高，说明此时的土壤环境利于某些特定种类（或类群）细菌的生长和繁殖。因此，细菌丰富度并未出现较大改变，由于竞争关系致使土壤中其余细菌种类（或类群）的生长和繁殖受到抑制，因此细菌多样性出现一个异常大的下降幅度。到第7年时，Shannon指数升至最高，而Simpson指数降至最低，表明此年份的华重楼根际土壤中细菌多样性最高。由此可知，华重楼的生长对根际土壤中细菌数量和种类的影响均达到显著水平。

2.1.2 真菌群落的多样性分析

由表2可知，所有年份土壤样品中真菌Ace和Chao指数差异不显著，表明所选年份的华重楼对根际土壤真菌丰富度的影响不大。然而，真菌Shannon和Simpson指数分析显示，华重楼根际土壤真菌Shannon指数随着生长年限的增加先升后降，Simpson指数则先降后升，峰值和最低值均在第7年时出现，结合显著性分析发现，华重楼的生长对根际土壤中真菌多样性的影响显著，真菌种类随着生长年限的增加呈先增加后下降的趋势，华重楼在生长至第7年时的根际土壤中真菌类群数量最多，物种丰富。

2.2 不同生长年限华重楼根际土壤微生物群落组成分析

2.2.1 细菌群落组成分析

4个不同生长年份的华重楼根际土壤样品中共检测到细菌25门、56纲、134目、195科、280属、484种。从门水平上看（图1:A），随着华重楼的生长，土壤中不同细菌门类的相对丰度发生了明显变化。各生长年限华重楼根际土壤主要优势菌门均为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）。其中，以变形菌门和酸杆菌门二者所占比例最高，占细菌总丰度在60%以上。变形菌门丰度随着生长年限的增加呈先升高后降低的趋势，在第3年至第7年间丰度增幅不大，而从第7年长至第9年时丰度出现了较大的下降，降幅为22.36%。酸杆菌门细菌丰度变化正好相反，随着华重楼生长年限的增加呈先降低后升高的趋势，第3年至第5年、第3年至第7年时丰度显著下降，降幅分别为41.35%~43.64%，之后在长至第9年时快速回升了51.88%，表明华重楼对酸杆菌门的影响大于变形菌门。绿弯菌门和拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度均随着华重楼生长年限的增加呈先升高后降低的趋势，从第3年长至第5年时两个菌门丰度均未发生大幅上升趋势，而从第5年长至第7年时丰度均显著上升，增幅分别为164.90%和456.21%; 之后，两者丰度回落，不同的是绿弯菌门下降幅度小，而拟杆菌门丰度下降幅度大，达72.27%。放线菌门在第7年时丰度最低，其余生长年限中丰度差异不显著。另外，厚壁菌门（Firmicutes）在第5年时丰度达到18.16%，而在其余年份中丰度均低于5%; 硝化螺旋菌门（Nitrospirae）在7年生的根际土壤中丰度比其他生长年限出现了显著增加。

在科水平（图1:B）上，主要由Solibacteraceae-subgroup-3、norank-o-Subgroup-2、黄色杆菌科（Xanthobacteraceae）、norank-o-norank-c-Subgroup-6等菌科组成。其中，Solibacteraceae-subgroup-3在生长5年的土壤中丰度最高，为12.9%; 生长7年的土壤中丰度最低，仅为1.2%。norank-o-norank-c-Subgroup-6则相反，在生长5年的土壤中丰度最低，为1.1%; 生长7年时丰度升至最高，为10.9%。norank-o-Subgroup-2、Xanthobacteraceae、norank-o-Aci-dobacteriales及 unclassified-o-Gammaproteo-bacteria-Incertae-sedies等丰度随着生长年限的增加呈先下降后上升的趋势，第7年时丰度均为最低水平。此外，3年、5年和9年生的土壤中均可检测出norank-o-norank-c-norank-p-WPS-2、酸热菌科（Acidothermaceae）、norank-o-norank-c-AD3、柄杆菌科（Caulobacteraceae）、科里氏菌科（Koribacteraceae）等科的细菌，但上述科水平的细菌几乎不存在于7年生的土壤中。产碱杆菌科（Nitrosomonadaceae）仅存在于7年生的土壤中，丰度为6.7%。另外，Clostridiaceae-1只存在生长5年的华重楼根际土壤中，丰度为17.2%。

注: 同列中数值后面的不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P＜0.05) . The same below.

注: 同列中数值后面的不同字母A、B、C、D、E、F分别表示土壤养分评价水平丰富、较丰、中等、较缺、缺乏和极缺。

Note: Letters A, B, C, D, E and F in the same column respectively indicate the classification standards of soil nutrient contents are rich, above average, medium, scarce, scarcer and the scarcest.

2.2.2 真菌群落组成分析

4个不同生长年份的华重楼根际土壤样品中共检测真菌8门、26纲、56目、76科、78属、96种。从门水平上（图2:A）看，土壤中的真菌主要由子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）与毛霉门（Mucoromycota）组成。其中，子囊菌门和担子菌门二者所占比例达80%以上，且各生长年限间丰度变化最大。子囊菌门丰度在土壤中大体呈逐年上升的趋势，生长3年的土壤中丰度比例最低，随后丰度快速上升，生长至第9年时丰度达到88.11%。担子菌门丰度变化与子囊菌门相反，当子囊菌门丰度上升时，担子菌门丰度下降，担子菌门在生长3年的土壤中丰度最高。毛霉门真菌随着生长年份的增加呈先升高后降低的趋势，在华重楼生长7年的土壤中丰度最高。壶菌门丰度则随华重楼生长年限的增加呈逐年降低的趋势。在科水平上（图2:B），以古生菌科（Archaeorhizomycetaceae）、红菇科（Russulaceae）、norank-p-Mucoromycota和unclassi-fied-c-Agaricomycetes为优势菌科，各科在不同生长年限中丰度不同。古生菌科除了在7年生的华重楼根际土壤中检测不到外，在其余年份中丰度随着生长年限的增加呈逐年上升的趋势，生长至第9年时丰度最高，为66.5%。红菇科仅存在于3年生的根际土壤中，丰度为64.8%。norank-p-Mucoro-mycota、unclassified-c-Agaricomycetes、unclassified-c-Sordariomycetes、unclassified-p-Ascomycota、曲霉科（Aspergillaceae）、unclassified-o-Onygenales、线虫草科（Ophiocordycipitaceae）及蔓毛壳科（Herpo-trichiellaceae）等的丰度均随着生长年限的增加呈先升高后降低的趋势，丰度最高均出现在华重楼生长7年的土壤中。另外，从图2:B中可以看出，7年生华重楼的根际土壤中真菌种类更丰富。

2.3 不同生长年限华重楼根际土壤微生物群落的相关性分析

绘制OTUs韦恩图（图3），从图3:A可以看出，华重楼不同生长年限根际土壤共有的细菌OTU为322个，分别占各生长年限细菌OTU总数的33.68%、28.59%、19.60%和22.90%。各生长年限植株根际土壤独有的细菌OTU数量随着生长年份的增加呈先升高后降低的趋势; 在生长7年的根际土壤中独有的细菌OTU类型最多，为869个，为其他年份的5.9~37.8倍。从图3:B可以看出，根际土壤共有的真菌OTU数为50个，分别占各生长年份真菌OTU总数的35.21%、30.86%、48.54%和33.11%; 同样在生长7年的根际土壤中，独有的真菌OTU类型最多，为26个。由此可知，随着华重楼生长年限的增加，土壤细菌和真菌OTU类型均不同程度地发生变化，但细菌的变化幅度比真菌大，表明华重楼的生长对土壤细菌群落的影响大于真菌群落。

2.4 不同生长年限华重楼根际微生物群落结构差异性分析

对华重楼各生长年份的根际土壤样品的细菌和真菌群落组成的相似度进行UPGMA聚类分析，结果如图4所示。从细菌群落组成聚类结果图4:A可以看出，4份不同生长年限土壤大致分成三类，即3年生和5年生归为一类，7年生和9年生的各为一类。这表明3年生和5年生根际土壤中细菌群落组成相似度最高，7年生的和其他年份的细菌群落组成相似度最低，9年生的介于前两类之间。从真菌群落组成聚类结果图4:B可以看出，真菌群落也划分为3个大类，即5年生和9年生的归为一类，7年生和3年生的各为一类。这表明5年生和9年生中真菌群落组成相似度最高，3年生的和其他年份的真菌群落组成相似度最低，7年生的介于前两类之间。可见，随着华重楼生长年份的变化，其根际土壤细菌和真菌群落均发生了演变，但演变发生的时间和方式不同，即细菌群落演变比较剧烈的时期是在定植后第7年，到第9年又和第3、第5年趋于相同; 而真菌群落变化比较剧烈的时期则在定植后第5年，第7年时出现一些变化，第9年时与第5年趋于相同。

2.5 不同微生物物种与土壤理化因子的相关性分析

2.5.1 华重楼根际土壤理化性质分析

检测3年生、5年生、7年生和9年生4个不同生长年份的华重楼根系土壤中的全氮（total nitrogen，TN）、全磷（total phosphorus，TP）、全钾（total potassium，TK）、有机碳（total organic carbon，TOC）、铵态氮（ammo-nium nitrogen，AN）、硝态氮（nitrate nitrogen，NN）、速效磷（available phosphorus，AP）、速效钾（available potassium，AK）和pH值（表3），并根据1980年全国第2次土壤普查养分分级标准进行评价。表3结果表明，4个不同生长年限华重楼的根系土壤理化性质存在差异。其中，TN均为丰富以上水平，第5年时出现峰值，为其他年份的2.2~2.4倍。TP为接近较丰富或丰富以上水平，第3年偏低（0.78 g·kg^-1），第5年时上升至峰值（1.62 g·kg^-1），第7年再下降（1.16 g·kg^-1），第9年又回升至接近峰值（1.57 g·kg^-1）。TK随生长年份的增长而增高，而其含量则为较缺以下水平。速效N（包含铵态N和硝态N）第3、第5、第7年均大于150 mg·kg^-1，处于丰富水平，其峰值出现于第5年; 第9年下降幅度较大，处于较缺水平（＜90 mg·kg^-1）。速效P不同年份的根际土壤间差别较大，其含量随着生长年份的延长而增加，均为丰富以上水平。速效K含量随着生长年份的增长先升后降，其峰值（407.92 mg·kg^-1）在第7年出现，为丰富水平; 第3年表现为较缺，第5和第9年表现为中等含量水平。土壤有机质（有机碳）随着生长年份的增长而下降，除了第9年表现为中等外、其他年份均为丰富以上水平。土壤pH值随着生长年限的增加逐渐增加，从4.10升高到6.96，土壤逐渐碱化，但仍在适宜华重楼生长的范围值内。土壤营养元素和pH值随着华重楼生长年限发生的上述变化，可能与华重楼本身生长发育对土壤营养元素的消耗、其根系分泌活动对营养元素形态的改变、土壤中微生物活动以及其种群结构和组成发生变化等因素有关。

2.5.2 不同微生物物种与土壤理化因子的相关性分析

土壤理化性质既是影响华重楼产量和品质的重要因素之一，也是影响土壤微生物群落组成和数量的重要因子。将华重楼根际土壤中的细菌、真菌类群与土壤理化因子进行Spearman相关性分析，从图5和图6可以看出，土壤理化因子与根际土壤不同微生物具有不同程度的相关性。

从图5可以看出，华重楼根际土壤中丰度排名前15的细菌门类与各土壤理化因子的Spearman相关性。变形菌门、厚壁菌门和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）的丰度分别与TN、TP和AK呈显著正相关; 而酸杆菌门、WPS-2菌门和疣微菌门（Verrucomicrobia）分别与AK、AK和TN呈显著负相关; 浮霉菌门（Planctomycetes）与NN呈显著负相关、同时与AP呈显著正相关。其余8个门类丰度受土壤理化因子影响不显著。综上可知，在15类细菌中，AK对其中3类，TN对其中2类，TP、AP和NN各对其中1类产生了显著的正面或负面影响。此外，TOC和AN虽与15类细菌相关性未达显著水平，但两者与细菌相关性几乎相同，均对绿弯菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、己科河菌门（Rokubacteria）、硝化螺旋菌门和Latescibacteria有较强的负相关性。结合细菌组成分析中各门类占细菌丰度的比例，发现对华重楼根际土壤细菌群落组成起主要作用的理化因子为AK和TN。

从图6可以看出，华重楼根际土壤中丰度排名前8的真菌门类与各土壤理化因子的Spearman相关性。子囊菌门、一些未分类的真菌门类（unclassified_k_fungi）和捕虫霉门（Zoopagomycota）的丰度分别与TK、TN和AK呈显著正相关; 而担子菌门与TK呈显著负相关; 壶菌门（Chytridiomycota）则与pH值呈显著负相关，与TOC和AN呈显著正相关。其余3个门类丰度受土壤理化因子影响不显著。综上可知，在8类真菌中，TK对其中2类，pH值、TOC、AN、TN和AK各对其中一类产生了显著的正面或负面影响。此外，TOC及AN与8类真菌的相关性几乎一致，且与子囊菌门、担子菌门有较强的相关性。TP与8类真菌的相关性虽未达显著水平，但与子囊菌门、担子菌门却有较强的相关性。结合真菌组成分析各门类占真菌丰度的比例发现，对华重楼根际土壤真菌群落组成起主要作用的土壤理化因子为TK，其次是pH值、TOC、AN、TP、TN和AK。

3 讨论与结论

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，土壤微生物群落多样性可以敏感反映出植物的生长、繁殖以及代谢活动的变化; 同时，土壤生物之间存在相互制约、彼此依赖的关系，与周围的环境因子相互作用、往复调控（Hirsch et al.，2010）。因此，研究植物根际土壤微生物多样性的变化有利于揭示植物的生长发育规律，对植物尤其是药用植物的栽培生产十分有意义。本文研究了不同生长年限野生华重楼根际土壤微生物多样性的变化规律发现，不同生长年限华重楼根际土壤中细菌及真菌群落的组成与结构存在差异，第5至第7年是土壤微生物群落多样性和组成产生重大变化的关键时期。华重楼根际土壤中细菌丰度比例最大的两个门始终是变形菌门与酸杆菌门，两者丰度比例随着华重楼的生长发育发生较大变化且趋势相反，在杉木人工林不同发育阶段土壤细菌类群特征的研究中也发现了相似的规律（魏志超等，2017）。郑梅霞等（2020）研究表明，华重楼根际土壤中含量最为丰富的是变形菌门，其次是酸杆菌门和放线菌门。康林玉等（2018）在研究辣椒种植对根际土壤微生物多样性影响时发现，辣椒种植前后土壤均以变形菌门和酸杆菌门为优势细菌，以子囊菌门、担子菌门和接合菌门为优势真菌。黄珍等（2010）在海南香蕉园土壤样本中发现，变形菌门、厚壁菌门和酸杆菌门是主要的细菌类群。综上表明，不同植物根际环境的微生物优势菌群存在差异，华重楼根际土壤具有一般土壤微生物群落组成的共性。

不同生长年限华重楼根际土壤中细菌Ace、Chao和Shannon指数均显著高于真菌，而Simpson指数则显著低于真菌，表明所选生长年限的华重楼根际土壤中细菌物种较真菌更加丰富，多样化程度更高，属于健康的“细菌型”土壤（康林玉等，2018）。华重楼生长到第7年时，根际土壤中的微生物丰富度及多样化程度均达到最高，超过7年后土壤中的微生物数量及多样性均出现了显著的下降，根际土壤有从“细菌型”向“真菌型”转变的趋势。周浓等（2015）研究发现，滇重楼根际土壤中细菌数量多于真菌数量且随着生长年限的增加，真菌与解钾细菌数量呈逐年增加，而细菌、放线菌等数量呈逐年减小的变化趋势，说明华重楼与滇重楼根际微生物变化规律相似，这可能是由于两个不同变种七叶一枝花根系分泌物成分相似所致。根系分泌物的种类和数量直接影响着根际微生物的代谢和生长发育，进而对根际微生物的种类、数量和分布产生影响（Nihorimbere et al.，2011）。在麦冬、西洋参、浙贝母等作物上的研究发现，当根际土壤从高肥力的“细菌型”向低肥力的“真菌性”转变时，病虫害增加，导致作物产量及质量下降等负面影响（李琼芳，2006; 李勇等，2010; 孙世中等，2011; 廖海兵等，2011）。因此，在华重楼人工栽培过程中，应当适时采收。此外，还可以根据土壤微生物的状态，有针对性地利用微生物菌剂等措施调控土壤微生物环境，达到防治病虫害、增产提质等效果。

土壤微生物类群特征受气候、土壤性质等多方面的影响（赵维娜等，2016）。Liu等（2015）研究表明，变形菌门喜欢在养分含量高的土壤环境中生存且与土壤有机质和全氮含量显著相关，变形菌门在华重楼根际土壤中的丰度变化与变形菌门生长习性相对应，Spearman相关性分析也表明，变形菌门与全氮含量极显著正相关。AK与酸杆菌门极显著负相关，而王印等（2012）研究表明，重楼根茎总皂苷含量与根际土壤全K、速效K含量均达到显著正相关，说明酸杆菌门可能不利于重楼总皂苷的积累; 土壤pH是影响土壤中酸杆菌丰度和多样性的重要因子，通常情况下土壤pH值与土壤中酸杆菌的相对丰度呈显著负相关（Griffiths et al.，2011）。但是，本研究中，根际土壤中酸杆菌门的丰度并不是与pH呈显著负相关，而是与速效钾显著负相关，并随着华重楼生长年限的增加呈先降低后升高的趋势，表明在华重楼根际土壤中，速效钾与华重楼的生长对酸杆菌门丰度和多样性的影响强于pH。全磷与速效磷分别与厚壁菌门、浮霉菌门呈极显著正相关，但与优势菌门相关性不显著，厚壁菌门与浮霉菌门在华重楼根际细菌中所占丰度比例较小，而变形菌门与酸杆菌门是华重楼根际土壤中丰度比例最大的细菌门类，这两个菌门的变化会引起整个根际微生物组成结构的较大改变。因此，对华重楼根际土壤细菌群落组成起主要作用的理化因子是速效钾和全氮，磷的影响不及速效钾和全氮。巨天珍等（2008）对天水小陇山红豆杉林土壤真菌研究认为，影响土壤真菌数量和多样性的最主要因素是土壤pH，其次是土壤中的有机质和水分含量; Paul等（2012）研究结果表明对土壤真菌群落变化有关的是总C/N的值，次要的因素是土壤pH。本研究中TK是影响华重楼根际土壤中真菌组成的主要因子，其次是pH值、TOC、TP、TN等，这与前人研究结果有差异但也有相同之处，表明不同植物土壤真菌因生境、植物种类等不同，主要的影响因子也存在差异。TOC及AN与华重楼根际土壤细菌和真菌主要门类的相关性表现几乎一致，表明两者对华重楼根际微生物群落组成的作用相似; 此外，TOC、AN及TP与真菌优势菌门的相关性比细菌强，表明三者对华重楼根际土壤真菌群落组成的影响比细菌大。华重楼根际土壤微生物独特的组成结构可能与其根际分泌物有关，从而影响了土壤中微生物的分布（刘慧娟等，2019），根系分泌物质的种类及其与土壤、微生物互作的方式与机制尚不清楚，仍有待进一步研究。

本研究初步揭示了不同生长年限野生华重楼根际土壤微生物多样性的变化规律，发现第5至第7年是土壤微生物群落多样性和组成产生重大变化的关键时期。本研究结果为进一步探索华重楼生长发育与微生物的关系奠定了基础，也为今后进一步研究华重楼有效成分积累与根际微生物环境的关系及其病虫害的发生机制及防治措施提供了科学依据，有助于促进华重楼的可持续利用及产业的发展。

参考文献