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花榈木（Ormosiahenryi）属豆科（Fabaceae）红豆属（Ormosia）常绿乔木，材质致密、坚硬、纹理美丽，为我国珍贵用材树种，是制作高档家具和工艺品的重要原材料，其根、枝、叶均可入药，具有较高的经济、药用和生态价值。由于花榈木种皮坚硬，透水性差，野生自然资源稀少，大小年现象严重，自然更新困难，生长缓慢，且成年树木易遭砍伐和破坏，造成现有野生自然资源濒临灭绝状态。为保护其现有自然资源多样性和解决种质资源不足问题，当下迫切需要进行保护和繁殖，无性繁殖可以解决生产实践中资源匮乏问题和缓解供需矛盾。其中，组织培养技术具有繁殖速度快、产量高、利于种质资源保存和遗传转化（Keshvari et al.，2018）等优点，在林木的扩繁研究和运用中具有重要作用。前人对同为豆科植物的红豆树（Ormosiahosiei）、香合欢（Albizia odoratissima）等的组织培养技术进行了研究，但仍存在愈伤组织分化率、不定芽增殖率、生根率低等问题（桂平，2018; 许倩，2020）。
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花榈木无性繁殖中，赵正霞（2007）和文虹等（2020）分别对花榈木埋根和嫁接技术进行了研究，高丽等（2009）和乔栋（2016）初步建立了组织培养再生体系，但再生植株的数量有限，其技术尚不成熟，且生产成本高，难以实现产业化。体细胞胚胎发生作为一种高效的体外再生方法，是体细胞在体外培养形成胚性愈伤组织，经胚胎发生和胚胎发育形成大量胚状体的过程，对产业化生产、胚胎发育和细胞全能性研究具有重要意义。先前的研究建立了花榈木体胚发生再生体系（Wu et al.，2020），较深入探讨了花榈木体胚发生的生理机理，揭示了可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白是花榈木体胚发生的物质基础（Wu et al.，2021）。前人在三叶无患子（Sapindustrifoliatus）（Asthana et al.，2017）、北美鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）（Kim et al.，2011）和斐济果（Feijoa sellowiana）（Vesco &Guerra，2001）等物种体细胞胚培养研究中发现，可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白这些有机物含量受碳氮源及浓度的影响（Iraqi &Tremblay，2001），从而影响体胚诱导率。由此推测，碳氮源及浓度与体胚诱导率及其生理变化有关，但它们如何调控花榈木体胚诱导及其有机物积累的机理尚未可知。因此，本研究以花榈木成熟胚作为外植体，采用单因素试验，分别以3种碳源、4种蔗糖浓度和6组氮源添加至胚性愈伤组织、体细胞胚和体细胞胚分化诱导培养基中，通过分析不同碳氮源处理下胚性愈伤组织诱导率、体胚诱导率及有机物积累的差异，拟探讨以下问题:（1）碳氮源对花榈木体胚诱导率是否具显著影响;（2）碳氮源是否影响花榈木胚性愈伤组织有机物积累，从而对体胚诱导起作用。旨在筛选花榈木体胚发生诱导适宜的碳氮源，进而为优化花榈木体胚再生体系提供参考依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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于2017年11月采摘贵州省孟关（26°14′23" E，106°25′12" N，海拔1 112 m）同一株花榈木种子。浓硫酸浸泡种子1 h，回收浓硫酸，自来水洗净种子，75%乙醇处理1 min，2% NaClO 处理8 min，无菌水清洗5次，无菌水浸泡种子24 h，使其吸胀，在超净工作台上使用接种工具剥取成熟胚，备用。
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1.2 研究方法
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1.2.1 花榈木体胚发生诱导过程
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（1）胚性愈伤组织诱导:以成熟胚为外植体，接种至胚性愈伤组织诱导培养基中。胚性愈伤诱导培养基参考Wu等（2020）的配方:B5培养基、0.2 mg· L-1 6-BA、2.0 mg·L-1 2，4-D和2.5 g·L-1结冷胶，暗培养，（25±2）℃。第25天统计胚性愈伤组织诱导率。（2）体细胞胚诱导:将（1）中胚性愈伤组织转接至体细胞胚诱导培养基，体细胞胚诱导培养基参考Wu等（2020）的配方:B5培养基、0.5 mg·L-1 KT、1.0 mg·L-1 2，4-D和2.5 g·L-1结冷胶，暗培养，（25±2）℃。培养4周后统计体细胞胚诱导率。（3）体细胞胚分化诱导:将（2）中体细胞胚转接至体细胞胚分化诱导培养基，体细胞胚分化诱导培养基参考Wu等（2020）的配方:B5培养基，0.5 mg·L-1 TDZ，0.2 mg·L-1 NAA，光照强度 20 μmm-2s-1，16 h·d-1; 60 d后统计体细胞胚分化率。
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1.2.2 不同碳氮源添加的试验设计
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在上述培养的（1）（2）（3）阶段均添加不同碳源、不同浓度蔗糖和有机氮源，具体设计为:
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（1）碳源:分别添加30 g·L-1蔗糖（T1）、30 g·L-1葡萄糖（T2）和30 g·L-1麦芽糖（T3）;
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（2）蔗糖浓度:分别添加20 g·L-1蔗糖（C1）、30 g·L-1蔗糖（C2）、40 g·L-1蔗糖（C3）和50 g·L-1蔗糖（C4）;
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（3）有机氮源:分别添加0.5 g·L-1谷氨酰胺Gln（N1）、0.5 g·L-1水解酪蛋白CH（N2）、0.5 g·L-1水解乳蛋白LH（N3）、0.25 g·L-1Gln + 0.25 g·L-1CH（N4）、0.25 g·L-1Gln + 0.25 g·L-1 LH（N5）、0.25 g·L-1CH +0.25 g·L-1LH（N6）和以不添加有机氮为对照（N0）。
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上述各阶段每个处理重复3次，每个重复接种20个外植体。所有培养基在灭菌前（121℃，20 min）pH值均调节至5.90±0.2，培养条件为暗培养，（25±2）℃。
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1.2.3 胚性愈伤组织的生长和有机物测定
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接种后第25天，分别测定不同处理培养基的pH值（雷磁PHS-3C型pH计，上海）; 并收集胚性愈伤组织，使用万分之一天平（赛多利斯Practum224-1CN，德国）测量单个成熟胚诱导获得的胚性愈伤组织重量，装入5 mL离心管，贮藏于-80℃超低温冰箱; 待样品收集完毕，对生理指标进行统一测定。可溶性糖和淀粉含量的测定采用硫酸-蒽酮法，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法（刘萍等，2016），每个处理重复测定3次。
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1.3 体胚诱导相关指标计算
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胚性愈伤组织诱导率、体细胞胚诱导率和体细胞胚分化率的计算公式如下:
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胚性愈伤组织诱导率（%）=（胚性愈伤组织的数量/接种成熟胚数量）×100;
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体细胞胚诱导率（%）=（体细胞胚的数量/接种胚性愈伤组织数量）×100;
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体细胞胚分化率（%）=（体细胞胚的萌发数量/接种体细胞胚数量）×100。
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1.4 数据处理
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试验数据用Microsoft Office Excel2007进行统计处理，使用SPSS 18.0软件
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对数据进行单因素方差分析，通过Turkey检验进行差异显著分析（P＜0.05），最后使用Origin 2019作图。
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2 结果与分析
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2.1 花榈木体胚发生的诱导
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成熟胚在胚性愈伤组织诱导培养基中培养7~10 d，愈伤组织从成熟胚四周长出。培养25 d后，胚性愈伤组织为乳白色、黄白色或黄色，并在愈伤组织表面有结节状的小突起（图1:a），它们在不同碳源、蔗糖浓度和有机氮源上的外观形态无差异。胚性愈伤组织在体胚诱导培养基中培养4周后相继发育形成表面光滑、白色、透明状和类似球形胚的体细胞胚（图1:b），体细胞胚在体胚分化培养基中进一步分化形成幼芽（图1:c）。
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2.1.1 碳源对胚性愈伤组织诱导及发育的影响
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添加3种碳源的花榈木成熟胚愈伤组织诱导率均为100%（图2），但胚性愈伤组织诱导率差异显著（P＜0.05）。其中，T1处理的胚性愈伤组织诱导率最高，比T2和T3分别高9.3%和9.7%。不同碳源体细胞胚诱导率和分化率的差异不显著（P＞0.05），但均以T1最高。
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2.1.2 蔗糖浓度对胚性愈伤组织诱导及发育的影响
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花榈木成熟胚愈伤组织诱导率随蔗糖浓度的增加呈降低趋势（图3），但差异不显著（P＞0.05）; 而胚性愈伤组织、体细胞胚诱导率和体细胞胚分化率随蔗糖浓度的增加呈先升高后降低趋势，其诱导率均以C2最高，但体细胞胚分化率差异不显著（P＞0.05）。值得注意的是，C4的体胚诱导率急剧下降，这说明高浓度蔗糖不利于体胚诱导。
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2.1.3 有机氮源对胚性愈伤组织诱导及发育的影响
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与对照N0相比，添加不同有机氮源对愈伤组织诱导率和体胚分化率差异不显著（P＞0.05）; 但对胚性愈伤组织和体胚诱导率影响显著（P＜0.05，图4），其中，N1胚性愈伤诱导率显著高于N0，增加了18%; N1、N2和N4体胚诱导率显著高于N0，分别比N0高18.5%、20.5%和19.2%。
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2.2 碳氮源对胚性愈伤组织的生长及有机物积累的影响
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2.2.1 碳源对胚性愈伤组织生长及有机物积累的影响
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不同碳源处理的胚性愈伤组织重量差异显著（P＜0.05），以T1最高，分别比T2、T3高21%、7.8%，而对培养基pH值、胚性愈伤组织的可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量的影响不显著（P＞0.05，表1）。这表明不同碳源对胚性愈伤组织的生长影响较大，对培养基pH值、胚性愈伤组织碳氮积累的影响较小。
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2.2.2 蔗糖浓度对愈伤组织生长及有机物积累的影响
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不同蔗糖浓度处理对培养基pH值和胚性愈伤组织淀粉含量的影响不显著（P＞0.05），但对胚性愈伤组织的重量、可溶性糖和可溶性蛋白含量的影响显著（P＜0.05，表2）。随蔗糖浓度升高，胚性愈伤组织的重量和可溶性蛋白含量呈先升高后降低的趋势，以C2最高; 胚性愈伤组织可溶性糖含量则随蔗糖浓度增加呈逐渐增加趋势，在C4处理中最高，分别是C1、C2、C3处理的2.85、1.90、1.30倍。结果表明蔗糖浓度对培养基的pH值影响较小，对胚性愈伤组织的生长及其有机物积累影响较大。
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2.2.3 有机氮源对愈伤组织生长及有机物积累的影响
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有机氮源对培养基pH值和胚性愈伤组织淀粉含量的影响不显著（P＞0.05），但对胚性愈伤组织重量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量的影响显著（P＜0.05，表3）。胚性愈伤组织重量在N5、N1和N0处理中较高; N0胚性愈伤组织可溶性糖含量分别比N1-N6高22%、17%、34%、9.8%、16%和2.4%; 相反，N1-N6胚性愈伤组织可溶性蛋白含量显著高于N0。可见，有机氮源的添加有助于胚性愈伤组织的生长和可溶性蛋白的积累，却不利于胚性愈伤组织可溶性糖的积累。
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3 讨论与结论
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3.1 碳源对花榈木体胚发生诱导的影响
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碳源参与碳代谢途径，为植物生命活动提供能量和碳骨架，对植物生长发育是不可或缺的，影响植物体胚诱导率的高低（Bartos et al.，2018）。本研究中，蔗糖胚性愈伤组织、体胚及体胚分化诱导率均高于葡萄糖和麦芽糖，与龙眼（Dimocarpuslongana）（赖钟雄，1997）和胡桃楸（赵舒野，2013）体胚诱导的结果一致。胚性愈伤组织的重量以添加蔗糖处理最高，可能与相同碳源浓度下蔗糖较葡萄糖和麦芽糖能够更好地调节培养基中的低渗环境，且蔗糖作为双糖经水解后形成同等量的葡萄糖和果糖，有助于提高蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase，SPS）和转化酶（invertase，INV）的活性，促进碳水化合物之间的相互转化和转运能力，从而增加碳水化合物含量，提供外植体更多的能量有关（Iraqi &Tremblay，2001; 罗凯等，2021）。这些可能是蔗糖被作为大部分植物细胞培养碳源的主要原因。此外，不同碳源处理下培养基pH值差异不显著，与它们是非电解质有关。
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3.2 蔗糖浓度对花榈木体胚发生诱导的影响
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蔗糖浓度影响培养基渗透压，适当的蔗糖浓度为细胞膨大提供渗透推动力，有助于提高蔗糖代谢相关酶的活性，对体胚诱导具有重要作用（Hazubska-Przybył et al.，2016）。在本研究中，花榈木的胚性愈伤组织、体胚和体胚分化诱导率均以添加30 g·L-1蔗糖最高，与前人对龙眼（赖钟雄，1997）和云杉（Hazubska-Przybył et al.，2016）的研究结果类似。花榈木胚性愈伤组织可溶性糖和淀粉含量随蔗糖浓度升高整体呈逐渐升高的趋势，前人在红花玉兰（Magnolia wufengensis）（宁娜娜等，2018）、栓皮栎（Quercus variabilis）（辛福梅，2007）和云杉（Hazubska-Przybył et al.，2016）体胚诱导中也得出了类似的结果。究其原因可能是适当的蔗糖浓度不仅促进组织的生长，调控着细胞内外糖代谢的信号分子应答，诱导了ABA水平上升，提高了糖代谢过程中SS和SPS酶活性，促进了糖分的积累（陈俊伟等，2004）; 凌亚杰等（2018）报道随外源糖浓度升高，SS和SPS酶活性相应增强，糖分含量增加，从而影响到细胞组织的形态建成（Cangahuala-Inocente et al.，2014），使得胚性愈伤组织糖含量较高，却抑制了体胚发育进程。这些研究结果证明高浓度的蔗糖虽然促进了花榈木胚性愈伤组织糖分的积累，但是抑制了体胚诱导。
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图1 花榈木在培养基中添加谷氨酰胺的体胚发生
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Fig.1 Somatic embryogenesis of Ormosiahenryi in medium supplemented with glutamine
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图2 不同碳源对愈伤组织、体胚和体胚分化诱导的影响
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Fig.2 Effects of different carbon sources on callus, SE and SE differentiation induction
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图3 不同蔗糖浓度对愈伤组织、体胚和体胚分化诱导的影响
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Fig.3 Effects of different carbon sources on callus, SE, SE differentiation induction
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图4 不同有机氮源对愈伤组织、体胚和体胚分化诱导的影响
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Fig.4 Effects of different organic nitrogen sources on callus, SE and SE differentiation induction
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3.3 氮源对花榈木体胚发生诱导的影响
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有机氮源（谷氨酰胺、水解酪蛋白和水解乳蛋白）可提高培养基NH4+与N03-比例，改变C/N的比值，促进龙舌兰（Reyes-Díaz et al.，2017）和落叶松（齐力旺，2000）胚胎的生长发育。本研究中，添加有机氮源的处理花榈木胚性愈伤组织和体胚诱导率均高于对照（N0），其中，胚性愈伤组织诱导率以添加谷氨酰胺（N1）最高，类似的结果在三叶无患子胚性愈伤组织诱导中被报道（Asthana et al.，2017）。这可能与花榈木对氮元素（NH4+与N03-）的吸收和利用效率有关。因为谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）是植物体内氮代谢同化作用的关键酶，其中，GS通过氮素同化作用，利用ATP分解释放的能量，将无机氮催化为谷氨酰胺和谷氨酸供植物利用（刘云菲等，2021）; 若GS活性低，植物体内合成的蛋白质不足或低于植物生长所需阈值，植物生理代谢和生长发育将受影响，而外源谷氨酰胺的添加利于植物对其的吸收和利用，提高了GS和NR的活性，促进蛋白质的形成（罗慧和李伏生，2020），为花榈木胚性愈伤组织的正常发育提供氮源保障。与对照（N0）相比，有机氮源（N1-N6）处理促进花榈木胚性愈伤组织中可溶性蛋白含量的积累，相反，N1-N6处理花榈木胚性愈伤组织可溶性糖含量却较低，辛福梅（2007）在栓皮栎中也发现类似的结果。这可能与N0处理中培养基C/N比相对较高，利于可溶性糖的合成，而添加有机氮源（N1-N6），培养基C/N比值降低，促进可溶性蛋白的积累有关。
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同一列不同小写字母代表在 P＜0.05 水平下的显著性差异。下同。
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Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P＜ 0.05) . The same below.
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综上分析得出结论:碳氮源影响花榈木胚性愈伤组织的诱导、发育和有机物的积累，从而影响其体胚诱导率，但对体细胞胚分化的影响不显著。培养基中添加30 g·L-1蔗糖和500 mg·L-1谷氨酰胺可以促进花榈木胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导。
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摘要
为探讨花榈木体胚发生过程中不同碳氮源处理对胚性愈伤组织诱导、发育和有机物积累的影响,并筛选出有利于花榈木体胚发生的碳氮源,优化体胚发生体系,该研究以成熟胚为外植体,通过单因素试验分析3种碳源、4种蔗糖浓度和6种氮源处理下胚性愈伤组织诱导、发育和有机物积累的差异。结果表明:(1)蔗糖中胚性愈伤组织诱导率显著高于葡萄糖和麦芽糖,但其体胚诱导率、体胚分化率、胚性愈伤组织可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量差异不显著。(2)随着蔗糖浓度的升高,胚性愈伤组织、体细胞胚(体胚)诱导率、体胚分化率、胚性愈伤组织重量和可溶性蛋白含量呈先升高后降低的趋势,均以添加30 g·L-1蔗糖最高,而胚性愈伤组织可溶性糖和淀粉含量呈增加的趋势。(3)在6种氮源处理中,胚性愈伤组织诱导率以添加500 mg·L-1谷氨酰胺的处理最高,体胚诱导率则以添加谷氨酰胺和水解酪蛋白的处理较高,但不同氮源处理间体胚分化率无差异;添加有机氮源的处理其胚性愈伤组织可溶性蛋白含量显著高于无氮源处理。总之,不同的碳氮源通过影响花榈木胚性愈伤组织的诱导、发育和有机物的积累,从而影响其体胚诱导率,但对体胚分化率影响不显著。初步认为30 g·L-1蔗糖和500 mg·L-1谷氨酰胺作为碳氮源可促进花榈木体胚发生诱导。
Abstract
In order to study the effects of different carbon and nitrogen sources treatments on the embryogenic callus (EC) induction, development and organic matter accumulation during somatic embryogenesis process in Ormosia henryi, and to screen the carbon and nitrogen sources conducive to somatic embryogenesis and optimize somatic embryogenesis system in O. henryi. Mature embryos were used as explants in O. henryi, the differences of EC induction, development and organic matter accumulation under three kinds of carbon sources, four kinds of sucrose concentrations and six kinds of nitrogen sources treatments were analyzed by single factor experiment. The results were as follows: (1) EC induction rate in medium supplemented with sucrose was significantly higher than with glucose and maltose, while there was no significant difference in somatic embryo (SE) induction rate, SE differentiation rate and the contents of soluble sugar, starch and soluble protein with EC. (2) With the increase of sucrose concentration, EC, SE induction rate, SE differentiation rate, EC weight and soluble protein content first increased and then decreased, which was the highest in 30 g·L-1 sucrose, while the soluble sugar and starch contents of EC showed an increasing trend. (3) In six kinds of nitrogen sources treatments,EC induction rate was the highest in 500 mg·L-1 glutamine, SE induction rates were higher in glutamine and casein hydrolysate, but there were no differences in SE differentiation rates, the soluble protein content of EC in the treatment with organic nitrogen source was significantly higher than that in the treatment without organic nitrogen source. In summary, the different carbon and nitrogen sources affected the induction, development and the organic matter accumulation of EC, and affected SE induction rate, but there were no significant differences in the SE differentiation rate. The study suggests that 30 g·L-1 sucrose and 500 mg·L-1 glutamine as carbon and nitrogen sources can promote SE induction in O. henryi.
