-
氮素在植物的生长过程中是一种非常重要的营养元素，因为它可以用来合成蛋白质、氨基酸、叶绿素等重要的氮化合物（Marschner，1995）。尿素是全世界使用最普遍的化肥之一。因为脲酶——一种细菌分泌的可以降解尿素的酶，在土壤中几乎无处不在，大部分施入土壤中的尿素被脲酶分解为氨和二氧化碳，所以通常情况下土壤中尿素的浓度很低，不足以作为单一氮源满足植物生长需要（Kojima et al.，2006）。但是研究发现，施到土壤中的尿素存在1~8 d的半衰期（Liu et al.，2003a），在这期间土壤中会有一个较高浓度的尿素存在，为植物根系从土壤吸收尿素提供了宝贵的时间。至今为止，在植物中仅发现2类尿素转运蛋白，一类是具有低亲和力尿素运输能力、介导尿素被动迁移的MIPs（Major Intrinsic Proteins），这是一类水通道蛋白，它们通常定位到细胞质膜及液泡膜上（Liu et al.，2003b）; 另一类是具有高亲和力尿素运输能力、介导尿素主动跨膜运输的属于钠离子/溶质共运蛋白家族（sodium/solute symporter family，SSS family）的DUR3同源蛋白，该类跨膜蛋白定位在质膜，且DUR3基因受到外界缺氮条件的诱导表达（Liu et al.，2003a; Liu et al.，2003b; Kojima et al.，2007）。DUR3的生理贡献不只局限于氮缺乏条件下的植物根部，在衰老的叶片中同样发挥一定的作用（Bohner et al.，2015）。植物体内的尿素不仅只能从外源土壤中获得，还能够从体内二次氮代谢的合成中获得，衰老叶片中尿素含量的增加就证明了这一观点（Bohner et al.，2015）。Bohner等（2015）对拟南芥的研究显示，AtDUR3基因在衰老叶片的维管组织中大量表达，DUR3能够将叶片衰老引起的氮化合物降解生成的尿素从叶肉细胞运送到质外体，这表明DUR3是植物体内氮素再分配的一个非常重要的转运通道蛋白。运用反向遗传学研究方法证实，在氮素缺乏的大田里，OsDUR3基因插入系植株的水稻籽粒灌浆差，与正常的水稻相比，产量降低了26.2%; 在种子发育期，OsDUR3基因插入系植株的水稻氮素主要积累在叶片中，花絮不能得到充分的发育; 来自OsDUR3基因插入系植株老叶片的水稻尿素含量低于正常水稻。综上表明，在氮素缺乏的大田条件下DUR3参与了氮素转运和水稻产量（Beier et al.，2019）。
-
目前，只有拟南芥（Arabidopsis thaliana，AtDUR3）（Liu et al.，2003a）、水稻（Oryza sativa，OsDUR3）（Wang et al.，2012b）、玉米（Zea mays，ZmDUR3）（Zamin et al.，2014; Liu et al.，2015）这3个高等植物的DUR3基因被克隆并验证了分子生理功能，这些研究都是围绕DUR3主动运输尿素开展。在酵母中的研究表明，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的ScDUR3和白假丝酵母菌（Candida albicans）CaDUR3除了具有转运尿素的功能以外，还能够转运多胺（Uemura et al.，2006; Kumar et al.，2011）。多胺是一类脂肪族小分子化合物，可广泛地参与到植物生长发育的各个阶段，同时对植物响应外界胁迫环境具有非常重要的作用（Groppa &Benavides，2008），但是在植物中尚未发现转运多胺的蛋白。因此，植物DUR3同源蛋白是否具有转运多胺的功能值得进一步研究。
-
棉花是人类获取植物纤维的主要农作物，陆地棉（Gossypium hirsutum）是当前全球最重要的棉花栽培品种，全球90%以上棉田种植的都是陆地棉。陆地棉基因组是AADD型异源四倍体，使得棉花基因组庞大而复杂，很大程度限制了棉花分子生物学的研究进度。随着二倍体D亚组雷蒙德氏棉（G. raimondii）（Wang et al.，2012a）和A亚组亚洲棉（G. arboreum）（Li et al.，2014）测序工作的完成，陆地棉遗传标准系TM-1全基因组序列也得以公布（Li et al.，2015; Zhang et al.，2015），在联合基因组研究所（Joint Genome Institute，JGI）上已经引入了陆地棉和雷蒙德氏棉基因组，这必将加速棉花功能基因的研究进度。本文从JGI上的陆地棉和雷蒙德氏棉基因组中鉴定棉花的DUR3基因，并进行相关生物信息学分析，可为该基因进一步的克隆和功能验证提供理论基础。
-
1 材料与方法
-
1.1 材料
-
从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索获得如下物种DUR3基因的序列:拟南芥（Arabidopsis thaliana，AtDUR3，NP_199351）、水稻（Oryza sativa，OsDUR3，NP_001065513）、玉米（Zea mays，ZmDUR3，KJ652242）、高粱（Sorghum bicolor，SbDUR3，XP_002438118.1）、谷子（Setaria italica，SiDUR3，XP_004965066.1）、番茄（Solanum lycopersicum，SlDUR3，XP_004245999.1）、葡萄（Vitis vinifera，VvDUR3，XP_002263043.1）、大豆（Glycine max，GmDUR3，XP_003523904.1）、大麦（Hordeum vulgare，HvDUR3，BAJ94433.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon，BdDUR3，XP_003571687.1）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，MtDUR3，XP_003612583.1）、毛果杨（Populus trichocarpa，PtDUR3，XP_002303472.2）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，ScDUR3，L19875.1）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans，AnDUR3，ACZ62639.1）、条斑紫菜（Pyropia yezoensis，PyDUR3，BAU04114.1）、长牡蛎（Crassostrea gigas，CgDUR3，XP_019929725.1）、砗磲（Tridacna squamosa，TsDUR3，MF073181.1），从JGI的Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）获得上面所述植物DUR3基因的编码区及CDS序列信息。
-
1.2 棉花DUR3基因的鉴定及生物信息学分析
-
1.2.1 棉花DUR3基因的鉴定
-
以拟南芥AtDUR3基因的蛋白质序列（NCBI登录号: NP_199351）为探针，在Phytozome陆地棉（Gossypium hirsutum）和雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）基因组BLAST搜索获得E值小于e-10的同源序列，将获得的序列（棉花和拟南芥）利用InterProscan5（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）在线分析其功能结构域的存在情况，最终确定目标序列。
-
1.2.2 植物DUR3基因基本信息的获取
-
棉花及本研究所需植物DUR3基因的编码区长度、CDS序列长度、外显子个数等信息均从Phytozome数据库中获得; 利用ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）在线分析中所获得植物DUR3基因氨基酸序列的分子量、等电点等基本信息。
-
1.2.3 DUR3基因的生物信息学分析
-
运用DNAMAN软件对不同植物DUR3基因的氨基酸序列进行多重序列比对; 采用MEGA6软件和Neighbor-Joining 法对不同物种的DUR3蛋白质序列构建进化树，校验参数Bootstrap=1 000; 利用Lasergene软件的MegAlign分析不同植物DUR3基因氨基酸序列间的相似性; 利用MEME（http://meme.sdsc.edu/meme/meme.html）鉴定分析植物DUR3蛋白质序列保守基序; 利用TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）在线预测植物DUR3蛋白序列的跨膜结构域; 采用GSDS9（Gene Structure Dispely Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）（Hu et al.，2015）在线绘制不同植物DUR3基因结构图; 采用DnaSPv5计算获得棉花DUR3旁系同源基因和直系同源基因的非同义替换（Ka）和同义替换（Ks），计算出Ka/Ks比值。
-
2 结果与分析
-
2.1 棉花DUR3基因的鉴定及序列基本信息
-
从陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组中共鉴定出2个DUR3同源基因，一个是位于A03亚基因组的Gohir.A03g179800基因，另一个是位于D08亚基因组的Gohir.D08g001500基因，为表述方便，将Gohir.A03g179800基因命名为GhDUR3.1，将Gohir.D08g001500基因命名为GhDUR3.2。从雷蒙德氏棉基因组中鉴定出1个DUR3同源基因Gorai.005G228700，命名为GrDUR3。用InterProscan5分析这3个DUR3基因的氨基酸序列，它们都属于Sodium/solute symporter（IPR001734）蛋白家族下的Urea active transporter（IPR031155）家族，都具有cd11476（Na+/urea-polyamine cotransporter DUR3，and related proteins; solute-binding domain）这一功能结构域。
-
从表1可以看出，不同植物DUR3基因的编码区长度存在较大差异，从OsDUR3基因的2 358 bp到ZmDUR3基因的5 567 bp，最长和最短相差3 209 bp。然而，植物DUR3基因CDS序列长度的差别却不大，最短的是GhDUR3.1，长度为2 034 bp; 最长的是BdDUR3，长度为2 214 bp，相差仅为180 bp。植物DUR3基因外显子的个数分为两类，双子叶植物外显子个数普遍较多，为9个或10个; 单子叶植物外显子个数普遍较少，为3个或4个。植物DUR3基因推测的多肽的长度（677~737 a.a）和分子量（72.905~77.608 kDa）都相差不大，等电点只有SiDUR3的小于7，其他的都高于7而处于碱性范围。
-
2.2 植物DUR3蛋白氨基酸序列比对
-
用DNAman对选取的拟南芥、水稻、玉米、高粱（Sorghum bicolor）、谷子（Setaria italica）、番茄（Solanum lycopersicum）、葡萄（Vitis vinifera）、大豆（Glycine max）、大麦（Hordeum vulgare）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、毛果杨（Populus trichocarpa）等不同层面模式植物和本研究鉴定出棉花的共15条DUR3蛋白氨基酸序列进行多重序列比对，如图1所示，这15条序列的一致性达到79.81%，不一致区段主要存在于序列的两端，中间的功能区域部分一致性很高。BdDUR3和MtDUR3序列一致性最低，为71.8%; GhDUR3.2和GrDUR3序列一致性最高，为99.3%。
-
2.3 植物DUR3基因蛋白质保守基序分析
-
采用MEME在线分析获得这14个不同植物的15个DUR3蛋白基序信息，这15个蛋白序列都包含3个不同基序。如图2所示，这3个基序在氨基酸序列上的分布位置基本一致，出现的顺序都是3号基序在前，1号基序紧随其后，2号基序在最后面（靠近氨基酸序列的中间位置）。如图3所示，1号基序和2号基序都有50个氨基酸组成，3号基序有33个氨基酸组成，这3个基序的保守性都很高。
-
2.4 植物DUR3跨膜域预测
-
Cao等（2009）研究表明，DUR3属于跨膜蛋白，所以有必要分析不同植物DUR3蛋白质的跨膜域情况。利用TMHMM Server v.2.0在线对这15条DUR3蛋白质的跨膜结构进行预测（表2），15条DUR3蛋白质都包含15个跨膜域（图4），并且这些跨膜域在氨基酸序列上存在的位置也都非常相似。
-
图1 不同植物DUR3蛋白氨基酸多重序列比对
-
Fig.1 Multiple sequence alignment of DUR3 protein amino acid in different plants
-
2.5 植物DUR3基因结构分析
-
根据在JPG搜索获得的不同植物15个DUR3基因的编码区序列和CDS序列，用GSDS2.0软件在线绘制DUR3基因结构图，以此来分析这14种植物DUR3基因的外显子和内含子情况。表1已经对植物DUR3基因外显子的个数进行了分析，双子叶植物外显子个数平均为9.2个，单子叶植物外显子个数平均为3.5个，双子叶植物DUR3基因外显子的个数要明显多于单子叶植物（图5）。从图5可以看出，具有相同外显子个数的基因所对应外显子的长度也基本一致，如GhDUR3.2、GmDUR3、GrDUR3、MtDUR3、PtDUR3、SlDUR3、VvDUR3等具有9个外显子的基因，BdDUR3、HvDUR3、OsDUR3这3个具有3个外显子的基因，SbDUR3、SiDUR3、ZmDUR3这3个具有4个外显子的基因。
-
图2 不同植物DUR3蛋白基序分布
-
Fig.2 Motif locations of DUR3 proteins in different plants
-
图3 不同植物DUR3蛋白基序序列
-
Fig.3 Motif sequences of DUR3 proteins in different plants
-
2.6 DUR3基因系统发育分析
-
为了分析DUR3基因在不同物种间的进化关系，选取了植物、真菌、藻类、软体动物等4类共20个DUR3蛋白多肽序列通过MEGA6软件构建进化树。结果（图6）表明，所有的植物聚集在一个分支，两个真菌[酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，ScDUR3）和构巢曲霉（Aspergillus nidulans，AnDUR3）]聚在一个分支，两个软体动物[长牡蛎（Crassostrea gigas，CgDUR3）和砗磲（Tridacna squamosa，TsDUR3）]聚在一个分支，藻类[条斑紫菜（Pyropia yezoensis，PyDUR3）]单独一个分支，所有的单子叶植物和双子叶植物又分别聚集在两个不同的分支。
-
2.7 植物DUR3同源基因非同义突变率与同义突变率的比值分析
-
先利用MEGA6的ClustalW对所有植物的DUR3同源基因的CDS序列进行比对，然后用DnaSPv5计算获得旁系同源基因和直系同源基因的非同义替换（Ka）和同义替换（Ks），计算出Ka/Ks比值。从表3可以看出，除了GhDUR3.2和GrDUR3以外，其他的DUR3直系同源基因间的Ka/Ks比值均大于1，表明DUR3基因在不同植物间的进化过程中受到正向选择的作用。陆地棉DUR3两个旁系同源基因的Ka/Ks比值为4.12，也大于1，表明陆地棉DUR3基因在自身内的进化过程中同样受到正向选择的作用。
-
图4 陆地棉GhDUR3.1蛋白跨膜结构域预测分析
-
Fig.4 Transmembrane structure prediction analysis of the GhDUR3.1 protein in Gossypium hirsutum
-
图5 不同植物DUR3基因外显子和内含子结构
-
Fig.5 Exon and intron structures of DUR3 genes in different plants
-
3 讨论与结论
-
在二倍体基因组植物中，DUR3同源基因以单一的基因模式（singleton）存在（曹凤秋等，2009）。本研究结果也证实，文中所述植物除了陆地棉是异源四倍体（AADD），其他植物皆属于二倍体，它们的DUR3基因在各自的基因组中都是单一的基因模式。因为陆地棉是异源四倍体（AADD），其基因组有A亚组和D亚组组成，所以鉴定出的两GhDUR3.1和GhDUR3.2分属于A亚组和D亚组的基因。雷蒙德氏棉是D亚组二倍体棉花，其基因组的GrDUR3基因与同位于D亚组的GhDUR3.2基因的CDS序列和多肽序列相似度均高于99%，这两个基因的基本信息除了编码区序列长度和氨基酸多肽分子量存在微小差异以外，其他都完全一致，就连多肽序列预测的跨膜结构域位置也完全一致，可见这两个基因在分子生理功能上也必将高度吻合。
-
图6 不同物种DUR3氨基酸序列进化树分析
-
Fig.6 Phylogenetic tree analysis of DUR3 proteins in different species
-
整体而言，本文所列举的植物DUR3氨基酸序列的一致性接近80%，对这些蛋白序列的等电点、跨膜结构域、基序等的分析都表明植物DUR3具有比较高的保守性。植物DUR3多肽序列只有SiDUR3的等电点略低于7，为6.89，其他的等电点基本上都高于7，其中SlDUR3的等电点最高，达到9，表明植物DUR3通常情况下属于碱性蛋白（表1）。植物DUR3都具有3个基序，这3个基序高度保守，而且在氨基酸序列的排布上也高度一致。植物DUR3的跨膜结构域数量相同，都包含15个跨膜结构域，并且这些跨膜结构出现在氨基酸序个列的位置也相似。陆地棉GhDUR3.1和GhDUR3.2、雷蒙德氏棉GrDUR3都符合上面的共性。
-
注: Ka. 非同义替换; Ks. 同义替换。
-
Note: Ka. Non-synonymous substitution; Ks. Synonymous substitution.
-
在进化关系上，不同物种DUR3氨基酸序列进化树的结果表明，这些基因还是根据物种间种属亲缘关系的远近而进行了聚类，植物的DUR3氨基酸序列聚集在一起，真菌的聚集在一起，软体动物的聚集在一起，藻类单独在一个分支，植物又根据单子叶植物纲和双子叶植物纲又分属各自的分支（图6）。棉花属于双子叶植物，所以它聚在双子叶植物的大分支上，其中棉花的3个DUR3亲缘关系最近聚在一个分支。
-
DUR3直系同源基因和旁系同源基因的Ka/Ks比值普遍均大于1，说明这些基因在进化过程中主要受到正向选择的作用。此外，植物DUR3的基因结构具有一定的规律可以遵循，DUR3基因的外显子个数的分析结果表明，双子叶植物的外显子个数普遍较多，单子叶植物的外显子个数普遍较少。本研究结果为研究植物DUR3基因的结构进化提供了理论参考。
-
参考文献
-
BEIER MP, FUJITA T, SASAKI K, et al. , 2019. The urea transporter DUR3 contributes to rice production under nitrogen-deficient and field conditions [J]. Physiol Plantarum, 167(1): 75-89.
-
BOHNER A, KOJIMA S, HAJIREZAEI M, et al. , 2015. Urea retranslocation from senescing Arabidopsis leaves is promoted by DUR3-mediated urea retrieval from leaf apoplast [J]. Plant J, 81(3): 377-387.
-
CAO FQ, LIU GW, WANG WH, et al. , 2009. Molecular processes of urea metabolism and transport in higher plants [J]. Chin Bull Bot, 44 (3): 273-282. [曹凤秋, 刘国伟, 王伟红, 等, 2009. 高等植物尿素代谢及转运的分子机理 [J]. 植物学报, 44(3): 273-282. ]
-
GROPPA MD, BENAVIDES MP, 2008. Polyamines and abiotic stress: recent advances [J]. Amino Acids, 34(1): 35-45.
-
HU B, JIN JP, GUO AY, et al. , 2015. GSDS 2. 0: an upgraded gene feature visualization server [J]. Bioinformatics, 31(8): 1296-1297.
-
KOJIMA S, BOHNER A, GASSERT B, et al. , 2007. AtDUR3 represents the major transporter for high-affinity urea transport across the plasma membrane of nitrogen-deficient Arabidopsis roots [J]. Plant J, 52(1): 30-40.
-
KOJIMA S, BOHNER A, NICOLAUS VON WIRÉN. 2006. Molecular mechanisms of urea transport in plants [J]. J Membr Biol, 212(2): 83-91.
-
KUMAR R, CHADHA S, SARASWAT D, et al. , 2011. Histatin 5 uptake by Candida albicans utilizes polyamine transporters Dur3 and Dur31 proteins [J], J Biol Chem, 286(51): 43748-43758.
-
LI FG, FAN GY, WANG KB, et al. , 2014. Genome sequence of the cultivated cotton Gossypium arboreum [J]. Nat Genet, 46(6): 562-574.
-
LI FG, FAN ZY, LU GH, et al. , 2015. Genome sequence of cultivated Upland cotton (Gossypium hirsutum TM-1) provides insights into genome evolution [J]. Nat Biotechnol, 33(5): 524-530.
-
LIU GW, SUN AL, LI DQ, et al. , 2015. Molecular identification and functional analysis of a maize (Zea mays) DUR3 homolog that transports urea with high affinity [J]. Planta, 241(4): 861-874.
-
LIU LH, LUDEWIG U, WOLF B FROMMER, et al. , 2003a. AtDUR3 encodes a new type of high-affinity urea/H+ symporter in Arabidopsis [J]. Plant Cell, 15(3): 790-800.
-
LIU LH, LUDEWIG U, GASSERT B, et al. , 2003b. Urea transport by nitrogen-regulated tonoplast intrinsic proteins in Arabidopsis [J]. Plant Physiol, 133(3): 1220-1228.
-
MARSCHNER H, 1995. Mineral nutrition of higher plants [M]. London: Academic Press: 889.
-
UEMURA T, KASHIWAGI K, IGARASHI K, 2006. Polyamine uptake by DUR3 and SAM3 in Saccharomyces cerevisiae [J]. J Biol Chem, 282(10): 7733-7741.
-
WANG KB, WANG ZW, LI FG, et al. , 2012a. The draft genome of a diploid cotton Gossypium raimondii [J]. Nat Genet, 44(10): 1098-1103.
-
WANG WH, KÖHLER B, CAO FQ, et al. , 2012b. Rice DUR3 mediates high-affinity urea transport and plays an effective role in improvement of urea acquisition and utilization when expressed in Arabidopsis [J]. New Phytol, 193(2): 432-444.
-
ZAMIN L, TOMASI N, WIRDNAM C, et al. , 2014. Isolation and functional characterization of a high affinity urea transporter from roots of Zea mays [J]. BMC Plant Biol, 14(1): 222.
-
ZHANG TZ, HU Y, JIANG WK, et al. , 2015. Sequencing of allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum L. acc. TM-1) provides a resource for fiber improvement [J]. Nat Biotechnol, 33(5): 531-537.
-
摘要
植物DUR3同源蛋白属于钠离子/溶质共运蛋白家族的尿素高亲和力运输蛋白,在植物体对外源尿素的主动吸收及内源尿素的再分配过程中具有重要作用。为明确棉花DUR3基因的结构和进化情况,基于生物信息学的方法,从全基因组水平鉴定陆地棉和雷蒙德氏棉的DUR3基因,并对基因结构、跨膜结构域、基序分布、进化关系等进行分析。结果表明:(1)从陆地棉A亚组和D亚组染色体各鉴定出1个DUR3基因,从雷蒙德氏棉基因组鉴定出1个DUR3基因。这3个棉花DUR3同源蛋白同其他植物DUR3同源蛋白一样,具有15个跨膜结构域,具有3个位置一致、高度保守的基序。(2)基因结构分析表明,双子叶植物DUR3基因的外显子个数明显多于单子叶植物,这3个棉花DUR3基因的外显子个数亦是如此。(3)根据物种间种属亲缘关系,对不同物种DUR3氨基酸序列构建的进化树显示,棉花的同双子叶植物的聚在一起。(4)DUR3直系同源基因和旁系同源基因的Ka/Ks比值普遍均大于1,说明这些基因在进化过程中主要受到正向选择的作用。该研究结果为深入研究棉花DUR3同源蛋白提供了理论基础。
Abstract
Plant DUR3 homologous protein is a high affinity urea transporter which belongs to the family of sodium/solute symporter family, and plays an important role in the active absorption of exogenous urea and redistribution of endogenous urea by plants. The purpose of this study was to clarify structure and evolution situation of cotton DUR3 gene. Based on bioinformatics methods, DUR3 genes were identified from Gossypium hirsutum and G. raimondii genomic sequences, and then the gene structure, transmembrane domain, motif location, as well as phylogenetic relationship, were systematically analyzed. The results were as follows: (1) Three DUR3 genes were identified from the A and D subgroup chromosomes of upland cotton and G. raimondii genomic sequences. These three cotton DUR3 homologous proteins, like other plant DUR3 homologous proteins, had 15 transmembrane domains and three highly conserved motifs with consistent positions. (2) The gene structure analysis showed that the number of exons of DUR3 genes in dicotyledons was significantly higher than that in monocotyledons, and so were the cotton DUR3 genes. (3) Phylogenetic analysis revealed that the amino acid sequences of different species were classified according to species kinship, and cotton clustered in one branch with dicotyledons. (4) The Ka/Ks values of orthologous and paralogous DUR3 genes were generally more than one, indicating that those genes mainly experienced positive selection among evolution. The results of this study provide a theoretical basis for further research on cotton DUR3 homologous protein.
Keywords
Gossypium hirsutum ； G. raimondii ； DUR3 gene ； bioinformatics ； evolution
