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八角（Illicium verum）又称大茴香、八月珠，是中国传统香料和药用植物，属于八角科（Illiciaceae）八角属（Illicium）。它原野生于中国南亚热带地区，主要分布于中国云南、广西、广东等省区以及越南（马锦林等，2006; Wang et al.，2011; Sun et al.，2019; 黄开顺等，2020a）。
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八角的主要利用部位是果实和枝叶，可干制后整颗使用或制成五香粉，是优质的烹饪调味香料。其干燥果实也被广泛认为是医药原料，可作为食疗中药材，具有镇痛、止咳、健胃、祛寒湿之效，并且还被认为可用于治疗神经衰弱及消化不良等症（马锦林等，2006; 何冬梅等，2009）。以八角叶片和果实为原料提取的挥发油又称茴香油，是食品工业中的重要添加香料，亦是香皂、香水、牙膏及化妆品等日化用品中不可缺少的常用加香剂（王琴等，2005; Chouksey et al.，2010; 叶志敏，2011; 李萍等，2016）。此外，在工业上茴香油也被用作涂料填充剂及无氰电镀添加剂等（马锦林等，2006）。八角中还含有多种医用有效成分，如八角中富含的莽草酸是合成禽流感防治药物“达菲”（磷酸奥司他韦）的重要原料（王祖磊和朱祥瑞，2010），草蒿脑则可用于合成新一代抗抑郁药“文拉法新”（梁忠云和王国聪，2010）。
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广西和云南是最早开展八角育种工作的主要省区。20世纪80年代，广西林业科学院就已经开始了八角资源调查、品种分类以及优株筛选等工作。随着一些八角优良单株被初步筛选培育出来以及嫁接技术的进步，八角无性系造林试验在广西主要的八角产区陆续启动。
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八角是“药食两用”的经济树种，其挥发油含量及组分是重要的经济性状之一，将其作为指标进行优株选育，进一步筛选所需化学型的八角品种是较为传统的做法（叶志敏，2011）。现代育种技术借助于分子生物学手段实施分子设计育种，虽然具有指向性强、育种速度快等优势，但需要有一定的研究基础方能开展。目前，八角分子生物学层面研究报道极少，挥发油合成代谢途径及其调控机制不明，极大地制约了八角分子育种的发展。转录组测序技术因其能够从特定基因组的整体层次上研究基因结构及基因表达量，能揭示特定生物学过程中的分子机理，所以在植物分子育种等领域已被广泛应用。耿秀文等（2021）利用转录组数据对东紫苏（Elsholtziabodinieri）单萜合成相关基因进行研究，系统地分析了单萜合成代谢通路并成功验证了6个单萜合成相关基因，为东紫苏挥发油单萜合酶的克隆提供了基因资源。时小东等（2018）采用转录组测序方法对厚朴（Houpoea officinalis）次级代谢途径进行研究，总结出厚朴苯丙素和萜类基因调控网络，明确了关键酶的基因信息，为在分子水平上改造厚朴代谢途径和目标产物的定向合成提供基础。杨国等（2019）借助高通量测序技术对白术（Atractylodesmacrocephala）倍半萜合成途径展开分析，确定了其中的关键酶基因，极大地推动了白术分子育种的进展。这种基于转录组测序技术的合成代谢途径分析也在白芷（Angelica dahurica）（吴萍等，2020）、五味子（Schisandra Chinensis）（陈春宇，2020）等中草药植物中取得了较好的研究结果，证明了这种方法的有效性和可靠性。
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本研究以挥发油含量与组分差异显著的优良无性系桂角69号与普通品种砧01号为研究对象，采用高通量测序技术对两个品种叶片进行转录组测序，通过转录组组装、注释、GO分类和KEGG通路分析等方法对叶片中差异表达基因进行挖掘，拟探讨以下问题:（1）挥发油表型差异显著的两品种在转录水平上有哪些差异;（2）这些差异表达的基因参与哪些生物学过程、代谢通路，其中有哪些与挥发油合成相关。本研究有助于深入发掘八角挥发油合成相关的关键基因，为下一步八角分子设计育种提供候选基因。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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供试材料为八角优良无性系桂角69号和普通品种砧01号的15年生苗木，采自广西林科院八角种质资源收集圃。砧01号叶片椭圆形，叶尖渐尖; 桂角69号叶片椭圆形，叶尖凸尖（图1）。选择10月中旬晴朗天气采样，在树冠外围东、西、南、北4个方向各采集成熟、完整、无病虫害叶片15片，混合后置于液氮中速冻带回实验室保存，用于挥发油检测及转录组测序。
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图1 砧01号与桂角69号叶片形态
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Fig.1 Leaf morphology of Zhen 01 and Guijiao 69
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1.2 方法
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1.2.1 挥发油提取及测定
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称取鲜叶装入圆底烧瓶中，连接挥发油提取器和冷凝器，蒸馏速率控制在2~3 mL·100 min-1，蒸馏至挥发油不再增加后停止加热，冷却10 min，读取刻度管中挥发油毫升数，计算挥发油含量。
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取挥发油按照GB/T15068—2008《八角茴香（精）油》所述方法使用Agilent6890N气相色谱仪进行分析，具体分析条件为:HP-FFAP柱（30 m×320 μm × 0.5 μm），柱温60℃，汽化室250℃，检测室300℃，2℃·min-1程序升温60℃（1 min）至220℃（20 min），进样量0.2 μL，分流比100∶1，载气流速1.0 mL·min-1。采用面积归一化法计算挥发油组分含量。试验均重复3次，使用SPSS 19.0软件进行分析。
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1.2.2 RNA提取及转录组测序
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取叶片使用TRZol Universal总RNA提取试剂盒（天根）按说明书操作提取总RNA。RNA的完整性通过凝胶电泳的方法检测，RNA的浓度及纯度通过使用NanoDrop ND-2000 进行检测。检测合格后的RNA样品送至华大基因公司进行cDNA文库构建并使用BGISEQ-500平台测序。
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1.2.3 转录本组装及注释
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将测序得到的原始数据使用Trimmomatic进行过滤得到Clean Reads（Bolger et al.，2014），使用Trinity软件进行组装（Kim et al.，2015）。使用Tgicl软件将组装好的转录本进行聚类除去冗余以提高Unigene质量（Mehra et al.，2020）。对供试材料的6个样品转录本进行分析，桂角69号的3个生物学重复分别为标记为Guijiao 69_1、Guijiao 69_2和Guijiao 69_3，砧01号的3个生物学重复标记为Zhen 01_1、Zhen 01_2和Zhen 01_3。
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将得到的Unigene序列使用BLAST、Blast2GO、HMMSCAN软件（Altschul et al.，1997; Buchfink et al.，2015）与EuKaryotic Orthologous Groups（KOG）、Swiss-Prot、NR、NT、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、Pfam、Gene Ontology（GO）7个数据库进行对比，分析获得基因的注释信息。
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1.2.4 差异表达基因分析
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使用RSEM对各个样品的基因表达水平进行比对计算（Li &Dewey，2011），依据基因表达水平进行样本相关性及PCA分析。采用DESeq（Love et al.，2014）对差异表达基因进行分析，过滤掉平均表达量＜0.5的基因后，按照Q值＜0.05和log2|Fold change|≥1的标准筛选差异基因，并对差异基因分别进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。
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2 结果与分析
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2.1 叶片挥发油含量及组分分析
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两品种叶片的挥发油气相色谱检测结果显示其主成分差异较大，桂角69号主成分为草蒿脑，砧01号则为反式茴香脑（图2）。桂角69号中挥发油的总量和草蒿脑组分的含量都显著高于砧01号，分别为后者的1.8倍和68倍; 而其顺式茴香脑和反式茴香脑的含量显著低于砧01号，分别是前者的1/4和1/3; 两个品种中的水分含量差别不大，均为70%左右（表1）。
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2.2 转录组测序及组装注释
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参试样本共获得38.18 Gb数据，各样品过滤后Clean Reads数均高于42 M，碱基数均在6.3 Gb以上，各样品的GC含量稳定在45%~46%范围内，并且Q30质量值均在90%以上（表2）。参试6个样本Clean Reads数据SRA平台（http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/）登录号为PRJNA788720。
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组装后共获得84 182条转录本序列，平均长1 212 bp，N50长1 987 bp，平均GC含量为42.85%。编码基因数量为47 416，平均长1 218 bp，N50长1 581 bp，平均GC含量为45.13%。将转录本序列与NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、KOG、GO和Pfam数据库的比对，共获得59 161个基因序列的注释结果，注释基因比例为70.28%。分别有55 153（65.52%）、38 241（45.43%）、40 388（47.98%）、43 136（51.24%）、43 176（51.29%）、43 097（51.20%）、43 030（51.12%）个基因在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、KOG、Pfam、GO数据库中获得了注释。
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图2 挥发油成分气相色谱图
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Fig.2 GC chromatography of volatile oil components
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注: 同列不同字母表示0.05水平差异显著。
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Note: Different letters in the same column represent significant differences at 0.05 level.
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2.3 差异表达基因的筛选及分析
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样本相关分析结果显示，同组样本基因表达模式趋于一致且相关系数均在0.99以上，两个品种之间的相关系数约为0.80（图3:A），主成分分析结果表明两组样品之间相互独立（图3:B）。
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2.4 差异基因GO功能注释及富集分析
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两个品种样本中共筛选获得30 572个差异基因（DEGs），其中上调DEGs 15 025个，下调DEGs 15 547个。对DEGs进行GO功能注释和分析，确定其重要的生物学功能。本研究结果表明，共有20 287个DEGs获得注释，并划分为3大类、 54小类（图4）。生物学过程类别主要涉及细胞过程、代谢过程、单一机体过程; 细胞组分类别主要涉及细胞、细胞部件、细胞膜、细胞膜部件、细胞器5种细胞组分; 分子功能类别主要涉及结合和催化活性2种分子功能。DEGs富集分析结果显示，差异显著的只有生物学过程和分子功能（图5）。生物学过程中基因表达（GO:0010467，gene expression）富集基因较多，与砧01号相比，桂角69号中有1 327个基因上调，1 292个基因下调。差异最显著的2个GO条目分别与饥饿和营养相关（GO:0042594，response to starvation; GO:0031667，response to nutrient levels）。在分子功能方面，翻译起始因子活性（GO:0003743，translation initiation factor activity）和RNA结合翻译因子活性（GO:0008135，translation factor activity，RNA binding）为最显著富集GO条目。
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图3 样品相关性和主成分分析
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Fig.3 Sample correlation and principal component analysis
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2.5 差异基因KEGG功能注释及富集分析
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将30 572个DEGs与KEGG数据库进行比对，结果共有21 600个DEGs注释在133条通路上（图6:A）。KEGG生化代谢通路共分成5个生物过程，包括代谢、遗传信息过程、环境信息过程、细胞学过程和有机体系统。代谢中除去总的代谢目录，以糖代谢通路注释的基因最多（1 518），氨基酸代谢通路和脂质代谢通路次之，注释基因数分别为817、728。而在遗传信息过程中，翻译通路所含基因最多（1 513），折叠、分类和降解通路中含有1 048个DEGs。虽然另外3个生物过程所注释的通路较其他分类少，但是一些通路中含有的DEGs较多，如有991个DEGs位于信号转导通路，887个DEGs位于环境适应通路。值得注意的是，有63个DEGs位于不饱和脂肪酸合成相关通路，另有256个DEGs位于苯丙素合成通路。
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图4 差异基因的GO功能分类
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Fig.4 GO function classification of DEGs
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通过KEGG富集分析，确定DEGs富集的最主要通路（图6:B）。结果显示，脂肪酸生物合成和代谢通路都被富集。一些次生物质合成通路也被富集，如类固醇生物合成、类胡萝卜素合成、单萜生物合成、苯丙素生物合成等。部分次生代谢途径也有富集，如甘油磷脂代谢、生物素代谢、硫辛酸代谢、嘌呤代谢等。同时，与防御相关的激素通路如植物-病原菌相互作用、植物激素信号转导也被富集。
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2.6 挥发油物质合成途径分析
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八角叶片挥发油主要由单萜、倍半萜化合物以及苯丙素类芳香族化合物组成，故对与之合成相关的单萜生物合成、萜类骨架生物合成、苯丙素合成通路中的DEGs进行分析。
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单萜生物合成途径中发现芳樟醇合酶（LS）、月桂烯合酶（MYS）、β-荜澄茄烯合酶（CBS）基因呈现差异表达，其中LS在桂角69号中表达量远远高于砧01号（表3）。萜类骨架生物合成途径中4个关键酶基因呈现差异表达，分别参与MEP、MVA等合成途径，相关Unigene共10个。其中，与砧01号相比，香叶基香叶基焦磷酸合酶（GGPPS）基因在桂角69号中高表达。苯丙素合成通路中的肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）、咖啡酸3-O-甲基转移酶（COMT）、肉桂醇脱氢酶（CAD）等7个关键酶基因呈差异表达，其中咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶（CCoAOMT）基因在桂角69号中表达显著上调，而CYP73A基因则在砧01号中上调最为显著。
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图5 差异基因的GO功能富集
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Fig.5 GO function enrichment of DEGs
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2.7 转录因子差异表达基因分析
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根据基因注释结果，对其中差异表达的转录因子基因进行分析发现，DEGs分布于31个转录因子家族，其中MYB家族Unigene数量最多，共13个（表4）。其他与挥发油合成相关的转录因子家族如WRKY、bHLH、AP2-EREBP、bZIP、C2H2、C3H中分别具有9、6、4、3、10、9个Unigenes。值得注意的是，注释为bHLH转录因子MYC2的Unigene9952以及注释为MYB转录因子MYB111的Unigene15870在桂角69号中上调表达。
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3 讨论与结论
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八角茴香油在香精、食品工业以及医药中应用广泛，普遍认为反式茴香脑是茴香油的主要成分。茴香油中的草蒿脑，又名对烯丙基茴香醚，含量仅次于反式茴香脑，同为苯丙素类挥发性成分，具有浓郁的茴香香气和甜味，是构成茴香油特定香味的主要化合物之一，因此也常被用于生产食用香料（缪剑华等，2008; 梁忠云和王国聪，2010; 阳小勇和唐荣平，2018）。此外，由于草蒿脑具有较强的杀菌、退热、止咳、健胃、醒脑等生物活性而被广泛应用于农药、医药等领域（梁忠云和王国聪，2010）。近年来，草蒿脑多次被报道用于合成医药中间体茴香醛和对甲氧基苯乙酸，后者是合成血管扩张剂盐酸硫氮卓酮和新一代抗抑郁药“文拉法新”的重要原料，具有较高的应用前景（梁忠云和王国聪，2010）。因此，在丰富的八角种质资源中选育具有特色挥发油组分的八角品种，有助于八角茴香油的多元化开发利用，对于八角产业发展具有重要意义。
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图6 差异基因的KEGG通路注释和富集
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Fig.6 KEGG pathway annotation and enrichment of DEGs
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对于八角果实，无论是挥发油总量还是反式茴香脑等重要组分含量，不同采收期均存在一定的差异，且果实发育过程中，其生理过程也通常发生一系列变化，而叶片的挥发油物质含量相对较为稳定，特别是在秋季（王琴等，2011; 黄开顺等，2020b），因此本研究选择在10月份采集叶片进行挥发油分析其研究结果最具代表性。本研究发现，桂角69号除了在果产量、果角完好率等生产性状上优于普通品种砧01号以外，其叶片中总挥发油含量也显著高于后者，特别是其挥发油中主成分草蒿脑含量显著高于对照品种，具有非常鲜明的化学型特征。
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植物挥发油主要由萜类、苯丙素类等次级代谢产物组成。萜类生物合成途径已较为清晰，MVA途径和MEP途径提供的IPP经萜类合酶分别合成单萜、倍半萜、二萜等复杂多样的萜类化合物。HMGR和DXS分别是MVA途径和MEP途径中的关键酶基因，两者在桂角69号和砧01号中表达模式相反，提示砧01号中可能以MVA途径为主，而桂角69号则更倾向于通过MEP途径合成IPP。单萜生物合成途径中分析发现月桂烯合酶基因在桂角69号中大幅上调表达，有报道提出月桂烯合酶的催化产物有月桂烯、桧烯、沉香醇、柠檬烯等多种形式（徐应文等，2009），因此月桂烯合酶的高表达意味着桂角69号挥发油组分中可能具有更多、更丰富的单萜组分。另外，为二萜合成提供前体的GGPPS基因在桂角69号中高表达，则表明其可能含有更高的二萜组分，在后续研究中可进行针对性检测。在对两种叶片进行转录组分析中发现差异基因中有256个富集于苯丙素合成通路基因，其中包括CCR、COMT、CAD、4CL、PAL、CCoAOMT、CYP73A等关键酶基因。这些基因中大部分都在桂角69号中呈下调表达，仅有CCoAOMT在桂角69号中上调表达，且为大幅上调表达，可能与其高草蒿脑合成相关联。这里值得注意的是，O-甲基转移酶是苯丙素合成过程的重要的酶，可利用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体合成苯丙素类挥发性成分草蒿脑及茴香脑。一些茴香属植物的O-甲基转移酶的功能已被鉴定，例如在茴香（Foeniculum vulgare）中，对丙烯基苯酚O-甲基转移酶将反式-对丙烯基苯酚甲基化为反式茴香脑，而对烯丙基苯酚被烯丙基苯酚O-甲基转移酶甲基化后形成草蒿脑（Gross et al.，2002）。目前，对草蒿脑及茴香脑生物合成的机制仍然知之甚少，CCoAOMT不失为一个候选的研究切入点。转录因子调控是植物调节次生代谢的重要手段，bHLH、WRKY、MYB等转录因子广泛参与到萜类合成途径当中。本研究发现，注释为转录因子MYC2的Unigene9952以及注释为转录因子MYB111的Unigene15870在桂角69号中上调表达。MYC2通过茉莉酸信号转导在倍半萜化合物的生物合成中发挥作用（蒋玲，2017），MYB111则被报道正向调节黄酮醇生物合成（朱畇昊等，2019）。两者潜在的调控功能及其在桂角69号中的特异上调或许与桂角69号的高挥发油含量相关联，可作为候选基因深入研究。
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此外，叶片对八角植株的生长发育至关重要，不仅是八角合成和贮存养分的主要器官，还可以通过向花、果等器官输送养分平衡各器官间养分含量（黄开顺等，2012）。糖类物质代谢、氨基酸代谢及脂质代谢均是植物体内重要的新陈代谢过程，对植物的生长至关重要。在一定的程度上，糖代谢能反映植株的生长状态（吴晓俊等，2000; 胡珍兰等，2014），并且叶片糖代谢的变化能够影响果实的生长发育，例如，葡萄叶片糖含量及其相关代谢酶活性会对酿酒葡萄的品质和产量有显著影响（刘丽媛，2016; 胡紫璟，2016）。氨基酸主要被用于蛋白质合成，也可以作为次生代谢产物生物合成的前体和能量来源。它在植物的中枢代谢中具有许多重要作用，并且还在某些生理代谢途径中被认为是最终代谢物的中间产物，并参与调控多种代谢过程和其他各种生理生化途径，从而影响植物生长发育（Amir et al.，2018; Yang et al.，2018; Yang et al.，2020）。植物脂类包括广泛的化合物，如脂肪酸、甘油磷脂、半乳脂、鞘脂、甾醇和中性脂（例如，三酰基甘油、甾醇酯、角质、蜡和软木脂）（Ohlrogge &Browse，1995; Ischebeck，2016）。脂类作为主要的生物分子，在大多数生物中发挥着结构成分、可持续的碳及能量存储、活跃的信号传感器和表面覆盖物等重要作用（Li-Beisson et al.，2016）。植物叶片的角质层蜡也通常被定义为表面覆盖的脂类（Kunst &Samuels，2009）。桂角69号的五年平均产量、单果平均鲜重及果角完好率均远高于砧01号，且两者的转录组差异表达基因中包含大量糖代谢、氨基酸代谢及脂质代谢的相关基因，可从中筛选候选基因，鉴定其与八角植株生长间的关系，为分子辅助选育八角良株提供参考。
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本研究采用转录组测序技术对八角叶片基因表达特征进行分析，挖掘其中挥发油合成代谢通路及相关基因，获得的候选基因为下一步探究草蒿脑、茴香脑等挥发油特征组分的合成机制提供了参考，并为开展分子设计育种培育特定化学型的八角品种提供了研究基础。
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摘要
为更好地挖掘八角(Illicium verum)挥发油合成相关基因,该文对挥发油性状差异显著的优良无性系桂角69号及普通品种砧01号叶片进行了转录组测序及组装注释,并对差异表达基因进行了GO分类和KEGG通路分析。结果表明:(1)转录本经组装后获得84182条序列,使用NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、KOG、GO和Pfam数据库进行序列比对,共注释了59161条序列,筛选出30572个差异表达基因。与砧01号相比,桂角69号叶片中上调基因有15025个,下调基因有15547个。(2)GO分类结果显示共有20287个差异基因被注释。KEGG分析结果表明,有21600个差异基因被注释到133条KEGG通路上,其中挥发油合成相关的单萜生物合成通路、萜类骨架生物合成通路、苯丙素合成通路中的芳樟醇合酶、月桂烯合酶、香叶基香叶基焦磷酸合酶、肉桂酰辅酶A还原酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶、肉桂醇脱氢酶等关键酶基因呈差异表达。(3)转录因子分析发现差异表达基因分布于31个转录因子家族,其中MYB家族序列数量最多。该文利用转录组测序技术分析八角优良无性系与普通品种叶片的差异基因及其相关功能和代谢通路,获得的候选基因为深入探究挥发油特征组分的合成机制以及八角的分子育种提供了参考。
Abstract
In order to identify volatile oil synthesis related genes in Illicium verum, transcriptome sequencing and assembly annotation were carried out on the leaves of the superior clone Guijiao 69 and common variety Zhen 01, two varieties with significant difference in volatile oil content. Then GO and KEGG pathways analyses of differentially expressed genes (DEGs) were performed. The results were as follows: (1) A total of 84182 Unigenes were obtained after transcripts assembly, and 59161 Unigenes were annotated in NR, NT, Swissprot, KEGG, KOG, GO, and Pfam databases. A total of 30572 DEGs were obtained after filtering the low abundance genes, and 15025 up-regulated and 15547 down-regulated genes were identified in Guijiao 69 compared to the common variety Zhen 01. (2) GO classification results showed that 20287 DEGs were annotated. In addition, 21600 DEGs were involved in 133 KEGG pathways. Among them, genes encoding the key enzymes related to volatile oil synthesis such as linalool synthase, myrcene synthase, geranyl geranyl pyrophosphate synthase, cinnamoyl CoA reductase, caffeic acid 3-O-methyltransferase and cinnamyl alcohol dehydrogenase were differentially expressed and enriched in monoterpene biosynthesis pathway, terpene skeleton biosynthesis pathway and phenylpropanoid biosynthesis pathway. (3) Transcription factor analysis showed that the DEGs were distributed in 31 transcription factor families, of which MYB family had the most Unigenes. In this study, transcriptome sequencing was performed to analyze the DEGs superior clones and common varieties of I. verum as well as their related functions and pathways. The candidate genes obtained provide the references for further exploring the synthesis mechanism of characteristic components of volatile oil and molecular breeding of I. verum.
Keywords
Illicium verum ； leaf ； volatile oil synthesis ； estragole ； transcriptome analysis
