粉葛（Pueraria montana var. thomsonii）为豆科蝶形花亚科葛属藤本植物，茎基部木质且具有肥厚的块状根，在我国广泛分布（中国植物志，1995）。其主要活性成分包括异黄酮类化合物葛根素、大豆苷元、染料木素和异甘草素等，以及皂苷类物质皂角精醇、槐二醇和大豆苷醇等（楚纪明等，2015）。另外，粉葛中还富含维生素C、蛋白质、还原糖、淀粉和膳食纤维等营养成分（李桂花等，2021）。粉葛作为“药食同源”作物，因其淀粉含量高而常被加工成葛根粉、葛根薯片、葛根糕、葛根酒等系列商品，前人研究表明粉葛具有解热、抗病毒、降血糖血脂血压、保肝护肝、抗肿瘤、改善肾功能等作用（尚小红等，2021; 于钦辉等，2021）。

查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）是异黄酮代谢途径中的一个关键酶，其酶活对植物体内黄酮的积累起到重要作用，从而对植物的抗逆、花色等存在关联（李琳玲等，2008; 周发俊等，2008）。CHI是个超基因家族，现主要分为Type I、Type Ⅱ和Type Ⅲ三个类型，大部分植物的CHI基因属于Type I，Type Ⅱ一般只存在于豆科植物且该类型由Type I演化而来，Type Ⅲ主要为真菌和细菌中的类CHI蛋白家族（张党权等，2007; 梁瓴婕，2016）。目前，CHI基因已在多种植物中被成功分离并做了功能验证。梁瓴婕（2016）在体外成功分离到香雪兰的FhCHI1、FhCHI2、FhCHI3、FhCHI4、FhCHI5蛋白，并通过酶活检测得出FhCHI2和FhCHI5具有活性，能催化柚皮素查尔酮形成柚皮素，而FhCHI3、FhCHI4没有活性; 同时，在拟南芥中异源表达FhCHI1、FhCHI2、FhCHI5能恢复CHI突变体拟南芥的花色苷和黄酮醇代谢，并能使植株幼苗的生长点恢复为紫色、种皮颜色变回棕色; 而FhCHI3、FhCHI4则不能恢复突变体的表型及花色苷和黄酮醇代谢。郭晋雅（2011）将紫心甘薯IbCHI基因转化至拟南芥突变体中，发现紫心甘薯IbCHI基因能使突变体拟南芥（tt5）种皮颜色由浅黄色恢复到野生型的深棕褐色; 强光处理下突变体植株的叶片荧光参数Fv/Fm和Yield迅速降低，而转IbCHI的植株和野生型植株变化较慢，表明IbCHI能使突变体恢复至与野生型植株一样的抵抗强光的效果; 干旱处理后突变体植株萎蔫，而转IbCHI的植株和野生型植株的枯萎程度较低。何则铭（2011）的研究结果表明在NaCl（150 mmol·L^-1）处理下，过表达GmCHI4A和GmCHI4B的大豆发状根耐盐性高于对照，并且转基因株系中的GmSOD1和GmSOS1表达量以及发状根中的异黄酮含量显著高于对照。郭丹丹（2019）研究表明红花CtCHI1基因定位于细胞核中。李红艳（2019）研究发现丹参SmCHI基因不仅定位在烟草表皮细胞的高尔基体、质膜和细胞核上，而且在内质网、过氧化物酶体和质体上也检测到荧光。因此，CHI基因在细胞中的定位是多样化的，并且同为CHI基因在不同物种中的定位存在差异。

基于本研究的前期研究结果，即在野葛和粉葛中葛根素及总黄酮的含量存在显著差异，并根据前人在其他物种中发现查尔酮异构酶是黄酮代谢途径中的关键酶且在黄酮类化合物合成中起重要作用，同时依托Terai 等（1996）在野葛（Pueraria montana var. lobata）中成功克隆到一个长756 bp的CHI基因，该基因包含长675 bp的ORF框，编码225个氨基酸，蛋白大小23 803 Da。因此，本研究通过同源克隆的方法，用IPTG体外诱导和分离蛋白，同时通过拟南芥原生质体，拟探讨以下问题:（1）CHI基因在粉葛和野葛中是否存在差异;（2）CHI基因在野葛和粉葛中的表达量情况;（3）CHI基因在细胞中的定位。本研究结果将为野葛与粉葛中葛根素含量和总黄酮含量差异的探讨提供信息，同时为进一步解析PtCHI基因在粉葛中调控黄酮类化合物积累的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为广西大学农学院薯类课题组选育，经王爱勤教授鉴定为食用型粉葛（Pueraria montana var. thomsonii）‘桂葛1号’和药食兼用型野葛（P. montana var. lobata）‘桂葛8号’品种，2016年种植于广西大学农学院教学科研基地。

1.2 粉葛与野葛的葛根素和总黄酮的含量检测

称取葛根粉样品0.1 g置于盛有50 mL 30%乙醇的锥形瓶中，用保鲜膜封口并称重后于250 W下超声30 min，待室温冷却后再称重，用30%乙醇补足失去的重量，过滤后吸取5 mL滤液于25 mL容量瓶且用30%乙醇定容，即为20 μg·mL^-1的葛根素提取液。流动相为V（甲醇）∶V（0.1%醋酸水）=30∶70，流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为250 nm。

葛根总黄酮的提取和检测均参照李增富和吴荣锋（2008）的方法。

1.3 粉葛PtCHI基因的克隆和表达量检测

提取‘桂葛1号’的总RNA，并获得cDNA，用表1中引物 PtCHI-F、PtCHI-R进行PCR扩增，纯化后连接到pMD-19 T载体，转入DH5α 感受态细胞，挑选菌液扩增后将有特异条带的菌液送往生物公司测序，在DNAMAN软件中进行序列比对并完成克隆。用表1中引物 PtCHI-DLF、PtCHI-DLR对野葛和粉葛的CHI基因做表达量检测。

1.4 粉葛PtCHI基因的生物信息学分析

利用在线工具NCBI中的ORF Finder找到基因的开放阅读框; 利用在线工具ProtParam预测蛋白的理化性质; 利用在线工具SOPMA、SWISS-MODEL及WoLF PSORT分别进行蛋白二级、三级结构预测和亚细胞定位的预测; 经NetPhos 3.1 Server在线预测磷酸化位点; 利用STRING软件，以大豆蛋白数据库分析蛋白之间的互作关系; 利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.5 原核表达及Western blot检测

用表1中的引物PtCHI-YHF、PtCHI-YHR将克隆完成的目的基因的ORF框纯化后与线性化载体pet-28a相连得到重组子pet28a-PtCHI。用IPTG诱导后，经SDS-PAGE电泳分析后为可溶性表达的蛋白，根据亲和层析原理，使用Protein Ni-NTA Resin进行镍柱纯化。对纯化后的蛋白进行Western blot检测，使用的一抗为抗His标签鼠单克隆抗体，二抗为山羊抗小鼠IgG（H+L）。

1.6 亚细胞定位

用表1中的引物PtCHI-YXBF、PtCHI-YXBR将克隆完成的目的基因的ORF框纯化后与线性化载体pSAT6-EYFP-N1相连得到pSAT6-EYFP-N1-PtCHI重组质粒。选取苗龄在25 d的拟南芥幼嫩叶片，通过酶（25% Cellulase R10和0.3% Mecerozyme R10）消化已切成细条的拟南芥叶片3~4 h，经尼龙膜过滤后用洗涤液洗涤获取拟南芥原生质体; 通过与原生质体和质粒总体积相等的20% PEG4000进行转化，转化结束后转移至96孔板中培养，待其培养结束即可制片，在共聚焦显微镜下采集图像。

2 结果与分析

2.1 粉葛和野葛的葛根素和总黄酮的含量测定

由图1可知，野葛‘桂葛8号’中的葛根素含量显著高于粉葛品种（‘桂葛1号’）且是粉葛品种的3.5倍左右，野葛‘桂葛8号’的总黄酮含量也高于粉葛品种但差异不显著。

2.2 粉葛PtCHI基因的克隆与表达量分析

根据已报道的野葛CHI基因序列设计引物，以粉葛品种‘桂葛1号’的叶片cDNA为模板，克隆到PtCHI基因片段（图2）。该cDNA核苷酸序列长742 bp，具有一个长672 bp的完整开放阅读框，启动子ATG位于55 bp，终止子TGA位于726 bp，推导编码223个氨基酸（图3）。经NCBI网站blast比对，所克隆的片段与野葛的CHI基因编码的蛋白具有99%的同源性。CHI基因表达量结果显示，CHI基因在野葛品种‘桂葛8号’中的表达量为根＞茎＞叶，而在粉葛品种‘桂葛1号’中的则为茎＞根＞叶; 除叶片外，野葛品种‘桂葛8号’中CHI基因的表达量均显著高于粉葛品种（图4）。

2.3 粉葛PtCHI蛋白生物信息学分析

2.3.1 PtCHI蛋白理化性质及亚细胞定位预测

理化性质预测结果表明，PtCHI蛋白由224个氨基酸组成，相对分子质量为27.8 kD，理论等电点（pI）为5.34，不稳定指数为32.25，属于稳定蛋白，脂肪族指数为95.40。PtCHI 蛋白中带负电荷残基占氨基酸总数的12.05%，而带正电荷残基为9.82%，推测该蛋白带负电。亚细胞定位预测结果显示，定位在细胞质的可能性达64.28%，其次是叶绿体为14.28%，而定位于细胞核、线粒体和高尔基体的几率为7.14%。

2.3.2 PtCHI二、三级结构预测

通过SOPMA在线工具对PtCHI 蛋白二级结构进行预测分析，结果显示该蛋白二级结构的形式及所占比例分别是α-螺旋最高（48.66%）; 其次是无规则卷曲和延伸链这两种二级结构（分别为24.11%、17.41%），而β-转角占比最低（9.82%）（图5）。通过SWISS-MODEL在线工具预测PtCHI蛋白三级结构发现，该蛋白的结构也包括α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲，其中以α-螺旋居多，这与二级结构预测结果相符（图6）。

2.3.3 PtCHI磷酸化位点预测

通过NetPhos 3.1 Server在线预测PtCHI磷酸化位点，结果显示该蛋白主要存在25个磷酸化位点，其中发生磷酸化可能性最大的是位于106位和167位的丝氨酸，得分分别是0.969和0.964; 其次是位于29位和203位的丝氨酸，得分分别为0.901和0.902; 接着是第26位的丝氨酸、44位的苏氨酸、101位的丝氨酸和112位的丝氨酸，得分分别为0.894、0.863、0.844、0.827（图7）。

2.3.4 PtCHI的遗传进化树分析

通过MEGA 7.0软件构建PtCHI的氨基酸系统发育进化树，结果表明11个物种被分为两大类，其中粉葛品种‘桂葛1号’和野葛品种‘桂葛8号’、大豆（Glycine max）、乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis）、刺毛黧豆（Mucuna pruriens）和密花豆（Spatholobussuberectus）为一组，而菜豆（Phaseolus vulgaris）、绿豆（Vigna radiata）和豇豆（V. unguiculata）为一组，鸡母珠（Abrusprecatorius）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）为一组。这说明粉葛品种‘桂葛1号’与野葛品种‘桂葛8号’、大豆和乌拉尔甘草的亲缘关系较近（图8）。

2.3.5 PtCHI蛋白互作关系预测

利用STRING在线工具并以大豆蛋白库分析大豆CHI的互作关系，预测结果显示，CHI蛋白与黄烷酮3-羟化酶F3H2、F3H（属于铁/抗坏血酸依赖的氧化还原酶家族，与植物类黄酮化合物花青素和原花青素的积累相关）的互作分数较高，均为0.994; 其次是CHI蛋白与对-香豆酰CoA连接酶4CL4（属于ATP依赖的AMP结合酶家族，与植物木质素合成密切相关）的互作分数为0.980。此外，CHI蛋白与二氢黄酮醇还原酶DFR2（与花色苷积累相关）互作，互作分数为0.974; 还与SF3’H1（属于细胞色素P450家族，与花青素积累相关）及查尔酮合成酶chs8（属于查尔酮/二苯乙烯合成酶家族，与植物查尔酮类化合物积累、花色素形成及植物防御相关）发生互作，互作分数分别为0.956、0.952（图9）。

2.4 原核表达分析

2.4.1 原核表达载体构建

由图10:A可知，在表1特异引物下，经PCR扩增后，分别获得约669 bp的产物，与目的基因大小相符。将扩增产物与线性化的pet28a载体进行重组反应，并转化至DH5α。提取质粒，分别用限制性内切酶XhoⅠ、SpeⅠ酶切，结果如图10:B所示，分别在大小约5 300 bp和669 bp处各有一明亮条带。将测序正确的质粒转化至BL21感受态细胞，经PCR再次验证，证明目的基因已成功连接至载体（图10:C）。这说明获得了含pet28a-PtCHI重组质粒的原核表达菌株。

2.4.2 重组蛋白诱导表达

将含有pet28a-PtCHI重组质粒的菌株，在0.5 mmol·L^-1 IPTG条件下置于16℃和30℃环境中培养，在30 kD处有特异蛋白条带出现，与目的蛋白大小相符，而无IPTG诱导时无此特异性蛋白条带，表明pet28a-PtCHI蛋白在BL21表达菌株中被成功诱导表达。其中，SDS-PAGE检测结果表明，高温诱导下上清液中存在较少的可溶性蛋白，表明低温能够促进该蛋白的可溶性表达（图11）。

2.4.3 重组蛋白的纯化及浓度测定

由于镍离子能够与蛋白组氨酸中的咪唑环结合，因此利用镍离子金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）能够吸附含组氨酸的蛋白质。通过增加流动相咪唑的浓度，可将蛋白进行替换洗脱，从而达到分离纯化蛋白的目的。由图12可知，采用镍亲和层析法能够对PtCHI重组蛋白进行有效的分离纯化。当咪唑浓度（20~100 mmol·L^-1）较低时，杂蛋白被去除，浓度在120 mmol·L^-1以上时目的蛋白被替换洗脱。当咪唑浓度提高至160 mmol·L^-1时，蛋白条带较为单一，表明此时蛋白纯度较高。将纯度高的蛋白进行buffer置换，测得其PtCHI蛋白浓度为6.39 μg·μL^-1。

2.4.4 纯化蛋白的Western blot验证

由于pet28a载体质粒上带有组氨酸标签，因此可以用His抗体对纯化蛋白进行Western blot验证。由图13可知，经曝光后，PtCHI在PVDF膜上约27.8 kD处有目的蛋白条带出现。对不同蛋白上样量均检测到特异的蛋白条带，进一步证实分离纯化的蛋白为PtCHI蛋白。

2.5 亚细胞定位

2.5.1 亚细胞定位表达载体构建

利用表1中的特异引物PtCHI-YXBF/R进行PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，分别在669 bp处有单一条带，与目的基因大小相一致（图14:A）。经纯化后与线性化载体pSAT6-EYFP-N1连接，并转化至DH5α感受态细胞。提取质粒经限制性内切酶Xho I和Xma I酶切验证，结果显示分别在约4 600 bp和669 bp处各有一条带，大小与线性化载体及目的基因大小相一致（图14:B）。将其送测，并把测序结果与目的基因序列一致的菌液进行扩大培养，提取其质粒用于拟南芥瞬时表达。

2.5.2 亚细胞定位分析

通过PEG-CaCl₂法介导pSAT6-EYFP-N1-PtCHI重组质粒转化拟南芥原生质体，转化16 h，通过激光共聚焦显微镜观察，PtCHI的亚细胞定位结果显示，在叶绿体周围检测到由EYFP通路发出的绿色荧光（图15:A）及叶绿体自发的红色荧光（图15:B），这表明PtCHI基因定位于叶绿体。

3 讨论

3.1 粉葛和野葛的CHI基因表达与异黄酮类物质积累关系

异黄酮类物质作为葛根的主要活性成分，其含量高低是葛根药用价值的评判标准之一。前人的研究发现，粉葛和野葛的总黄酮含量差异悬殊，并且野葛的异黄酮类物质的含量显著高于粉葛。王新胜等（2009）对伏牛山区的野葛和粉葛的药材质量测评结果表明，野葛的水浸出物和醇浸出物含量均高于粉葛，总黄酮含量是粉葛的3倍，并且野葛中葛根素的平均含量是粉葛的2.5倍。蒙秋艳等（2020）对广西不同地区的野葛和粉葛总异黄酮含量研究结果表明，100 g野葛粉末中总异黄酮含量[约为5.08 g·（100 g）^-1]显著高于粉葛中的总异黄酮含量[0.463 g·（100 g）^-1]，并且野葛中的葛根素含量和大豆苷含量也高于粉葛。张静等（2017）研究发现，广西野葛的纤维素、可溶性糖、总黄酮和葛根素的含量显著高于粉葛。

查尔酮异构酶作为黄酮生物合成途径中第二大限速酶，在异黄酮类物质积累、色素合成、抗逆等方面具有重要作用（李琳玲等，2008; 周发俊等，2008）。Zhang 等（2009）研究表明，在乌拉尔甘草中过表达其CHI基因，对其毛状根中总黄酮含量进行检测后发现，转基因乌拉尔甘草的毛状根中总黄酮含量[1.394 g·（100 g）^-1]显著高于野生型毛状根中的含量[0.842 g·（100 g）^-1]; 同时，发现在2% PEG8000和0.1%酵母提取物共处理下能显著提高转基因乌拉尔甘草毛状根中的总黄酮含量[2.838 g·（100 g）^-1]和机体内CHI基因的转录水平（Zhang et al.，2009）。Vu等（2018）对改善土人参[Talinum paniculatum（Jacq.）Gaertn.]总黄酮含量低的研究结果发现，在土人参中过量表达大豆的GmCHI基因，会使得转基因土人参中总黄酮含量（2.74 mg·g^–1和4.24 mg·g^–1）比非转基因株系显著提高4.8~7.4倍。本研究发现，野葛中的葛根素含量和总黄酮含量均高于粉葛，与前人的研究结果相一致。同时还发现，CHI基因的表达量在野葛的根和茎中均显著高于粉葛，前人在乌拉尔甘草和土人参的研究中也发现，过表达CHI基因均能提高植株体内的总黄酮含量。由此推测，葛根中的CHI基因与总黄酮及葛根素的积累存在密切联系。这对后续粉葛品质改良以提高其药效成分具有重要的参考价值。

3.2 野葛和粉葛的CHI基因结构差异与异黄酮类物质积累关系

同一基因常会因结构存在差异而使其行使的功能或受到胁迫的表现有所不同（刘玉成等，2019）。娄文月等（2021）在甘蔗研究中发现，ScJAZ基因家族中ScJAZ22、ScJAZ24和ScJAZ30基因结构、氨基酸数量和相对分子质量差异较大，这3个基因在叶枯萎病侵染抗叶枯萎病品种ROC22的早期呈现不同的表达量，其中ScJAZ22基因的表达量下调，而 ScJAZ24和ScJAZ30的表达量却上调。Dong等（2021）在白梨中鉴定出197个bHLH基因，其基因结构和编码的氨基酸数量以及外显子数量都存在差异，在冷处理和热处理下，PbrbHLH7、PbrbHLH8、PbrbHLH128、PbrbHLH160、PbrbHLH161和 PbrbHLH195的表达量均上调，而其他成员的表达量则无显著变化。这说明同一家族的基因，当其基因结构相互之间存在差异时，每个基因所表现出来的功能都会有所不同。

本研究结果表明，所克隆的粉葛PtCHI基因ORF框长672 bp，推导编码223个氨基酸，与Yoshiya等（1996）在野葛中克隆的PmCHI的ORF框675 bp相差3 bp，编码的氨基酸也相差1个。粉葛和野葛中的CHI基因ORF框长度和所编码的氨基酸数量存在差异，并且该基因在野葛和粉葛中的表达量差异显著，这与前人在甘蔗和白梨中的研究结果相似。两者的功能是否会存在差异，以及是不是引起野葛和粉葛的黄酮含量差异的原因还有待进一步挖掘。

3.3 粉葛PtCHI基因亚细胞定位、互作关系与异黄酮类物质积累关系

本研究获得的粉葛PtCHI的氨基酸序列与野葛、大豆、乌拉尔甘草的CHI亲缘关系较近。CHS和CHI发生互作在水稻、拟南芥、江南卷柏和小立碗藓等植物中已有报道（Ban et al.，2018）。Fujino等（2018）研究发现金鱼草AmCHS和AmCHI定位于内质网和细胞核且CHI能与CHS、FNSⅡ、F3H及DFR发生蛋白互作，使β-半乳糖苷酶活性显著提高。Ban等（2018）研究表明，啤酒花CHIL2和CHS_H1均定位于细胞质中且能发生互作，在酵母中CHS_H1/CHIL2共表达提高了代谢产物黄腐酚含量和槲皮素查尔酮含量，比单独表达时提高1.4倍和1.5倍。Waki等（2016）研究发现大豆GmIFS与 GmCHS1、GmCHS7、GmCHI1A、 GmCHI1B2和GmCHI2发生互作，其中GmIFS与 GmCHI的互作强于GmCHS; 在同等条件下，GmIFS与GmCHI共表达时的β-半乳糖苷酶的活性也高于GmCHS。Dastmalchi等（2016）研究发现大豆GmIFS1/GmIFS2与GmCHR14、GmCHI2、 GmCHS7、GmCHS8均在细胞质中发生互作，其中GmIFS2 和 GmCHR14互作时发出的荧光最强，与GmCHS7/GmCHS8的互作最弱。本研究结果表明，葛根PtCHI仅定位于细胞质的叶绿体上，与前人研究结果不一致，可能是因研究物种不同而导致定位结果存在差异，本研究预测粉葛CHI与CHS、F3H和DFR2互作，预测结果与前人在其他作物上的研究结果大体一致，这些互作蛋白都与花青素、花色素、木质素积累密切相关，但未检测到PtCHI蛋白与PtIFS存在互作关系。基因之间是否存在CHI底物的竞争，从而导致PtIFS与CHI互作极低，进而导致粉葛异黄酮生物合成低还有待下一步深入研究。

参考文献