毛唇芋兰（Nerviliafordii）为兰科（Orchidaceae）狭域分布植物，又名青天葵、独脚莲、珍珠叶等，主要分布于我国广西、广东、福建等地（梁永枢等，2017）。其干燥叶或全株具有清热、润肺止咳、解毒散瘀等功效，其中对小儿咳嗽的治疗效果尤其明显，同时也是备受港台地区民众喜欢的一种高级菜，因而广受关注（梅全喜，2008; 邱莉等，2011; Huang et al.，2012）。然而，由于栖息地受到果农开垦的严重破坏，加之种子自然条件下萌发率低，致使毛唇芋兰野生资源濒临枯竭，因此极大地限制了野生毛唇芋兰种群的扩展和生存。有研究表明，适宜的菌根真菌对兰科植物种子萌发和种苗生长发育产生重要的影响（Rasmussen &Rasmussen，2009; Fay，2016; 陈艳红等，2017）。兰科植物根际土壤中的真菌可以通过根系进入兰科植物根细胞中定殖，进而与宿主植物形成共生关系（McCormick et al.，2016; Waud et al.，2016）。然而，目前对于根际土壤真菌的组成与兰科植物毛唇芋兰根内菌根真菌的相关性仍然不明确。因此，研究毛唇芋兰根中和根际土壤中真菌的组成和相关性，对于筛选和利用有效菌根真菌实现毛唇芋兰野生种群恢复和资源可持续利用具有重要意义。

McCormick等（2016）研究表明，地生型兰科植物种子萌发的栖息地更容易发现特异性共生真菌，其丰度与成年兰科植物的距离呈一定的正相关; 有的兰科植物根内真菌在土壤中普遍存在，这种特异性真菌更有助于兰科植物的生长（Waud et al.，2012）。兰科植物根内真菌群落和根际土壤中的真菌群落差异显著，并且这两种真菌群落在一定程度上是相互独立的，菌根真菌的种类和丰度与根际土壤中菌根真菌的种类与丰度无明显联系（蒋玉玲等，2019）。除了担子菌类菌根真菌以外，镰刀菌属（Fusarium）真菌还是地生兰根中和根际土壤中的特异性优势菌群（王晓国等，2021）。基于上述兰科植物菌根的研究现状，本文首次以我国广西喀斯特地区龙州和大新两个点为研究区域，以分布于该地区的野生毛唇芋兰为研究对象，采用Illumina MiSeq高通量测序技术方法，通过分析该区域内两个样地毛唇芋兰根系共生真菌和根际土壤真菌的组成及差异，拟探讨以下问题:（1）喀斯特地区毛唇芋兰根部内生真菌及其根际土壤真菌在分子水平上区系组成以及优势内生真菌类群;（2）两地毛唇芋兰根系共生真菌组成存在差异及其形成原因。本研究结果对于今后系统研究广西喀斯特地区毛唇芋兰菌根真菌资源，以及采用菌根技术实现毛唇芋兰种子伴菌萌发及地生型兰科药用植物的资源保护具有重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料和处理

毛唇芋兰植株与土壤样本于2020年10月7日从广西壮族自治区崇左市龙州县（106°67′ E、22°52′ N，海拔333 m）和大新县（107°05′ E、22°81′ N，海拔311 m）采集。选取毛唇芋兰健康植株，整株挖出并带根际土放入自封袋中，12 h内将样品带回广西中医药大学仙葫校区的实验室，随即在流水下冲洗干净根表杂质，使用滤纸吸干根表水分后，迅速采用液氮急冻，之后置于-80℃冰箱中保存，备用。

根际土壤采自毛唇芋兰根系表面0~1 cm范围内的土层，将采集的土壤置于无菌离心管中，编号分别为DXTR（大新土壤）和LZTR（龙州土壤）; 分别取大新毛唇芋兰和龙州毛唇芋兰的主根、走茎（各3个重复）置于无菌离心管中，编号为DXZG（-1，-2，-3）、DXZJ（-1，-2，-3）、LZZG（-1，-2，-3）、LZZJ（-1，-2，-3）。

1.2 样品基因组DNA的提取和分析

样品经冷链送至广州基迪奥生物科技有限公司，进行DNA的提取和ITS rDNA的测序分析; 采用带有barcode的特异引物扩增ITS的ITS1 plant区（引物序列分别为ITS1 F KYO2:5′-TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAA-3′和ITS86R:5′-TTCAAAGATTCGATGATTCAC-3′）; 将纯化后的PCR产物（即扩增子）连接测序接头，构建测序文库，上机进行Illumina MiSeq高通量测序，并进行相应的信息分析。

1.3 数据处理和分析

过滤低质量Reads，将双端Reads拼接为Tag，对Tag进行低质量过滤，得到的数据称为Clean Tag; 使用Usearch软件进行聚类（Schloss et al.，2009），去除聚类过程中检测到的嵌合体Tag，按照97%相似性进行可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析，获得OTU后，基于Effective Tag进行OTU丰度统计。利用R语言vegan包进行维恩图分析（Oktalira et al.，2019）和使用Qiime软件（Schloss et al.，2009）进行alpha多样性指数，包括物种数（Sobs）、香农指数（Shannon指数）、辛普森指数（Simpson指数）、丰富度指数（Chao 1指数）、基于丰度的覆盖估计值（Ace指数）、谱系多样性指数（Pd指数）及覆盖率（Good’s coverage）分析; 同时，采用统计学方法进行差异特征发现和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 测序结果分析

通过对大新县和龙州县的野生毛唇芋兰主根和走茎及根际土壤共14个样品的真菌 rDNA基因ITS1区域进行高通量测序。测序结果表明，质控后每个样品的测序标签数均超过110 000条（表1）; 以测序数据量对应OTU数量构建的稀释曲线趋向平坦（图1），说明测序数据量能够覆盖样品中绝大多数真菌种类，测序数据量合理。每个样品的覆盖率均达到0.999（表1），说明样本中有序列没有被测出的概率极低，测序深度合格。

Chao 1指数和Ace指数用于评定样品中群落的丰富度; 香农指数则可反映出群落分布多样性，其受到样品群落中物种丰富度以及物种均匀度的影响（庞美霞等，2021）。大新主根（DXZG）Chao 1指数、Ace指数和香农指数分别为302.67±7.23、316.04±3.41、1.10±0.23（图2 :A），龙州主根（LZZG）Chao 1指数、Ace指数和香农指数分别为212.72±143.99、215.14±145.47、2.23±0.15。龙州主根群体中反应群落多样性变化的香农指数（P=0.003 5）显著性上升（图2:A），而表征物种丰度的Chao 1指数（P＞0.05）和Ace指数（P＞0.05）相较于大新主根群体均有所下降但无明显差异。大新走茎（DXZJ）Chao 1指数、Ace指数和香农指数分别为205.41±113.57、210.70±118.47、0.72±0.25（图2:B），龙州走茎（LZZJ）Chao 1指数、Ace指数和香农指数分别为209.37±47.62、212.68±73.34、0.69±0.11（图2:B）。由此可见，龙州走茎的真菌物种丰度及多样性低于大新走茎组，但差异不显著（P＞0.05）。

2.2 根系共生真菌多样性及相关性分析

从毛唇芋兰2个根际土壤（DXTR、LZTR）样品、6个走茎（DXZJ、LZZJ）样品和6个主根（DXZG、LZZG）样品内检测到大量OTU。首先，不同土壤样品分析结果表明，DXTR共获得411个OTU，多于LZTR中的OTU数量406; DXTR的真菌香农指数、辛普森指数、Chao 1指数以及Pd指数均略高于LZTR（表1），说明大新毛唇芋兰根际土壤真菌群落在丰富度和多样性上均高于龙州毛唇芋兰。另外，OTUs-Venn图能够直观反映样本间相同及其独特的OTU。DXTR与LZTR真菌OTUs-Venn图如图3所示，2个土壤样本中共获得705个OTU，它们之间共有的OTU为112 个，DXTR特有OTU为299个，LZTR特有OTU为294个。因此，综合Alpha多样性指数及OTUs-Venn图发现，大新和龙州的毛唇芋兰根际土壤真菌的组成均较为丰富，但它们在真菌的组成、结构和相对丰度上存在一定的差异。

DXZJ与DXZG、LZZJ与LZZG真菌OTUs-Venn图（图4）显示，龙州毛唇芋兰根系样品共获得221个OTU，其中走茎和主根共有126个OTU，主根特有OTU为59个，走茎特有OTU为36个; 大新毛唇芋兰根系样品共获得289个OTU，其中走茎和主根共有OTU为113个，主根特有OTU为109个，走茎特有OTU为67个。综合Alpha多样性指数结果（表1）发现，大新毛唇芋兰与龙州毛唇芋兰在青天葵根系共生真菌组成中均较为丰富，但在主根组的真菌部位组成、结构及相对丰度上均比走茎组更高。

2.3 根系及其根际土壤真菌群落结构组成

从毛唇芋兰的根系及其根际土壤中获得有效序列118 040条，可操作分类单元207个，分属于8门19纲42目86科123属。以丰度均值排名Top10的物种作为主要分析对象，其他已知物种归为others，未知物种标记为unclassified; 基于门、纲、目、科、属、种分类水平，分析不同样品组中真菌群落结构的变化。由图2可知，在不同的分类水平上，广西喀斯特地区两个不同产地之间供试样品中真菌群落结构存在差异。

从门一级分类水平上分析，毛唇芋兰根系与其根际土壤14个样本中共检测到的真菌涉及8个门（图5:A），分别为担子菌门（Basidiomycota）、子囊菌门（Ascomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、梳霉门（Kickxellomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）、壶菌门（Chytridiomycota）、虫囊霉门（Entomophthoromycota），未鉴定出来的序列（unclassified）占比为18.24%。毛唇芋兰根系内生真菌主要分布于担子菌门（占76%），在DXZG、LZZG、DXZJ、LZZJ中占比分别为66.89%、78.68%、97.03%、96.39%; 其次分布于子囊菌门（占10%），占比分别为1.90%、14.58%、0.74%和2.52%。子囊菌门在DXZJ与DXZG、LZZJ间的物种丰度均值均存在显著差异（P=0.02，0.02）; LZZG与DXZG物种丰度均值存在显著差异的真菌门为被孢霉门（P=0.01）; LZZJ与LZZG物种丰度均值存在显著差异的真菌门为担子菌门（P=0.02）。大新和龙州的根际土壤中优势菌门组成与含量存在显著差异，前者的优势菌门为子囊菌门（59.34%），后者的优势菌门为担子菌门（36.63%）。

从纲一级分类水平上分析，毛唇芋兰根系及其根际土壤中优势真菌群落主要包括伞菌纲（Agaricomycetes）（总占比58%）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）（总占比5%）、银耳纲（Tremellomycetes）（总占比3%）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）（总占比1%）、古菌根菌纲（Archaeorhizomycetes）、马拉色菌纲（Malasseziomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、球囊菌纲（Glomeromycetes）、酵母纲（Saccharomycetes）（图5:B）。unclassified序列占比为34.90%，others序列占比为0.35%。伞菌纲、粪壳菌纲、银耳纲、散囊菌纲和古菌根菌纲在DXTR中的占比分别为6.74%、29.85%、0.07%、6.57%和12.79%，在DXZG中的占比分别为38.85%、1.11 %、1.38%、0.25%和0.18%，在DXZJ中的占比分别为60.43%、0.25%、1.04%、0.14%和0.05%; 在LZTR中的占比分别为28.52%、6.12%、0.67%、0.59%和0.002%，在LZZG中的占比分别为66.24%、9.66%、9.66%、1.77%和0.001%，在LZZJ中的占比分别为93.20%、0.51%、0.32%、0.87%和0.0003%。各真菌纲在不同产地毛唇芋兰根际土壤中所占比例存在显著差异（P＜0.05）。在根系样品之间真菌组成及比例存在差异，其中LZZJ与LZZG物种丰度均值均存在显著差异的真菌纲为伞菌纲（P=0.03），DXZG与LZZG物种丰度均值均存在显著差异的真菌纲为古菌根菌纲（P=0.01）和马拉色菌纲（P=0.01）。

从目一级分类水平上分析（图5:C），主要包括鸡油菌目（Cantharellales）（占比57%）、银耳目（Tremellales）（占比3%）、肉座菌目（Hypocreales）（占比2%）、散囊菌目（Eurotiales）（占比1%）、古菌根菌目（Archaeorhizomycetales）、马拉色菌目（Malasseziales）、小丛壳目（Glomerellales）、粪壳菌目（Sordariales）、伞菌目（Agaricales）、煤炱目（Capnodiales）。

从科一级分类水平上分析（图5:D），胶膜菌科（Tulasnellaceae）占担子菌的75%，此外，还有少数属于Trimorphomycetaceae、角担菌科（Ceratobasi-diaceae）、马拉色菌科（Malasseziaceae）、小皮伞科（Marasmiaceae）等; 子囊菌主要包含丛赤壳科（Nectriaceae）、古菌根菌科（Archaeorhizomycetaceae）、曲霉科（Aspergillaceae）、毛壳科（Chaetomiaceae）、小丛壳科（Glomerellaceae）等。

从属一级分类水平上分析（图5:E），主要包括瘤菌根菌属（Epulorhiza）、原隐球菌属（Saitozyma）、镰刀菌属（Fusarium）、古菌根菌属（Archaeorhizomyces）、马拉色菌属（Malassezia）、曲霉属（Aspergillus）、翼孢菌属（Tetrapyrgos）、腐质霉属（Humicola）、刺盘孢属（Colletotrichum）、青霉属（Penicillium）。根际土中显著优势真菌菌种为镰刀属（Fusarium）。毛唇芋兰根茎的优势菌群均为瘤菌根菌属（Epulorhiza）真菌，在所分离真菌中占比高达56%，并且在根际土壤中该属真菌含量也很高，在大新土壤和龙州土壤中的占比分别为4%和14%。

从种一级分类水平上分析（图5:F），主要包含贝壳状革菌（Panusconchatus）、稻黑孢菌（Nigrosporaoryzae）、季也蒙毕赤酵母（Meyerozymaguilliermondii）、大孢圆孢霉（Staphylotrichumcoccosporum）、Septoria cretae、马氏梭菌（Sodiomycesmagadii）、Humicola olivacea、Tetrapyrgossubcinerea、Malassezia restricta、荚膜梭菌（Saitozymapodzolica）等。

总之，不同分类层级的真菌群落在两地根际土壤中，它们在真菌的组成、结构及相对丰度上存在一定的差异，并且两地不同根系之间也存在一定差异，主根在真菌的组成、结构及相对丰度上均比走茎更高。

3 讨论与结论

本研究基于高通量测序技术，比较分析了广西喀斯特地区的地生型兰科植物毛唇芋兰根系及其根际土壤中真菌菌落结构，结果发现瘤菌根菌属（有性型为胶膜菌属）真菌是大新与龙州两个样地的毛唇芋兰根中绝对优势菌群。Jacquemyn等（2011）研究认为，地生兰的种子成熟后落入土壤中经历长时间的发育，在此期间依赖共生真菌提供稳定、持久的C源。因此，各地的地生兰往往与菌根真菌形成高特异性的菌根关系，表现为大多数地生兰均与胶膜菌属菌群共生，如竹叶兰属（Arundina）植物（Meng et al.，2019）、杓兰属（Cypripedium）植物（Yuan et al.，2010）等地生兰的优势共生菌群主要是胶膜菌属菌群。更为重要的是，胶膜菌不仅是兰科植物菌根真菌区系组成中的绝对优势类群，还是一类重要的兰科植物共生萌发真菌（Rafter et al.，2016; 陈娟等，2017）。因此，瘤菌根菌属菌群可能在毛唇芋兰种子萌发和球茎生长发育过程中起到至关重要的作用，但更多证据还有待真菌共生萌发实验进一步确证。此外，瘤菌根菌属真菌在两地主根中的丰度均比走茎高，这可能与主根生长周期长、走茎生长周期短且侧重于生殖生长的特点有关。

真菌群落的组成和丰度对植物生态系统的功能调节具有重要作用，其中核心真菌组和关键物种的贡献一直是真菌生态学领域的研究热点（熊丹等，2020）。本研究基于FUNGuild数据库，对大新和龙州两地的毛唇芋兰根系和根际土壤中真菌的主要OTU进行了功能预测分析，结果发现共生型（Symbiotroph）是两地毛唇芋兰主根和走茎中真菌群落最主要的营养类型，相对丰度分别为63%和92%（龙州）、36%和60%（大新），其他营养类型如病理寄生-腐生-共生（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）、病理寄生（Pathotroph）和病理寄生-共生（Pathotroph-Symbiotroph）的真菌群落则比较少，相对丰度均少于2%; 两地的根际土壤真菌群落的营养类型基本类似，其中大新病理寄生-腐生-共生的相对丰度占17%、腐生和共生约占4%，龙州共生和病理寄生-腐生-共生的相对丰度分别占14.43%和13.31%。从功能类型上分析，两地毛唇芋兰均主要由外生菌根（ectomycorrhizal）功能群构成，并且以瘤菌根菌属真菌群为核心真菌组; 其他功能群包括未定义腐生菌群（undefined saprotroph）、动物病原菌（animal pathogen）、丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza）、内生菌根-植物病原菌-未定义腐生菌群（Endomycorrhizal-Plant Pathogen-Undefined Saprotroph）等，它们的相对丰度均比较低，这反映了毛唇芋兰根内和根际真菌的多样性。

本研究结果发现，两地毛唇芋兰根际土壤中的OTU总数均比根中的高，同时两地根际土壤和根中也存在共同的OTU。这表明兰科植物根际土壤中的真菌类群要多于根中，并且两地兰科植物根际土壤和根中存在相同的真菌群落。蒋玉玲等（2019）在研究绶草等9种兰科植物过程中也发现类似的结果，认为兰科植物根际真菌的组成要比根中真菌的组成更复杂。大新和龙州两地毛唇芋兰根际土壤的优势菌门组成与含量存在显著差异，前者的优势菌门为子囊菌门，后者为担子菌门。在两地毛唇芋兰根中，子囊菌的物种丰度存在显著差异，被孢霉门真菌在LZZG与DXZG之间的物种丰度存在显著差异，这些结果表明毛唇芋兰根系真菌与根际土壤真菌的组成均很丰富，但它们在不同部位及不同区域之间的真菌组成、结构及相对丰度上存在一定的差异。这种差异与外界环境因子，如海拔高度（徐玲玲等，2019）、土壤湿度、酸碱度及营养条件（Ogura-Tsujita &Yukawa，2008; Bunch et al.，2013; Jacquemyn et al.，2015）和季风气候（马雪亭等，2016）及植被类型（Lin et al.，2020）等对兰科植物真菌群落组成的影响有关。

总之，高通量测序等现代分子生物学技术为高效、全面分析兰科植物毛唇芋兰根系共生真菌组成提供了有效手段，也为进一步有针对性地分离培养可培养的菌根真菌，用于研究兰科种子共生萌发和菌根共生作用机制等提供了科学参考，这对采用菌根技术解决毛唇芋兰濒危植物资源保护和可持续利用具有非常重要的实践意义。然而，本研究虽然从毛唇芋兰根系和根际土壤中获得大量的序列，但由于NCBI数据库比对数据的不足，因此无法全部将这些生物信息解读出来，这对本研究的全面分析产生了一定的干扰，这部分工作还有待进一步完善。

参考文献