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钙是植物生长必不可少的营养元素，可以促进植物的生长发育、光合作用、抗逆性等，但过量的钙会产生细胞毒害，其对植物而言具有两面性（Min et al.，2009）。钙在植物体中主要以硝酸钙和氯化钙、水溶性有机酸钙、果胶酸钙、磷酸钙和碳酸钙、草酸钙、硅酸钙等化学形态存在（叶盛等，2000）。在高钙环境中，一些优势植物通常会进化出自身的钙适应机制，以此避免产生钙毒害。例如，植物可以通过泌钙腺体将体内多余的钙分泌出去（李强等，2007; Borer et al.，2012）; 或者形成钙化根，从源头上控制根系对钙的吸收（高有红等，2017）。此外，还可以通过调节自身某些生理活性物质的变化来适应高钙环境（张宇斌等，2008）。喀斯特地区又称岩溶地区，是典型的高钙环境，钙在喀斯特生态系统中扮演着重要角色（Huang et al.，2021）。长期以来，这里的大部分植物形成了喜钙、岩生、旱生等特性（罗绪强等，2012）。因此，喀斯特生境成为研究植物对高钙环境适应性方面的热点区域（谢丽萍等，2007; 曹建华等，2011; 齐清文等，2013）。
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金花茶组（Camellia Sect. Chrysantha）系山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia L.）常绿灌木或小乔木。由于金花茶种质资源稀缺以及极高的观赏价值，因此被誉为“植物界大熊猫”和“茶族王后”（韦霄等，2006）。同时，金花茶在抗肿瘤、抗氧化、防治三高、抗炎及抗过敏等方面具有较高的药用价值（孔桂菊等，2016）。在2021年8月发布的《国家重点保护野生植物名录》中，金花茶组所有种均被列入国家二级保护野生植物。目前，已报道且被认可的中国金花茶组植物种类超过20种，主要分布于广西西南部，其大部分物种的生境土壤为喀斯特石灰土，少数为酸性土（中国科学院中国植物志编辑委员会，1998）。在自然环境中，尚未发现可同时在石灰土和酸性土生境中生长的金花茶物种（苏宗明和莫新礼，1988）。因此，根据生境土壤的种类，可分为石灰土金花茶和酸性土金花茶。但是，人工引种试验表明，多数石灰土金花茶可以在酸性土中正常生长，而酸性土金花茶却难以适应石灰土环境（苏宗明和莫新礼，1988）。金花茶组植物对生境土壤的高度专一性可能与其对土壤的钙适应机制有关（柴胜丰等，2021）。然而，以往关于金花茶组植物的研究多集中于表观形态特征（李凤英等，2013; 朱栗琼等，2021）、药用成分（Yang et al.，2018; 李辛雷等，2019）、栽培技术（黄昌艳等，2016; 邓荫伟等，2017）、遗传多样性（刘凯等，2019; 卢家仕等，2021）等方面，对于不同生境下金花茶组植物的钙适应机制仍然知之甚少。
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本研究以10种石灰土金花茶和4种酸性土金花茶为对象，测定其生境土壤的钙含量和pH值以及该生境下植物叶中各钙形态的含量。主要探究:（1）不同生境下金花茶组植物的叶钙形态是否存在差异;（2）土壤因素是否对叶钙形态产生显著影响;（3）各金花茶组植物的叶钙形态特征。本研究结果将有助于深入理解金花茶组植物对其生境土壤的钙适应机制，以期为金花茶组植物保育措施的制定提供科学依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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在金花茶组植物的主要自然分布区内选择了14个物种（表1），包括10种石灰土金花茶，即凹脉金花茶（Camellia impressinervis，CIM）、龙州金花茶（C. longzhouensis，CLO）、柠檬金花茶（C. limonia，CLI）、弄岗金花茶（C. grandis，CGR）、毛瓣金花茶（C. pubipetala，CPU）、崇左金花茶（C. perpetua，CPE）、顶生金花茶（C. terminalis，CTE）、淡黄金花茶（C. flavida，CFL）、平果金花茶（C. pingguoensis，CPI）、贵州金花茶（C. huana，CHU）[注:原天峨金花茶（C. tianeensis）已并入贵州金花茶]和4种酸性土金花茶，即东兴金花茶（C. tunghinensis，CTU）、金花茶（C. nitidissima，CNI）、显脉金花茶（C. euphlebia，CEU）、小瓣金花茶（C. parvipetala，CPA）。在各采样点，选择长势基本一致的3株成年植株，每株从东、南、西、北4个方向分别采集一年生成熟叶，每株采集叶片约100 g，共42个叶样，并相应地采集植株根部周围的表层（0~20 cm）土壤，每个土样采集约1 kg。
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1.2 测定方法
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1.2.1 植物叶片钙形态的测定
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在实验室将叶样于105℃杀青30 min，80℃烘干12 h，粉碎过100目筛待测。叶片各钙形态测定主要参考齐清文等（2013）的方法并略作改进。首先，称取（0.500 0±0.000 5）g叶样粉末加到50 mL的具盖离心管中; 加入20 mL 80%乙醇于30℃恒温水浴锅中振荡提取1 h，4 000 r·min-1离心10 min; 取上清液过滤至50 mL容量瓶中，接着加入10 mL 80%乙醇继续提取2次，每次1 h，提取完后离心取上清液过滤，用5%盐酸定容。然后，依次使用蒸馏水、1 mol·L-1氯化钠、2%醋酸、0.6%盐酸重复上述步骤，共获得5种提取液。最后，将剩余残渣转入洁净的高脚烧杯中，电热板加热使杯内液体挥发干，于KERRIC通风橱内加硝酸-高氯酸（4∶1，V/V）5 mL，摇匀，50℃电热板上浸泡过夜; 次日再加硝酸-高氯酸（4∶1，V/V）10 mL，并在瓶口加一玻璃小漏斗，80℃消解30 min，升温至150℃消解1 h后，继续升温至180℃消解，使瓶口产生的棕色烟转为白色烟; 待瓶口白烟冒净，高脚烧杯中液体挥发完全后，分2次加入0.2%硝酸共15 mL，在电热板上加热使底部沉淀物充分溶解，冷却后，定量转移至25 mL容量瓶中，用0.2%硝酸定容，摇匀后于0.45 μm滤膜过滤，获得残渣钙提取液。同时，消煮空白和标准样品进行质量控制和结果校正。使用原子吸收分光光度计法分别测定上述6种提取液中的硝酸钙和氯化钙（calcium nitrate and calcium chloride，AIC-Ca）、水溶性有机酸钙（water soluble organic acid calcium，H2O-Ca）、果胶酸钙（calcium pectate，NaCl-Ca）、磷酸钙和碳酸钙（calcium phosphate and calcium carbonate，HAC-Ca）、草酸钙（calcium oxalate，HCl-Ca）、硅酸钙（calcium silicate，Res-Ca）的含量。叶总钙（total calcium，Tot-Ca）含量为这6种钙形态含量之和。
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1.2.2 土壤指标的测定
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土壤样品经过自然风干、除杂、混合、磨细、过100目筛，制成分析样品备用。土壤pH（Soil-pH）用玻璃电极法测定，即称取土样10 g于50 mL高型烧杯中，加25 mL去离子水，用玻璃棒搅拌1 min，使土粒充分分散，放置30 min后采用玻璃电极法测定上清液pH值。土壤钙含量（Soil-Ca）用微波消解-火焰原子吸收分光光度法测定，即称取土样0.l g，加入4 mL浓硝酸和2 mL氢氟酸，放置一会，放到微波样品制备仪上进行微波消解，消解完成后用原子吸收分光光度计测定钙含量。
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1.3 数据统计和分析
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数据统计及分析采用SPSS v23.0软件。其中，石灰土金花茶和酸性土金花茶的土壤环境及叶钙形态间的差异比较使用独立样本T检验; 使用Spearman系数计算叶钙形态与土壤指标间的相关性并进行显著性检验; 使用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较不同金花茶物种间的叶钙形态差异，并采用Duncan法进行多重检验。使用R语言Flexclust程序包（Dolnicar &Leisch，2014）对金花茶叶钙形态特征进行聚类分析，聚类方法采用系统聚类Ward法，并使用欧式距离作为聚类距离。
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注: 数值为平均值±标准差; 不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
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Note: Dada indicate ; different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05) .
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2 结果与分析
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2.1 石灰土金花茶和酸性土金花茶的土壤环境及叶钙形态比较
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T检验结果显示，石灰土生境的pH和钙含量都极显著（P＜0.01）高于酸性土（表2），表明两种生境土壤环境存在较大差异。在叶中，除硝酸钙和氯化钙、果胶酸钙外，其余4种叶钙形态及叶总钙含量均表现为石灰土金花茶极显著（P＜0.01）高于酸性土金花茶。各叶钙形态含量在石灰土金花茶中的大小依次为草酸钙（41.17%）、果胶酸钙（27.67%）、硅酸钙（16.36%）、磷酸钙和碳酸钙（13.82%）、水溶性有机酸钙（0.61%）、硝酸钙和氯化钙（0.37%）; 而在酸性土金花茶中的大小依次为果胶酸钙（43.10%）、草酸钙（28.70%）、磷酸钙和碳酸钙（17.13%）、硅酸钙（10.16%）、硝酸钙和氯化钙（0.53%）、水溶性有机酸钙（0.37%）。其中，硝酸钙和氯化钙、水溶性有机酸钙在石灰土金花茶和酸性土金花茶中的含量均较低，所占比例均不足叶总钙含量的1%。
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注 :** 表示极显著差异（P＜0.01）; NS表示无显著差异。
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Note: ** indicates extremely significant difference（P＜0.01）; NS means no significant difference. *和**分别表示在0.05和0.01水平上相关性显著。
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2.2 土壤指标与叶钙形态间的相关性
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相关性分析显示，土壤指标与各叶钙形态间的相关性（R）为0.12~0.95（图1）。其中，土壤pH与土壤钙含量呈极显著正相关（P＜0.01）。土壤pH与各叶钙形态（除硝酸钙和氯化钙外）均呈极显著正相关（P＜0.01）。土壤钙含量与叶总钙含量、水溶性有机酸钙、草酸钙、硅酸钙、磷酸钙和碳酸钙等叶钙形态呈显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）正相关，但与硝酸钙和氯化钙、果胶酸钙相关性不显著（P＞0.05）。叶总钙含量与6种钙形态的相关性均达到显著（P＜0.05）及以上水平，其中与草酸钙与硅酸钙相关性分别达0.95和0.92，表明这两种钙形态对叶总钙含量的影响最大。草酸钙与硅酸钙间相关性达0.82，磷酸钙和碳酸钙与草酸钙、硅酸钙的相关性分别达0.70和0.71，表明各叶钙形态间存在相互影响。
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2.3 金花茶组植物间的叶钙形态比较及聚类分析
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单因素方差分析显示，各叶钙形态及叶总钙含量在14种金花茶物种间均表现出极显著差异（P＜0.01）（图2）。其中，硝酸钙和氯化钙含量以柠檬金花茶最高（50.48 mg·kg-1），并显著高于其他金花茶。水溶性有机酸钙和果胶酸钙的含量分别以平果金花茶（56.41 mg·kg-1）和顶生金花茶（1 739.33 mg·kg-1）最高。磷酸钙和碳酸钙含量以顶生金花茶最高（1 087.00 mg·kg-1）、金花茶最低（358.83 mg·kg-1），金花茶、显脉金花茶、东兴金花茶等3种酸性土金花茶含量显著（P＜0.05）低于大部分石灰土金花茶种类。同样，草酸钙含量以顶生金花茶最高（2 743.67 mg·kg-1）、金花茶最低（268.5 mg·kg-1），而硅酸钙含量则以平果金花茶最高（1 164.23 mg·kg-1）、金花茶最低（53.21 mg·kg-1）。金花茶、显脉金花茶、东兴金花茶等3种酸性土金花茶叶钙形态含量特征较为一致，其草酸钙和硅酸钙含量显著（P＜0.05）低于石灰土金花茶种类。小瓣金花茶叶钙形态含量特征与石灰土金花茶种类较为一致，其各钙形态含量与大部分石灰土金花茶无显著差异（P＞0.05）。
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进一步利用聚类分析比较了14种金花茶物种间的钙形态特征，图3结果表明，14种金花茶可划分为三大类。Ⅰ. 叶总钙含量低:钙形态以果胶酸钙为主，有显脉金花茶、东兴金花茶、金花茶。Ⅱ. 叶总钙含量适中:钙形态以果胶酸钙与草酸钙为主，有淡黄金花茶、毛瓣金花茶、龙州金花茶、凹脉金花茶、崇左金花茶。Ⅲ. 叶总钙含量高:钙形态以草酸钙为主，有柠檬金花茶、弄岗金花茶、平果金花茶、顶生金花茶、贵州金花茶、小瓣金花茶。
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3 讨论与结论
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叶作为植物重要营养器官，对其钙形态特征的研究将有助于揭示植物对于栖息地土壤环境的钙富集、钙适应机制。曹建华等（2011）报道的喀斯特地区植物平均叶总钙含量为1 216.82 mg·kg-1，非喀斯特地区植物的为767.94 mg·kg-1，如几种常见喀斯特地区乔木，即枫香（Liquidambar formosana，1 173.25 mg·kg-1）、黄樟（Cinnamomum parthenoxylon，1 024.87 mg·kg-1）、香椿（Toona sinensis，963.63 mg·kg-1）等。齐清文等（2013）报道了11种草本的报春苣苔属（Primulina）植物叶钙形态含量和组成，其中来自石灰岩钙质土壤的植物叶平均总钙含量为2 285.6 mg·kg-1、砂页岩酸性土壤的为1 379.3 mg·kg-1、丹霞地貌土壤的为1 329.1 mg·kg-1。本研究中，石灰土金花茶和酸性土金花茶叶总钙含量分别达5 287.10 mg·kg-1和3 008.35 mg·kg-1，均远高于上述地区的植物，表明金花茶组植物具有较强钙富集能力。除物种差异外，金花茶组植物较强钙富集能力的部分原因可能是占据了生态位优势。例如，谢丽萍等（2007）在喀斯特森林生态系统中研究发现，不同层次植物对于土壤钙的吸收有较大差异，其中灌木层具有比草本层更强的钙富集能力。石灰土金花茶的叶总钙含量显著高于酸性土金花茶，可能与其生境土壤丰富的钙含量和高pH有关。这表明在不同生境土壤的长期适应中，石灰土金花茶和酸性土金花茶可能形成了独特的钙富集、钙适应机制。
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图1 金花茶土壤环境与叶钙形态的相关性
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Fig.1 Correlation between soil environment and leaf calcium speciation of golden Camellia species
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植物调节体内钙形态组成，是适应不同钙环境的重要机制之一。曹建华等（2011）研究发现，喀斯特地区植物叶钙形态以果胶酸钙（27.91%~32.82%）为主，而非喀斯特地区植物则以草酸钙（33.69%~34.34%）为主。本研究结果显示，石灰土金花茶叶钙形态以草酸钙（41.17%）为主，而酸性土金花茶则以果胶酸钙（43.10%）为主，与曹建华等（2011）的研究结果相反。一方面，这可能由于钙形态组成在不同物种间、同一物种的不同居群间都表现出广泛变异（齐清文等，2013）。另一方面，叶的化学元素计量特征可能受不同发育时期、气候、地形等综合因素影响具有动态变化（王程媛等，2011; Sardans et al.，2016）。以往研究表明，草酸钙在植物体内的基本功能是调节细胞钙水平，在高钙环境下，一些优势种植物可以将体内过量的游离态钙离子与草酸结合形成稳定的草酸钙结晶，而草酸钙结晶的晶型、大小及数量随生长环境中钙离子浓度的变化而变化，以此避免产生钙毒害（冯晓英等，2010; He et al.，2014），这可能是石灰土金花茶对高钙环境的适应机制之一。而果胶酸钙是一种活性钙，主要存在于细胞壁中，齐清文等（2013）研究发现，在低钙的酸性砂页岩土壤中，果胶酸钙可维持细胞内钙稳定，从而保证植物生长过程中对钙的正常需求。因此，以果胶酸钙为主的钙形态分布可能有助于酸性土金花茶更好地适应低钙环境。
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图2 14种金花茶的叶硝酸钙和氯化钙（A）、水溶性有机酸钙（B）、果胶酸钙（C）、磷酸钙和碳酸钙（D）、草酸钙（E）、硅酸钙（F）、总钙（G）的含量比较
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Fig.2 Comparison of AIC-Ca (A) , H2O-Ca (B) , NaCl-Ca (C) , HAC-Ca (D) , HCl-Ca (E) , Res-Ca (F) , Tot-Ca (G) in leaves of 14 golden Camellia
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图3 14种金花茶叶片钙形态含量特征聚类树形分析图
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Fig.3 Cluster tree analysis diagram of the leaf calcium speciation characteristics of 14 golden Camellia species
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土壤环境对于植物钙吸收的影响，一直是研究者关注的焦点（李晓婷等，2019; 许木果等，2021）。在金花茶中，我们观察到大部分叶钙形态含量与土壤pH、土壤钙含量呈显著（P＜0.05）正相关，表明高钙和高pH的土壤环境会促进金花茶植物体内各钙形态的积累。而硝酸钙和氯化钙与土壤pH和土壤钙含量的相关性均不显著（P＞0.05），这可能是由于硝酸钙和氯化钙在植物体内代谢较快、存在时间较短，因此受土壤环境影响小（曹建华等，2011）。此外，相关性分析还揭示了各钙形态间的一些相互影响，如叶总钙量受草酸钙、硅酸钙影响最大，而草酸钙、硅酸钙间的极显著正相关（R=0.82，P＜0.01）可能暗示两者在金花茶体内的相互促进作用。然而，有关植物各类钙形态间相关性的报道目前较少，本研究结果将为植物叶片钙形态多样性研究提供参考。
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叶总钙含量及各钙形态在金花茶物种间均存在极显著差异（P＜0.01），表明金花茶组植物在物种多样化过程中钙形态特征产生了较大分化。为了更好地量化这些钙形态特征，我们利用系统聚类Ward法对14种金花茶进行了分类，结果显示除小瓣金花茶外，其余3种酸性土金花茶归为一类，而石灰土金花茶可进一步划分为两类。植物叶片化学含量特征在物种分化过程中具有系统发育保守性，如最近在八角莲属（Dysosma）植物的叶片中发现，90%以上叶片化合物含量与物种间的系统发育密切相关（周鑫鹏，2019）。而金花茶组植物的叶钙形态特征也可能受到物种间的系统发育关系调控。例如，肖政等（2014）利用ISSR标记对29种金花茶进行遗传分析，发现顶生金花茶与平果金花茶的系统发育关系较近。刘凯等（2019）基于SNP和卢家仕等（2021）基于SCoT分子标记技术的研究结果均显示，金花茶、东兴金花茶、显脉金花茶的系统发育关系较近。这些结果与我们基于叶钙形态特征的聚类分析结果一致，表明金花茶组植物的叶钙形态特征也可能受到了物种间系统发育关系的影响。值得注意的是，小瓣金花茶与贵州金花茶的聚类距离最近，这与姜丽娜等（2020）对22种金花茶的花瓣多酚组分含量特征的聚类分析结果一致。但是，两者的系统发育关系并未在先前研究（肖政等，2014）中得到证实。这也可能与小瓣金花茶的生境（土壤pH=5.86，土壤钙含量=1 473.75 mg·kg-1）位于酸性土和石灰土的过渡区间有关，或者受到其他土壤因素的影响，如有机质含量、营养元素、微生物等（邸欣月等，2015）。综上所述，不同生境背景下金花茶组植物的叶钙形态差异可能是土壤环境和遗传因素共同作用的结果。在后续金花茶组植物的引种栽培和保育研究中，应尽可能确保其栽培土壤环境与原生境接近，并重点关注土壤pH和土壤钙含量等指标的变化，避免产生钙毒害或钙供应不足。
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致谢 感谢广西壮族自治区防城金花茶国家级自然保护区管理中心、广西弄岗国家级自然保护区管理中心、广西龙虎山自然保护区管理处在采样过程中提供的帮助。
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摘要
为探究不同生境下金花茶组植物的叶片钙形态特征,该研究以10种石灰土生境和4种酸性土生境的金花茶为对象,测定了其生境土壤的钙含量和pH值,以及该生境下金花茶组植物叶中的硝酸钙和氯化钙、水溶性有机酸钙、果胶酸钙、磷酸钙和碳酸钙、草酸钙、硅酸钙和总钙的含量。结果表明:(1)石灰土生境的土壤钙含量和土壤pH均极显著(P＜0.01)高于酸性土。(2)在石灰土生境中,金花茶组植物的叶钙形态以草酸钙(41.17%)为主,而在酸性土生境中则以果胶酸钙(43.10%)为主,除硝酸钙和氯化钙、果胶酸钙外,石灰土金花茶的各叶钙形态和总钙含量均极显著(P＜0.01)高于酸性土金花茶。(3)相关性分析结果显示,大部分叶钙形态含量与土壤pH和土壤钙含量呈极显著(P＜0.01)正相关,表明土壤环境对金花茶组植物叶钙形态特征具有重要影响。(4)单因素方差分析结果显示,各叶钙形态含量在物种间存在极显著(P＜0.01)差异,表明金花茶组植物在物种分化过程中叶钙形态特征具有多样性。(5)基于叶钙形态特征的聚类分析显示,14种金花茶可归为3大类。总体而言,不同生境背景下金花茶组植物的叶钙形态差异可能是土壤环境和遗传因素共同作用的结果。该研究结果有助于深入理解金花茶组植物对土壤钙的适应机制,为其保育措施制定提供了参考。
Abstract
In order to study the calcium speciation characteristics in leaves of golden Camellia species under different habitats, 10 species of golden Camellia from calcareous soil habitats and four species from acidic soil habitats were used as the research objects. The calcium content (Soil-Ca) and pH (Soil-pH) of habitat soil, and the contents of calcium nitrate and calcium chloride (AIC-Ca), water soluble organic acid calcium (H2O-Ca), calcium pectate (NaCl-Ca), calcium phosphate and calcium carbonate (HAC-Ca), calcium oxalate (HCl-Ca), calcium silicate (Res-Ca), and total calcium (Tot-Ca) of leaves were measured. The results were as follows: (1) the Soil-Ca and Soil-pH of calcareous soil were extremely significantly (P＜0.01) higher than those of acidic soil. (2) The leaf calcium speciation of golden Camellia species from calcareous soil habitats was primarily HCl-Ca (41.17%), while species from acidic soil habitats was primarily NaCl-Ca (43.10%), and all calcium speciation and total calcium content in leaves of species from calcareous soil were extremely significantly (P＜0.01) higher than that from acidic soil except for AIC-Ca and NaCl-Ca. (3) Correlation analysis showed that most of the content of calcium speciation in leaves was extremely significantly (P＜0.01) and positively correlated with Soil-Ca and Soil-pH, indicating that soil environment had an important influence on the leaf calcium speciation characteristics of golden Camellia species. (4) According to one-way ANOVA, the content of each leaf calcium speciation was extremely significant (P＜0.01) difference among the species in golden Camellia revealing that the calcium speciation characteristics had a considerable variation during the species differentiation. (5) Cluster analysis based on calcium speciation characteristics showed that the 14 species of golden Camellia could be grouped into three categories. In summary, the differences in leaf calcium speciation of plants of golden Camellia species in different habitats may be the consequence of a combination of soil environmental and genetic factors. The results of this study will help to understand the adaptation mechanism of golden Camellia species to soil calcium and provide a reference for the formulation of conservation measures.
Keywords
golden Camellia ； soil environment ； calcium adaptation ； cluster analysis ； karst plant
