种子是植物有性繁殖的基础，种子萌发是植物生长和发育的第一步。种子萌发受到其自身因素和外部环境的共同作用:种子的形态构造、化学成分、发育、成熟、休眠等均能影响萌发进程（Bareke，2018）; 另外，环境因素如温度、水分、氧气、光照、土壤酸碱度等也会对种子萌发产生重要的影响（Carrera-Castaño et al.，2020）; 细菌、真菌、病毒等微生物则是种子萌发的生物影响因素（Xiao et al.，2020）。种子萌发和幼苗定居障碍是许多珍稀濒危植物致濒的重要原因（Nicole et al.，2011; 盛茂银等，2011）。研究濒危植物的种子萌发特性，探寻种子萌发的限制因素，可以为其致濒机制研究及保护策略的制定提供依据，也可以为其开发利用奠定基础。

岩黄连（Corydalis saxicola），又名石生黄堇，是罂粟科（Papaveraceae）紫堇属（Corydalis）植物，主要分布于广西、贵州、云南等地的岩溶地区（余姣娇等，2018）。岩黄连全株可入药，主要药用成分为生物碱类，包括脱氢卡维丁、巴马汀和小檗碱等（Xie et al.，2021），具有抗炎、抗病毒和抗肿瘤的药理作用（Guo et al.，2022），临床上已被开发成相应的注射液和片剂用于肝炎、肝硬化及肝癌等治疗。由于自身繁育困难与人为采挖，岩黄连野外种群数量锐减，被列入2021年国家重点保护野生植物名录。为了解决野生资源保护与生产应用之间的矛盾，开展岩黄连种苗繁育、野外回归保育及人工种植等工作势在必行。

岩黄连植株多为丛生，7~14 cm长的总状花序以顶生或叶对生方式从枝条上长出，授粉后形成的蒴果单个含20~30粒种子（蒋水元等，2002），30 d左右种子即能成熟。岩黄连种子细小，每克种子数量为1 700~2 000粒。以上这些特性对于种子育苗和人工种植都具有一定优势。蒋水元等（2002）研究表明，岩黄连种子发芽率较低，即采即播发芽率最高为40%~50%，一般在20%~30%之间; 随着存储时间增加发芽率不断降低，室温存储半年后发芽率基本丧失。蒋运生等（2006）对岩黄连种子的不同着生部位、贮藏方法、贮藏时间和播种基质等影响因素进行实验，证实着生在果穗中部的种子发芽率最高、纸袋密封和低温贮藏的种子发芽率最好、火土加肥泥的播种基质更有利于种子萌发。另外，酸碱溶液对种子的萌发前处理也能影响其萌发率（陈柯羽，2011）。以上是关于岩黄连种子萌发的一些研究结果，但种子萌发特性在岩黄连致濒原因、野外回归保育及生产应用方面的研究还有待进一步加强，可推广应用的优良种子萌发方法还需深入探索。

该研究以岩黄连种子为材料，针对种子保存条件和种子萌发处理方法进行研究，拟探究以下问题:（1）岩黄连种子较适合的保存方法;（2）化学试剂前处理、温度、光照、干旱及pH对种子萌发的影响;（3）可推广的岩黄连种子高效萌发方法。基于以上的研究，探究岩黄连的致濒原因，从而为野生岩黄连的保育提供理论和技术保障; 为其大田栽培和产业化推广提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为2020年6月及2021年6月从广西壮族自治区河池市东兰县桂源药材专业合作社的栽培基地采收的岩黄连种子，将脱壳后的种子用塑料袋密封后置于4℃冰箱中避光保存备用。岩黄连种子呈椭圆形，种皮黑亮、质地坚硬，种子颗粒饱满、健康，千粒重为0.465~0.472 g，水分含量为17.2%~18.5%。

1.2 实验方法

1.2.1 温度对岩黄连种子活力及萌发的影响

将适量2020年采收的岩黄连种子（简称2020年种子）和2021年采收的岩黄连种子（简称2021年种子）分装到密封袋中，分别置于室温和4℃冰箱中避光保存。分别取保存1、3、6个月后的种子，用4% NaClO溶液浸泡10 min除菌，无菌水洗6次后进行播种。每个培养皿播100粒左右的种子，每个处理3皿，每隔2~3 d加入1 mL无菌水保持种子湿润，于25℃培养箱的暗培养条件下进行萌发。从萌发实验的第10天开始，每隔2 d统计种子萌发数，若连续10 d无种子萌发则实验结束。

另外，取4℃冰箱中保存的2021年种子，经 4% NaClO溶液浸泡及无菌水清洗后播种于培养皿中，分别置于20、25、30、35℃恒温培养箱中，黑暗条件下进行萌发实验。

1.2.2 化学试剂前处理对种子萌发的影响

取4℃冰箱中保存的种子，进行以下4种处理:①种子用清水漂洗后，直接用无菌水洗6次进行播种; ②种子用4% NaClO溶液浸泡10 min，无菌水漂洗6次后播种; ③种子用1 mol·L^-1 HCl溶液浸泡1 h，无菌水漂洗6次后播种; ④种子首先经1 mol·L^-1 HCl溶液浸泡1 h，然后经4% NaClO溶液浸泡10 min，最后用无菌水漂洗6次后播种。在25℃黑暗条件下进行萌发实验。

1.2.3 光照、干旱及pH对种子萌发的影响

取4℃冰箱保存的2021年种子，用1.2.2的4种处理方式处理种子后分别在25℃周期性光照（12 h光照/12 h暗）和完全黑暗条件下进行萌发实验。

以PEG6000建立干旱胁迫，研究不同干旱胁迫下种子的萌发情况。取4℃冰箱保存的2021年种子，经4% NaClO溶液浸泡10 min后用无菌水清洗6次，分别置于去离子水对照和5%、10%、15%、20%的PEG6000溶液浸润滤纸的培养皿中，每隔2~3 d向培养皿中加入1 mL的无菌水，保持PEG6000的相应浓度，于25℃黑暗条件下进行萌发实验。

分别用HCl、NaOH溶液调节无菌去离子水pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，取4℃冰箱保存的2021年种子，经4% NaClO溶液浸泡10 min后用无菌水清洗6次，置于不同pH值去离子水浸润滤纸的培养皿中，每隔2~3 d向培养皿中加入1 mL相应pH值的无菌水，于25℃黑暗条件下进行萌发实验。

1.2.4 混沙保湿冷藏对种子萌发的影响

将4℃冰箱保存的2020、2021年种子与干净的河沙、无菌水按1∶10∶3的体积比例混合，置于密封袋中，并于4℃冰箱中避光保藏60 d，之后取出种子于室温条件下进行萌发。同时，以干燥冷藏的种子作为对照，将其直接与河沙、无菌水混合后于室温条件下进行萌发。

1.3 数据分析

萌发率=全部萌发种子数/播种种子数; 发芽势为萌发处理15 d后的种子萌发率。运用Excel软件对数据进行统计和均值、方差分析; 利用GraphPad Prism 5软件进行显著性分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 温度对岩黄连种子活力及萌发率的影响

取保存于4℃冰箱的2020、2021年种子，于2021年11月开始分别进行室温和4℃冰箱存储，分别在存储1、3、6个月后对种子进行萌发实验。图1结果显示，4℃冰箱存储的2020年种子发芽率基本没有降低，保持在30%左右; 4℃冰箱存储的2021年种子的发芽率不仅没有降低，还稍微有所提升; 2020年种子经室温保存后，发芽率随保存时间增加不断降低; 2021年种子与2020年种子相似，发芽率随室温保存时间增加也逐渐降低。这说明相比于室温，4℃冰箱保存更有利于延长种子活力，4℃冰箱保存2 a的种子萌发率仍能达到30%。

以2021年种子为材料，分别在20、25、30、35℃的恒温培养箱中进行萌发实验。图2结果显示，20℃条件下的种子发芽率最高，25℃发芽率与20℃相比虽稍微有所降低，但不显著; 在30℃时，种子基本不能萌发，35℃时种子完全不能萌发，与20℃条件相比均呈显著降低。这说明高温明显不利于种子的萌发。

以上结果说明，温度是影响种子活力及萌发率至关重要的因素之一。与室温相比，低温保存更有利于延长种子的活力; 种子在20~25℃条件下的发芽势及发芽率都能保持在较高水平，而在30℃以上的高温下，种子几乎完全失活，从而丧失萌发率。

2.2 化学试剂处理对岩黄连种子萌发的影响

图3结果显示，与H₂O对照相比，4% NaClO溶液处理种子对发芽势无促进作用，甚至会使发芽势稍微降低，而1 mol·L^-1 HCl、HCl+NaClO处理均能显著提高种子发芽势（图3:A）。无论是1M HCl、4% NaClO单独处理还是两种试剂合并处理，均能显著提高种子发芽率（图3:B）。除利用HCl和NaClO溶液处理种子外，还尝试使用NaOH溶液处理种子，处理后基本未能观察到种子萌发。这说明酸性化学试剂对种子的前处理能显著提高其发芽率，其中HCl、HCl+NaClO溶液的处理能同时显著提高发芽势和发芽率，是较优的种子前处理方法。

2.3 光照和化学试剂处理对岩黄连种子萌发的影响

图4结果显示，以2021年种子为材料，经4种前处理的种子在黑暗条件下的发芽率都显著高于光照条件，并且经NaClO+HCl处理后，暗培养条件下种子发芽率的增高率比直接水浸更为显著。以上结果说明，黑暗条件更有利于种子的萌发。

2.4 干旱对岩黄连种子萌发的影响

以2021年种子为材料，以H₂O为对照，以5%、10%、15%、20%PEG6000溶液（分别代表不同干旱程度）为不同干旱条件，于25℃黑暗条件下进行萌发实验。图5结果显示，种子在H₂O条件下发芽势和萌发率最高; 在5% PEG6000溶液处理下发芽势降低，萌发率与对照无明显差异; 10%、15% PEG6000溶液处理下的种子发芽势和萌发率与对照相比均显著降低; 在20% PEG6000处理下，种子萌发明显滞后且萌发率显著低于对照，为对照组的50%左右。这说明干旱胁迫对种子的萌发具有一定影响，随着干旱程度增加，虽然发芽势逐渐降低，但只有达到较高程度的干旱时，其种子萌发率才会显著降低。

2.5 不同pH条件对岩黄连种子萌发的影响

以2021年种子为材料，分别置于pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的无菌去离子水润湿培养皿中，于25℃黑暗条件下进行萌发实验。图6结果显示，6个不同pH条件下的种子萌发率均在40%左右浮动，发芽势差异不大。这说明种子在pH值3.0~8.0不同条件下萌发，发芽势和萌发率均无显著差异。

2.6 混沙保湿冷藏对岩黄连种子萌发的影响

以2020、2021年种子为材料，采用混沙保湿冷藏60 d后室温萌发和直接室温萌发2种方式，研究岩黄连种子适宜的发芽方式。图7结果显示，由于冬季室温偏低，室温条件下种子需要在38 d后开始萌发，在76 d后萌发基本结束; 而经混沙保湿冷藏处理的种子，置于室温条件下仅需4 d即可萌发且快速达到萌发高峰。从发芽率结果（图7）来看，经过低温混沙湿藏的种子萌发率显著高于直接室温萌发的发芽率。这说明混沙保湿冷藏处理能显著提高种子的发芽势和萌发率，有利于提升苗的整齐度。

3 讨论与结论

3.1 环境因子对岩黄连种子萌发的影响

种子生存能力受其自身特性和储藏条件的共同影响，低温干燥保存有利于降低种子变质、减缓种子呼吸和其他代谢进程，是一种常用的种子保存方法（Bareke，2018）。蒋水元等（2002）研究证实，岩黄连种子寿命很短，常温保存几个月后就会丧失大部分活力。本研究结果显示，低温密封保存种子的萌发率显著高于常温密封保存，常温保存6个月的种子萌发率为低温保存的2/3左右，说明岩黄连种子较适宜低温干燥的保存方式。本研究结果常温保存种子萌发率与蒋水元等（2002）报道的结果有所差异，推测保存室温相对偏低（本研究保存时间为11月至次年5月）和密封保持种子水分含量等方式能够有效延缓岩黄连种子活力降低的进程。

适宜的温度有助于种子体内酶的活化，促使赤霉素和脱落酸等影响种子萌发的激素水平发生改变，从而促进种子萌发（Carrera-Castaño et al.，2020）。本研究的温度梯度实验证实，20~25℃对种子的萌发较为有利，30~35℃时种子发芽率基本丧失，说明岩黄连种子萌发对温度的耐受范围较窄。岩黄连植株生长期最适宜的温度为10~20℃，高于25℃后，各器官的衰老加剧。这说明岩黄连从种子萌发到生长发育阶段都偏好于凉爽的气候，高温等极端天气可能是加剧该物种濒危的重要因素。

种皮是种子与外界环境的屏障，具有保护种胚和防止病虫害入侵的作用，但种皮也会对种子萌发造成障碍。韩凤等（2012）研究证实，毛黄堇种子外被蜡质，影响了吸水膨胀和通气，对萌发有一定的抑制作用。岩黄连种子与其近源种毛黄堇种子类似，其种皮对种子萌发可能存在抑制作用。适量的酸能腐蚀种皮、增强种子的透水透气性、解除种子内外物质交换的障碍，从而提高其发芽率和缩短萌发周期（Bareke，2018）。此外，酸还能降解种皮上的部分抑制性成分、杀死细菌或真菌以减少霉变，从而促进萌发（李兵兵等，2013）。本研究中，利用HCl和NaClO对岩黄连种子进行萌发前处理，其发芽势和萌发率都得到了显著提升，说明适当的酸处理能够解除岩黄连种皮对萌发的抑制作用，从而促进种子萌发。

水分和光照是种子萌发的关键影响因素。种子吸水能触发呼吸活动的恢复、能量的产生、修复机制的激活、蛋白质的生物合成和运输等生理生化反应（Carrera-Castaño et al.，2020）。不同物种的种子萌发对光照的需求差异很大（Yang et al.，2020），光抑制种子萌发被认为是避免种子在土壤表面或接近土壤表面发芽，从而保护幼苗在极端高温下免受脱水和暴露的一种生理适应性（Carta et al.，2017）。野生岩黄连植株常生长于无直射光且雨水不能直接淋湿的陡壁石缝中（陆瑞群，2006），具有避强光性和一定的干旱耐受性。本研究中，种子的发芽势随着干旱程度的增加而逐渐降低，低程度干旱胁迫下的发芽率与对照相比无显著差异，只有在较高干旱胁迫时发芽率才会明显降低，说明岩黄连种子萌发能耐受一定的干旱胁迫。光照和黑暗条件下的萌发实验证实，岩黄连种子在黑暗条件下萌发率更高，说明强光对岩黄连种子萌发具有抑制作用。

种子萌发和幼苗生长阶段对酸碱环境的适应性是决定植物能否生存的关键（申玉华等，2016）。本研究中，pH值为3.0~8.0的条件下，种子发芽势及萌发率均无显著差异，说明岩黄连种子萌发能耐受较宽范围的酸碱度变化，这与其植株对黑色石灰土与酸性红壤的较强适应能力具有一致性（蒋水元等，2002）。

陆瑞群（2006）研究结果证实，岩黄连种子的发芽过程慢且不整齐; 本研究中，种子在恒温条件下萌发需要1个月左右完成，室温条件萌发则需要2个月左右。该种子萌发特性可能对岩黄连这类珍稀濒危植物类群在恶劣生境中的持续存在具有重要意义，发芽过程缓慢有助于部分种子先避开高温、干旱和强光等恶劣环境后再进行萌发、生长和繁衍。

3.2 岩黄连种苗繁育困难的原因分析及对其野外保育的启示

岩黄连母株的种子产量较高，而其野外的幼苗更新却非常困难，推测是由种子难萌发、幼苗难存活等因素共同造成的。本研究证实，岩黄连种子在温度超过30℃时基本不能萌发，并且随着干旱程度加深种子发芽势和发芽率都会降低。自然环境下，岩黄连植株于3月下旬至4月进入盛花期，种子成熟后掉落萌发时间在6—8月之间（钱月华，2019）。6—8月的气温基本都会超过25℃，常在30~35℃之间波动，严重制约了岩黄连种子的萌发; 另外，空气湿度变化大、岩黄连所生长的岩缝环境缺少水分等因素也不利于岩黄连种子的萌发; 岩黄连幼苗具有高度依赖外部环境和易感病害等特性，使得能存活长大的植株数量进一步减少（蒋水元等，2006）。以上因素共同导致了岩黄连野外幼苗更新困难，而人为采挖进一步威胁了种群的更新和扩大。

本研究中，低温保存2 a的种子发芽率都能达到30%，有效延长了岩黄连种子的活力; 化学试剂对种子的前处理能进一步将萌发率提高至50%左右。这证明岩黄连播种不必受限于即采即播，可以先在种子采集后进行低温冷藏以保持其活力，再选择适当的气候进行播种; 另外，还可以在播种前通过化学试剂处理来进一步提高其萌发率。在岩黄连野外回归保育上，采取错峰播种使其种子更易萌发，或许可以获得更多的幼苗，从而提高其种群存活数量，实现其野外保育的目的。

3.3 可推广应用的岩黄连种苗繁育方法

岩黄连除了用于药品生产外，还用于岩溶区的植被恢复、林下种植、园林景观等领域，应用前景广阔。由于生产应用条件的限制，人们较难对岩黄连种子的消毒灭菌和萌发条件进行严格的控制。本研究中，与直接室温萌发相比，对岩黄连种子先用混沙保湿冷藏一段时间后再进行室温萌发的操作能够显著提高种子的发芽势和萌发率，该方法操作简单，所需设备仅为4℃冰箱，在实际生产上具有普遍推广和应用的潜能。

参考文献