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马尾松（Pinus massoniana）为松科松属高大乔木，是我国古老的本土针叶树种，也是我国特有的速生树种之一，广泛分布于秦岭—淮河以南，云贵高原以东17个省、自治区、直辖市，为我国分布面积最广的针叶林树种（李爱民等，2008）。随着全球气候变暖，水资源短缺问题日益严重，大范围持续性干旱和土地盐渍化对我国的农林生产造成了严重威胁，使植物生长受限且使植物体内的有机物成分发生改变，影响其价值与产量（Pichler &Oberhuber，2007；张金凤等，2021），对我国的农林生产造成了严重威胁，因此提高树木对干旱和盐胁迫的抗性一直是森林培育的主要目标之一。马尾松作为我国重要的木材、采脂树种和荒山造林先锋树种之一（徐向华和丁贵杰，2006），具有较强的抗逆性，但仍被重度干旱胁迫显著抑制了高和生物量的增长，严重影响其生长和繁殖（全文选和丁贵杰，2017），因此研究马尾松对干旱和盐胁迫的适应机制至关重要。
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植物在遭受生物或非生物胁迫时，会在叶片释放挥发性物质，包括萜烯类和脂肪酸衍生物等，这些物质具有直接和间接的信号调控作用（Laothawornkitkul et al.，2008），能够及时激活脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、油菜素内酯（BR）等植物激素的合成和信号转导通路，调节相关基因表达，以缓解或适应胁迫环境（阎秀峰等，2007；Obata &Fernie，2012）。其中，萜类化合物响应干旱胁迫的程度较高，在植物抵抗逆境胁迫的过程中起到重要作用（Rastogi et al.，2019）。萜类化合物是植物次生代谢产物中最丰富、结构最多样化的一类（罗永明等，2003），其以异戊二烯为基本单位，共同前体物为异戊烯焦磷酸（IPP）和其异构体二甲烯焦磷酸（DMAPP）（Nisar et al.，2015; 孙丽超等，2017）。IPP和DMAPP在生物体内的合成主要有甲羟戊酸途径（MVA pathway）和丙酮酸途径（MEP pathway）两种途径（赵乐等，2016； 陈晓明，2018）。其中，MVA途径主要参与倍半萜的合成（Eisenreich et al.，2001），MEP途径主要参与单萜、二萜和类胡萝卜素等的合成（Rohmer，1999； 张艺丹等，2019）。1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（HDR）是MEP途径的末端活性酶，催化1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP）发生还原反应并以5∶1的比例生成IPP与DMAPP的混合物，具有提供前体萜类物质和主要限速作用（Peng et al.，2011； 王颖等，2014）。
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Cunningham等（2000）早期发现在大肠杆菌中，HDR基因对MEP途径有限制性作用；在番茄（Lycopersicon esculentum）果实成熟和拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗脱硫这两个大量产生类胡萝卜素的过程中，HDR转录水平明显增加，说明HDR表达与类胡萝卜素的积累有关（Botella-Pavía et al.，2004）；张雯等（2008）对银杏（Ginkgo biloba）的研究显示，转入HDR基因的银杏与野生型银杏相比，总内酯含量显著提高；Chen等（2010）对萝芙木（Rauvolfia verticillata）的研究发现，MeJA、乙酰水杨酸（ASA）、ABA、紫外光（UV）等激发子可以诱导上调HDR基因的转录水平；在铁皮石斛（Dendrobium officinale）中，HDR基因的表达受水杨酸（SA）和ABA的调控，但不受MeJA影响（吴秋菊等，2015）。这些已有的研究均表明HDR基因在MEP途径中具有重要的限制调控作用，与植物类胡萝卜素、内酯等萜类化合物的合成密切相关且受调控非生物胁迫响应的ABA、SA等植物激素诱导，说明其可能参与植物对非生物胁迫的响应（Wang et al.，2008; Huang et al.，2009; Sun et al.，2009; 王毅等，2015）。
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在马尾松中，MEP途径上游关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的编码基因PmDXS和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的编码基因PmDXR已被成功克隆，并对其进行了功能和表达分析。DXR是MEP途径的第一个关键酶，对PmDXS基因的研究结果显示，用机械损伤、15%渗透剂、H2O2、乙烯利、MeJA、SA 6种非生物胁迫或激素处理马尾松后，PmDXS基因的表达量在短时间内均有所上调；在400 mmol·L-1 NaCl、800 mmol·L-1 D-甘露醇（D-mannitol）、pH 5.0、pH 9.0等非生物胁迫环境下，TransB/pET28a-PmDXS重组菌生长状况显著优于对照，表明PmDXS基因在干旱和盐胁迫中具有正调控效应（李荣，2021）。综上结果表明，PmDXS基因参与非生物胁迫应答，在马尾松的逆境胁迫响应中起一定作用。DXR是催化MEP途径第二步反应的关键限速酶，朱灵芝（2021）对PmDXR基因的研究结果显示，相比于野生型拟南芥，PmDXR转基因拟南芥的生长发育在不同浓度NaCl、SA、MeJA、D-mannitol的胁迫条件下受到的抑制较小，说明PmDXR基因也在一定程度上参与马尾松逆境胁迫响应。因此，作为MEP途径的末端限速酶HDR的编码基因，PmHDR极有可能参与马尾松在干旱和盐等非生物胁迫的响应过程。本文将克隆马尾松PmHDR基因序列，对其进行生物信息学分析和组织特异性表达分析，并构建基因表达载体转化拟南芥，对比分析转基因拟南芥和野生型在干旱和盐胁迫条件下的生长情况，拟探讨以下问题：（1）PmHDR蛋白理化性质、结构、所属基因家族及物种间的进化关系；（2）PmHDR基因的组织特异性表达模式；（3）PmHDR是否参与干旱和盐胁迫等非生物胁迫环境下的胁迫响应。以期为进一步阐明马尾松萜类化合物形成过程关键酶基因的潜在生物学功能提供帮助，并为马尾松抗逆育种提供参考。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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2 年生马尾松实生苗和拟南芥种子，均取自南京林业大学林木遗传育种全国重点实验室。
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大肠杆菌TreliefTM 5α感受态细胞和pClone007 Blunt载体购自北京擎科生物科技股份有限公司；根癌农杆菌GV3101感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；Plant Total RNA Isolation Kit、Gel DNA Extraction Mini Kit、Plant DNA Isolation、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；BamH I、Sac I、QuickCut Buffer购自Takara；PCR Master Mix和1st Strand cDNA Synthesis SuperMix购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；DNA ladder、Loading buffer For Agarose Gels和TAE Buffer购自上海捷瑞生物工程有限公司。
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试验中引物合成和序列测序由南京擎科生物科技股份有限公司和上海杰李生物技术有限公司完成。
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1.2 方法
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1.2.1 PmHDR基因的克隆
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参照南京诺唯赞FastPure® Plant Total RNA Isolation Kit的说明书提取2年生马尾松总RNA，使用Nanodrop One超微量紫外分光光度仪检测RNA的浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。选取纯度高且完整性较好的RNA，利用反转录试剂盒1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR将RNA反转录为cDNA，于-20℃条件下保存备用。
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根据火炬松（Pinus taeda）同源基因序列，使用DNAMAN软件设计PmHDR特异性引物，分别为PmHDR-F（5′-ATGCCTTCGAGCCTCAGCTTTGC-3′）、PmHDR-R（5′-TACCGTCTGCAACGCCTCCTCAT-3′）。以逆转录获得的马尾松cDNA第一链为模板进行PCR反应，扩增体系总体积为50 μL，包括高保真酶20 μL，上游和下游引物各1 μL，cDNA 2.5 μL，ddH2O 25.5 μL。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性15 s，60℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用Gel DNA Extraction产物回收试剂盒进行回收纯化，实施连接克隆载体（pClone007）并转化至大肠杆菌TreliefTM5 α感受态细胞中，培养单菌落，通过菌落PCR筛选阳性克隆送至南京擎科生物科技有限公司测序。
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1.2.2 PmHDR基因的生物信息学分析
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利用在线软件对PmHDR基因及其编码蛋白进行生物信息学分析，具体网址见表1；利用DNAMAN软件对PmHDR蛋白进行同源性比对；运用MEGA 7.0的邻接法构建系统发育进化树。
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1.2.3 PmHDR同义密码子偏好性分析
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利用CodonW 1.4.2软件计算PmHDR密码子的使用特性参数，包括A3s、U3s、C3s、G3s、相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、有效密码子数（effective number of codons，ENC）、密码子适应系数（codon adaptation index，CAI）、最优密码子使用频率（frequency of optimal codons，FOP）、GC含量和密码子第3位上的GC含量（GC3s）等。运用EMBOSS中的CUSP在线软件计算密码子的使用频率。
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拟南芥、烟草（Nicotiana tabacum）、大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因组密码子使用频率数据来自密码子使用统计数据库（http://www. kazusa.or.jp/codon）。
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1.2.4 PmHDR基因的表达分析
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剪取2年生马尾松根、幼叶、老叶、幼茎、老茎5个部位的样品，分别使用液氮研磨，提取各样品总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop One超微量紫外分光光度仪检测各RNA的浓度和质量，将符合要求的RNA反转录成cDNA。使用Nanodrop One测定cDNA浓度，并将各cDNA稀释至10 ng·μL-1。
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根据克隆所得PmHDR基因序列，使用Primier 5.0软件设计实时荧光定量PCR（qPCR）引物q-PmHDR-F（5′-AGAAATCGCAGAGCAGAA-3′）和q-PmHDR-R（5′-CAACGCCTCCTCATCCTT-3′），以TUA（GenBank：KM496535.1）为内参基因，用SYBR Green进行实时荧光定量表达分析。反应体系共10 μL，包括cDNA模板1 μL、上下游引物各0.2 μL、SYBR Green Real-time PCR Master Mix（2×）5 μL、无菌水3.6 μL。qPCR反应在ABI StepOne Plus荧光定量PCR仪上进行，反应程序使用两步法：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，40次循环，分别设置3次生物学重复和3次技术重复，PCR反应结束后进行熔解曲线分析。使用SPSS 26软件进行数据分析并作图，采用邓肯多重比较法分析各组织表达量差异显著性。
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1.2.5 基因表达载体构建
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使用pBI121-GUS质粒作为真核表达载体，根据测序得到的PmHDR基因序列，选择BamH I和Sac I两个酶切位点，设计去除终止密码子且含有酶切位点序列的重组引物PmHDR-BamHI-F （5′-ACGGGGGACTCTAGAGGATCC ATGCCTTCGAGCCTCAGCTT-3′）和PmHDR-SacI-R（5′-CGATCGGGGAAATTCGAGCTCCCGTCTGCAACGC CTCCT-3′）。以马尾松cDNA第一链为模板进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测产物质量和大小，并切胶回收得到含酶切位点的PmHDR基因ORF片段。
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用限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和Sac I对pBI121-GUS质粒进行双酶切，将酶切后的质粒切胶回收后，与PmHDR基因片段连接，并立即转化TreliefTM 5α大肠杆菌，于含卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜，挑取单菌落进行PCR阳性检测，将阳性单克隆扩繁后送至南京擎科生物科技股份有限公司进行测序，并由其返还重组载体质粒pBI121-PmHDR。
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1.2.6 遗传转化拟南芥及胁迫处理
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用重组质粒冻融法转化农杆菌，扩大培养阳性单菌落，花序侵染法转化拟南芥。收取拟南芥种子，依次用75%乙醇和20%次氯酸钠消毒，均匀播种在含有50 mg·mL-1 Kana抗生素的MS固体培养基上进行抗性筛选，将其中长势良好的拟南芥幼苗移栽至营养土中继续培养。分别采集野生型和转基因拟南芥的叶片，液氮研磨，使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的FastPure® Plant DNA Isolation提取基因组DNA，并以其为模板，用PmHDR-BamHI-F和PmHDR-SacI-R做引物，进行PCR扩增，筛选出PmHDR转基因拟南芥。重复筛选1次，采集拟南芥种子。
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分别配制含50 mmol·L-1 NaCl和含5、10、50、100 mmol·L-1 D-mannitol的MS固体培养基，将野生型和转基因拟南芥消毒后分别点播在培养基上，每个培养基播种20个种子。培养10 d后，观察拟南芥发芽及生长状况，从每个培养基中挑选10个成功发芽的拟南芥，测量并记录其胚根长，使用RStudio软件对根长数据进行分析。
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2 结果与分析
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2.1 PmHDR基因的克隆及序列比对
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扩增获得PmHDR基因中间片段序列，长度为1 458 bp，与琼脂糖凝胶电泳结果相符（图1）。
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通过NCBI的Blastn在线软件，将PmHDR基因序列与其他物种进行比对。输出结果显示，共有5种植物基因序列与PmHDR相似度高于85%，分别为赤松（Pinus densiflora）、火炬松（P. taeda）、白云杉（Picea glauca）、北美云杉（P. sitchensis）和日本落叶松（Larix kaempferi），其中赤松和火炬松的IDS1基因与PmHDR基因序列相似度在98%以上。
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图1 PmHDR中间片段电泳检测结果
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Fig.1 Electrophoresis results of intermediate fragment of PmHDR
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通过NCBI的Blastp在线软件对PmHDR的氨基酸序列进行比对，结果显示PmHDR与赤松、火炬松的氨基酸序列相似度最高，在97%以上，与北美云杉、日本落叶松、银杏、川桑（Morus notabilis）、澳洲坚果（Macadamia integrifolia）、胡桃（Juglans regia）、凤梨（Ananas comosus）等物种的相似度也均高于78%，说明HDR基因在进化过程中较为保守。选取与PmHDR氨基酸序列相似度较高的几个物种，通过DNAMAN软件进行氨基酸序列比对（图2），结果发现PmHDR的氨基酸序列与其他物种一致，均含有4个保守的半胱氨酸残基活性位点，Lu等（2008）研究表明这些活性位点可能参与催化过程中铁硫键的形成。
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2.2 PmHDR的生物信息学分析
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2.2.1 蛋白一级结构及理化性质分析
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PmHDR编码蛋白的分子式为C2415H3844N654O744S19，理论分子质量为54.55 kD，理论等电点为5.98，由485个氨基酸组成，共包含71个负电荷氨基酸碱基和65个正电荷氨基酸碱基。该蛋白中含量最多的氨基酸为赖氨酸（Lys），占总氨基酸的9.3%；含量最少的为半胱氨酸（Cys），仅占1.4%（图3：A）。蛋白脂肪系数为80.99，总平均亲水性为-0.447，说明该蛋白是亲水性蛋白（图3：B）；不稳定系数为28.98，说明该蛋白为稳定蛋白。
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图2 PmHDR基因氨基酸序列与其他物种的同源性比对
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Fig.2 Amino acid homology alignment of PmHDR gene from Pinus massoniana and other species
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图3 PmHDR编码蛋白的理化性质分析
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Fig.3 Amino acid compositions of protein encoded by PmHDR
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2.2.2 保守结构域的预测与分析
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PmHDR的氨基酸序列保守结构域预测结果显示，PmHDR编码蛋白在第60至第483个氨基酸残基处具有PLN02821多功能结构域，该结构域属于LytB/IspH基因超家族（Accession：cl19123），该家族成员可将1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸（HMBPP）转化为异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲烯焦磷酸（DMAPP），由此可预测PmHDR编码蛋白具有还原HMBPP的功能（图4：A）。
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2.2.3 亚细胞定位预测
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使用在线软件Cell-PLoc 2.0和IncLocator对PmHDR的亚细胞定位进行预测，结果均显示PmHDR编码蛋白位于叶绿体中的可靠性较高。
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2.2.4 蛋白质跨膜结构及信号肽分析
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利用在线软件TMHMM Server v.2.0对PmHDR编码蛋白的跨膜结构及跨膜方向进行预测分析，结果显示该蛋白不存在跨膜结构，全部位于膜外（图4：B）。
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使用在线工具SignalP 5.0 Server对PmHDR编码蛋白进行信号肽预测分析，结果显示其不含有信号肽，表明其为非分泌蛋白（图4：C）。
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2.2.5 蛋白质磷酸化位点和糖基化位点分析
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使用NetPhos 3.1 Server在线软件进行磷酸化位点的预测分析，结果显示PmHDR编码蛋白中共有47个磷酸化位点，包括23个丝氨酸（S）、20个苏氨酸（T）、4个酪氨酸（Y）（图4：D）。
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分别使用YinOYang1.2和NetNGlyc 1.0 Server在线软件进行O-糖基化和N-糖基化进行预测分析，结果显示PmHDR编码蛋白中共有3个N-糖基化位点，分别为第129个、第172个、第397个氨基酸（图4：E）；共有4个O-糖基化位点，分别为第4（S）个、34（S）个、58（T）个、236（S）个氨基酸（图4：F）。
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2.2.6 蛋白二级结构分析
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PmHDR编码蛋白的二级结构预测结果显示：该蛋白中含有α螺旋211个，占比43.51%；含有无规则卷曲164个，占比33.81%；含有延伸链78个，占比16.08%；含有β转角32个，占比6.60%（图5）。
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2.2.7 蛋白三级结构预测
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采用同源建模法进行PmHDR编码蛋白的三级结构预测，结果显示PmHDR编码蛋白与同源模板c3dnfB [1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸还原酶]的序列相似度为33%，置信度为100%（图6）。
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2.2.8 系统进化树的构建
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通过邻接法（neighbor-joining）将PmHDR氨基酸序列与其他物种进行比对并构建进化树，PmHDR与裸子植物聚在一支，与赤松、火炬松同源性更高（图7）。
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2.3 PmHDR密码子偏好性分析
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2.3.1 GC、GC3s、ENC、CAI和FOP分析
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使用CodonW 1.4.2对PmHDR的A3s、U3s、C3s、G3s、ENC、CAI、FOP等参数进行分析，结果分别为0.400、0.46 8、0.272、0.155、47.77、0.215、0.363。其中，ENC常用于分析基因的密码子使用偏好，其值范围为20~61，ENC值越小表示基因密码子偏好性越强，一般认为ENC值小于35表示基因密码子使用偏好性显著（Mensah et al.，2019）。PmHDR基因的ENC值为47.77，说明PmHDR基因的密码子选择偏好性较弱。CAI为编码该蛋白的所有密码子相对于这条基因都使用最优密码子情况下的适应系数，FOP为最优密码子和其同义密码子的比值，二者值介于0~1，其值越高，表示密码子偏好性越强，基因表达水平越高。PmHDR基因的CAI为0.215，FOP为0.363，均更趋近于0，进一步说明PmHDR基因对密码子的选择偏好性弱，表达水平较低。此外，使用EMBOSS中的CUSP在线软件计算总GC含量和GC3s，结果显示 PmHDR编码氨基酸时密码子GC含量和GC3s值分别为39.92%和34.77%，说明密码子偏好以A/U结尾。
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图4 PmHDR编码蛋白的生物信息学分析
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Fig.4 Bioinformatics analysis of protein encoded by PmHDR
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图5 PmHDR编码蛋白二级结构预测
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Fig.5 Prediction of secondary structure of protein encoded by PmHDR
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图6 PmHDR编码蛋白三级结构预测
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Fig.6 Prediction of tertiary structure of protein encoded by PmHDR
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2.3.2 相对同义密码子使用度分析
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在PmHDR基因选择的密码子中，有28个密码子的RSCU值大于1.0，为PmHDR偏好密码子（表2），CCA、AGA、GGA、ACU和CUU 5个密码子RSCU值大于2.0，偏好性较强，其中编码精氨酸（Arg）的AGA密码子RSCU值为2.70，偏好性极强。编码脯氨酸（Pro）的CCC、CCG和编码Arg的CGG密码子的RSCU值为0，说明它们可能不参与PmHDR基因的翻译过程。PmHDR基因偏好密码子中绝大多数G/C结尾的密码子RSCU值较低，也进一步表明PmHDR基因的密码子偏好以A/U结尾，表达水平较低。
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2.3.3 PmHDR外源宿主的选择
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将PmHDR基因的密码子使用频率分别与拟南芥、烟草、酿酒酵母和大肠杆菌等模式物种的基因组进行比较分析（表3），将比值大于等于2.0和小于等于0.5作为筛选密码子偏好性差异较大的标准，以此统计差异个数。与2种模式植物的基因组相比，PmHDR基因的绝大部分密码子使用偏好性差异较小，与拟南芥和烟草基因组密码子的使用频率差异较大的分别有16和14个，说明在进行PmHDR遗传转化试验时，烟草和拟南芥均可作为异源表达的受体。与2种微生物的基因组相比，PmHDR与大肠杆菌密码子偏好性差异很大，使用频率差异较大的密码子有24个，而与酿酒酵母相比使用频率差异较大的密码子只有14个，密码子偏好性差异显著小于大肠杆菌，说明酿酒酵母更适合作为PmHDR微生物内异源表达试验的受体。
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图7 PmHDR系统进化树
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Fig.7 Phylogenetic tree of PmHDR
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2.4 PmHDR的组织特异性表达分析
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通过实时荧光定量表达技术，分析PmHDR基因在成年马尾松根、幼叶、老叶、幼茎、老茎中的表达情况。结果表明，PmHDR基因在马尾松根中表达量最低，在老叶中表达量最高，为根中表达量的122.2倍，在幼叶、幼茎、老茎中的表达量分别为根的21.2倍、6.5倍和6.0倍（图8）。
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注：下划线表示该密码子RSCU＞1; *表示终止密码子。
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Note: The underline indicates that the RSCU of the condon＞1; * indicates the stop codon.
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2.5 胁迫处理下拟南芥生长观测
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将转基因拟南芥种子播种在含Kana抗生素的MS固体培养基上进行筛选，并选取其中正常生长发育的植株幼苗转移至营养土中继续培养2~3周后进行分子鉴定（图9），结果显示被选择的8株转基因拟南芥中有6株检测结果为阳性，因此采集这6株拟南芥的种子，开展后续实验。
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利用D-mannitol和NaCl分别对拟南芥进行干旱胁迫和盐胁迫处理，将野生型和PmHDR转基因拟南芥种子分别点播在含有不同浓度D-mannitol和NaCl的MS固体培养基上培养10 d，观察并记录各个培养基中拟南芥的生长发育情况（图10）。结果表明，在正常培养条件（无胁迫处理）下，转基因拟南芥的胚根长略大于野生型拟南芥，但差异不显著；与之相比，经5、10、50、100 mmol·L-1 D-mannitol和50 mmol·L-1 NaCl处理的拟南芥生长受到不同程度的抑制，其中野生型拟南芥平均胚根长分别减小35.49%、39.26%、53.59%、77.08%、77.06%，转基因拟南芥平均胚根长分别减小11.03%、7.40%、21.88%、59.09%、20.10%。在D-mannitol和NaCl胁迫处理下，转基因拟南芥的胚根长显著大于野生型拟南芥，说明转基因拟南芥受D-mannitol和NaCl胁迫影响小，对干旱和盐胁迫表现出更强的抗逆性（图11）。
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续表3
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注：下划线表示密码子使用频率差异较大; *表示终止密码子。
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Note: The underline indicates that the codon usage frequency is quite different; * indicates the stop codon.
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图8 PmHDR基因的组织特异性表达
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Fig.8 Tissue specific expression of PmHDR gene
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3 讨论与结论
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萜类化合物是植物次生代谢产物中最丰富、结构最多样化的一类，在植物生长发育和抵抗逆境胁迫的过程中到重要作用。1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（HDR）是萜类化合物合成中MEP途径的末端活性酶，具有提供前体萜类物质和主要限速作用。为探究马尾松对干旱和盐胁迫的响应，本文研究并克隆了PmHDR基因。萜类化合物生物合成MEP途径上游关键酶的编码基因PmDXS和PmDXR已被成功克隆和分析，发现二者均在一定程度上参与了马尾松对非生物胁迫的响应（李荣，2021；朱灵芝，2021）。
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PmHDR蛋白可能在一定程度上促进马尾松的生长发育和逆境响应过程。本文研究发现PmHDR基因长度为1 458 bp，编码485个氨基酸，其编码蛋白包含LytB/IspH基因超家族的核心序列和PLN02821多功能结构域，属于HDR家族，这说明PmHDR蛋白参与催化萜类化合物的生物合成。对PmHDR蛋白进行结构预测，发现该蛋白富含α螺旋与不规则卷曲，三级结构呈“苜蓿叶”形，与其他物种中的HDR蛋白结构相似；4个保守的半胱氨酸残基可能处于“苜蓿叶”中间位置，构成铁硫建形成酶的催化中心，从而参与维持细胞内的氧化还原反应（刘苗苗等，2017）。
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图9 转基因拟南芥PCR检测
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Fig.9 PCR detection of transgenic Arabidopsis thaliana
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研究不同植物HDR基因表达和功能时，需要根据物种特性及其主要萜类化合物的类型和功能有针对性地进行分析和验证。本研究结果发现PmHDR基因在马尾松各个组织中均有表达，但在老叶中表达量明显高于其他部位，其次为幼叶、幼茎和老茎，在根中表达量最低，这与铁皮石斛（吴秋菊等，2015）和甘薯（Dioscorea esculenta）（Wang et al.，2012）中HDR的表达特征较为相似。而在其他研究中出现了不同结果，例如，在萝芙木（Chen et al.，2010）中，HDR基因在花中表达量最高，果实次之；在秦艽（Gentiana macrophylla）（岑文等，2015）中，HDR基因在花中表达水平显著高于其他组织，而在根、茎、叶中表达差异不显著；在银杏（Ginkgo biloba）（Lu et al.，2008）和橡胶（Hevea brasiliensis）（Sando et al.，2008）中，HDR基因在根中表达量则显著高于茎和叶。这说明HDR基因在不同植物中的表达模式和表达量存在较大的差异，这可能是因为在不同植物中，次生代谢所产生的萜类化合物类型和数量不同，进而导致其功能和应用的差异，因此对于不同物种中HDR等萜类化合物生物合成上游关键基因的研究目的也各不相同。如对于秦艽（岑文等，2015）、艾叶（Artemisia argyi）（刘苗苗等，2017）、丹参（Salvia miltiorrhiza）（程琪庆等，2013）等药用植物来说，萜类及萜类衍生物是其重要的有效药用成分；对于葡萄（Vitis vinifera）（陈天池等，2023）来说，萜烯类物质是葡萄香气的主要贡献者，香气是衡量葡萄品质的重要指标。
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图10 不同处理下拟南芥生长状况
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Fig.10 Growth of Arabidopsis thaliana in different treatments
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图11 不同处理下拟南芥的胚根长
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Fig.11 Root length of Arabidopsis thaliana radicle under different treatments
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对密码子偏好性进行分析，不仅有助于基因功能、蛋白表达的研究，亦有助于选择合适的宿主，提高外源基因表达效率（吴宪明等，2007）。本研究对马尾松PmHDR基因的密码子偏好模式进行了系统分析，结果发现PmHDR基因在编码蛋白时对CCA、AGA、GGA、ACU和CUU 5个密码子的偏好性极强，而编码脯氨酸的CCC、CCG和编码Arg的CGG密码子可能不参与PmHDR基因的翻译过程。ENC、CAI、FOP等多个参数显示，PmHDR基因对密码子的选择偏好性弱，这可能导致其编码蛋白表达水平较低。PmHDR基因中密码子的GC和GC3s含量分别为39.92%和34.77%，说明其密码子偏好以A/T结尾，这一结果符合马尾松总体上偏好使用第3位为A/T碱基的密码子的特征（朱沛煌等，2020； 镐青青等， 2022）。
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由于马尾松同源转化平台的搭建存在难度，至今未完成搭建，目前的功能基因分析只能暂时借助异源转化。本研究将PmHDR基因的密码子使用频率分别与拟南芥、烟草、酿酒酵母和大肠杆菌等模式物种的基因组进行比较分析，发现相比于大肠杆菌原核表达系统，酵母真核表达系统更适合作为PmHDR基因的表达系统，在PmHDR遗传转化功能验证中，拟南芥和烟草均可作为其遗传转化受体，这一结果与在PmDXR基因中的研究一致（朱灵芝等，2021）。因此，在进行PmHDR基因功能验证时，本研究使用了拟南芥作为其遗传转化受体，通过对比转基因拟南芥和野生型拟南芥在干旱和盐胁迫条件下的表型差异，探究该基因的功能。
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在正常生理条件下，转基因拟南芥生长状况略好于野生型拟南芥，但差异并不显著。在干旱和盐胁迫处理条件下，转基因拟南芥生长受抑制情况显著弱于野生型拟南芥，表现出更强的抗逆性，这与其上游基因PmDXS（李荣，2021）和PmDXR（朱灵芝，2021）的研究相似。前人研究已经发现，在萝芙木（Chen et al.，2010）和铁皮石斛（吴秋菊等，2015）中，HDR基因的表达均受ABA的调控。作为一种胁迫激素，ABA在植物抗逆过程中起着重要作用，广泛地参与到植物抗寒、抗旱、耐盐等多个胁迫响应过程。ABA的生物合成主要有类萜途径、类胡萝卜素途径两条途径，在高等植物中以类胡萝卜素途径为主（Yoshida et al.，2019），而类胡萝卜素是萜类合成MEP途径的下游通路。因此，PmHDR基因对干旱和盐胁迫的响应很可能与ABA有关且可能存在反馈调节。这一结果可以为马尾松抗旱和抗盐碱的分子育种提供候选基因和参考，但PmHDR基因调控干旱和盐胁迫响应的具体调节机制还需要进一步研究。
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参考文献
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BOTELLA-PAVÍA P, BESUMBES O, PHILLIPS MA, et al. , 2004. Regulation of carotenoid biosynthesis in plants: evidence for a key role of hydroxymethylbutenyl diphosphate reductase in controlling the supply of plastidial isoprenoid precursors [J]. Plant J, 40(2): 188-199.
-
CEN W, KONG WW, ZHENG P, et al. , 2015. Cloning and expression analysis of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase gene(GmHDR) from Gentiana macrophylla [J]. Guihaia, 35(5): 755-760. [岑文, 孔维维, 郑鹏, 等, 2015. 秦艽1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因(GmHDR)的克隆和表达分析 [J]. 广西植物, 35(5): 755-760. ]
-
CHEN J, LIU W, MIN C, et al. , 2010. The HDR gene involved in the TIA pathway from Rauvolfia verticillata: Cloning, characterization and functional identification [J]. J Med Plants Res, 4(10): 915-924.
-
CHEN XM, 2018. Exploration and expression of lipid-producing genes in Pinus massoniana [D]. Beijing: Chinese Academy of Forestry. [陈晓明, 2018. 马尾松产脂相关基因挖掘及表达规律研究 [D]. 北京: 中国林业科学研究院. ]
-
CHEN TC, ZHANG Q, WANG JY, et al. , 2023. Cloning and bioinformatics analysis of HDR gene from ‘Yinhong’ grape [J]. Mol Plant Breed, 21(2): 409-419. [陈天池, 张巧, 王锦阳, 等, 2023. ‘鄞红’葡萄HDR基因的克隆与生物信息学分析 [J]. 分子植物育种, 21(2): 409-419. ]
-
CHENG QQ, HE YF, LI G, et al. , 2013. Cloning and induced expression analysis of 4-hydroxy-3-methyl-but2-enyl diphosphate reductase gene (SmHDR) of Salvia miltiorrhiza [J]. Acta Pharm Sin, 48(2): 236-242. [程琪庆, 何云飞, 李耿, 等, 2013. 丹参4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸还原酶基因的全长克隆与诱导表达分析 [J]. 药学学报, 48(2): 236-242. ]
-
CUNNINGHAM FX, LAFOND TP, GANTT E, 2000. Evidence of a role for LytB in the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis [J]. J Bacteriol, 182(20): 5841-5848.
-
EISENREICH W, ROHDICH F, BACHER A, 2001. Deoxyxylulose phosphate pathway to terpenoids [J]. Trends Plant Sci, 6(2): 78-84.
-
HAO QQ, YAO S, LIU JH, et al. , 2022. Cloning and expression analysis of NAC transcription factor PmNAC8 in Pinus massoniana [J]. Biotechnol Bull, 38(4): 202-216. [镐青青, 姚圣, 刘佳禾, 等, 2022. 马尾松NAC转录因子基因PmNAC8的克隆及表达分析 [J]. 生物技术通报, 38(4): 202-216. ]
-
HUANG J, CHENG T, WEN P, et al. , 2009. Molecular characterization of the Oncidium orchid HDR gene encoding 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase, the last step of the methylerythritol phosphate pathway [J]. Plant Cell Rep, 28(10): 1475-1486.
-
LAOTHAWORNKITKUL J, PAUL ND, VICKERS CE, et al. , 2008. Isoprene emissions influence herbivore feeding decisions [J]. Plant Cell Environ, 31(10): 1410-1415.
-
LI AM, QUAN MH, NIU YY, et al. , 2008. Research progress on factors affecting the yield of Pinus massoniana turpentine [J]. Hunan For Sci Technol, 35(1): 58-59. [李爱民, 全妙华, 牛友芽, 等, 2008. 马尾松松脂产量影响因素研究进展 [J]. 湖南林业科技, 35(1): 58-59. ]
-
LI R, 2021. Cloning and functional identification of PmDXS gene of Pinus massoniana Lamb [D]. Nanjing: Nanjing Forestry University. [李荣, 2021. 马尾松PmDXS基因克隆及功能鉴定 [D]. 南京: 南京林业大学. ]
-
LIU MM, WU JW, WU SB, et al. , 2017. Cloning and characterization of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase (ArHDR) Gene in Artemisia argyi [J]. Chin Med Mat, 40(8): 1793-1797. [刘苗苗, 吴家文, 吴生兵, 等, 2017. 艾叶1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因的克隆及蛋白的结构性质分析 [J]. 中药材, 40(8): 1793-1797. ]
-
LU J, WU WS, CAO SW, et al. , 2008. Molecular cloning and characterization of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase gene from Ginkgo biloba [J]. Mol Biol Rep, 35(3): 413-420.
-
LUO YM, LIU AH, LI Q, et al. , 2003. Advances in biosynthesis of plant terpenoids and their key enzymes [J]. J Jiangxi Univ Tradit Chin Med, 15(1): 45-51. [罗永明, 刘爱华, 李琴, 等, 2003. 植物萜类化合物的生物合成途径及其关键酶的研究进展 [J]. 江西中医学院学报, 15(1): 45-51. ]
-
MENSAH R, SUN X, CHENG C, et al. , 2019. Analysis of codon usage pattern of banana basic secretory protease gene [J]. Plant Dis Pest, 10(1): 1-4.
-
NISAR N, LI L, SHAN L, et al. , 2015. Carotenoid metabolism in plants [J]. Mol Plant, 8(1): 68-82.
-
OBATA T, FERNIE A, 2012. The use of metabolomics to dissect plant responses to abiotic stresses [J]. Cell Mol Life Sci, 69(19): 3225-3243.
-
PENG M, CHEN M, CHEN R, et al. , 2011. The last gene involved in the MEP pathway of Artemisia annua: Cloning and characterization and functional identification [J]. J Med Plants Res, 5(2): 223-230.
-
PICHLER P, OBERHUBER W, 2007. Radial growth response of coniferous forest trees in an inneralpine environment to heat-wave in 2003 [J]. For Ecol Manag, 242(2-3): 688-699.
-
QUAN WX, DING GJ, 2017. Dynamic of volatiles and endogenous hormones in Pinus massoniana needles under drought stress [J]. Sci Silv Sin, 53(4): 49-55. [全文选, 丁贵杰, 2017. 干旱胁迫下马尾松幼苗针叶挥发性物质与内源激素的变化 [J]. 林业科学, 53(4): 49-55. ]
-
RASTOGI S, SHAH S, KUMAR R, et al. , 2019. Ocimum metabolomics inresponse to abiotic stresses: cold, flood, drought and salinity [J]. PLoS ONE, 14(2): e0210903.
-
ROHMER M, 1999. The discovery of a mevalonate-independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher plants [J]. Nat Prod Rep, 5(16): 565-574.
-
SANDO T, TAKENO S, WATANABE N, et al. , 2008. Cloning and characterization of the 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) pathway genes of a natural-rubber producing plant, Hevea brasiliensis [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 72(11): 2903-2917.
-
SUN LC, LI SY, WANG FZ, et al. , 2017. Research progresses in the synthetic biology of terpenoids [J]. Biotechnol Bull, 33(1): 64-75. [孙丽超, 李淑英, 王凤忠, 等, 2017. 萜类化合物的合成生物学研究进展 [J]. 生物技术通报, 33(1): 64-75. ]
-
SUN Y, CHEN M, TANG J, et al. , 2009. The 1-hydroxy-2-methyl-butenyl-4-diphosphate reductase gene from Taxus media: cloning, characterization and functional identification [J]. Afr J Biotechnol, 8(18): 4339-4346.
-
WANG G, CHEN M, LIU X, et al. , 2012. Molecular cloning and characterization of the HDR gene involved in the methyl-erythritol phosphate (MEP) pathway from sweet potato [Ipomoea batatas (L. ) Lam] [J]. Afr J Agric Res, 7(2): 205-211.
-
WANG Q, PI Y, HOU R, et al. , 2008. Molecular cloning and characterization of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase (CaHDR) from Camptotheca acuminata and its functional identification in Escherichia coli [J]. Bmb Rep, 41(2): 112-118.
-
WANG Y, LIU ZY, LÜ Q, et al. , 2014. Cloning and sequence analysis of α-pinene synthase gene from Pinus massoniana [J]. Anhui J Agric Sci, 42(13): 3808-3811. [王颖, 刘振宇, 吕全, 等, 2014. 马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析 [J]. 安徽农业科学, 42(13): 3808-3811. ]
-
WANG Y, ZHOU X, BI W, et al. , 2015. Cloning and sequence analysis of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase gene cDNA from Pinus kesiya var. langbianensis [J]. Guihaia, 35(5): 721-727. [王毅, 周旭, 毕玮, 等, 2015. 思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析 [J]. 广西植物, 35(5): 721-727. ]
-
WU QJ, WU MJ, WANG X, et al. , 2015. Cloning and expression analysis of 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase gene in Dendrobium officinale [J]. Chin Tradit Herbal Drugs, 46(3): 405-411. [吴秋菊, 武梅娟, 王翔, 等, 2015. 铁皮石斛1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因的克隆与表达分析 [J]. 中草药, 46(3): 405-411. ]
-
WU XM, WU SF, REN DM, et al. , 2007. The analysis method and progress in the study of codon bias [J]. Hereditas, 29(4): 420-426. [吴宪明, 吴松锋, 任大明, 等, 2007. 密码子偏性的分析方法及相关研究进展 [J]. 遗传, 29(4): 420-426. ]
-
XU XH, DING GJ, 2006. Physiological and biochemical responses of Pinus massoniana to low phosphorus stress [J]. Sci Silv Sin, 42(9): 24-28. [徐向华, 丁贵杰, 2006. 马尾松适应低磷胁迫的生理生化响应 [J]. 林业科学, 42(9): 24-28. ]
-
YAN XF, WANG Y, LI YM, 2007. Plant secondary metabolism and its response to environment [J]. Acta Ecol Sin, 27(6): 2554-2562. [阎秀峰, 王洋, 李一蒙, 2007. 植物次生代谢及其与环境的关系 [J]. 生态学报, 27(6): 2554-2562. ]
-
YOSHIDA, TAKUYA, CHRISTMANN, et al. , 2019. Revisiting the basal role of ABA — roles outside of stress [J]. Trends Plant Sci, 24(7): 625-635.
-
ZHANG JF, CHEN PZ, SUN XB, et al. , 2021. Effects on photosynthetic and resistant physiological characteristics of Pinus massoniana seedlings under drought stress [J]. Chin Agric Sci Bull, 37(1): 32-38. [张金凤, 陈佩珍, 孙晓波, 等, 2021. 干旱对马尾松幼苗光合作用及相关生理的影响 [J]. 中国农学通报, 37(1): 32-38. ]
-
ZHANG W, WANG YL, LIN J, et al. , 2008. Transformation of Ginkgo biloba with 1-hydroxy-2methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase gene [J]. J Fudan Univ(Nat Sci Ed), 47(5): 598-603. [张雯, 王玉亮, 林娟, 等, 2008. 银杏1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶基因(hdr)转化银杏的研究 [J]. 复旦学报(自然科学版), 47(5): 598-603. ]
-
ZHANG YD, ZENG Y, LU S, 2019. Recent progress in the study of metabolic flux regulation in rice diterpene biosynthesis [J]. Acta Phytophysiol Sin, 55(12): 1762-1768. [张艺丹, 曾英, 卢山, 2019. 水稻二萜合成途径中代谢流调控机制研究进展 [J]. 植物生理学报, 55(12): 1762-1768. ]
-
ZHAO L, MA LG, HAN DW, et al. , 2016. Cloning and bioinformatic analysis and prokaryotic expression of LaSPS gene from Lepidium apetalum [J]. Acta Hortic Sin, (6): 92-99. [赵乐, 马利刚, 韩杜菀, 等, 2016. 独行菜LaSPS基因的克隆与生物信息学分析及原核表达 [J]. 北方园艺, (6): 92-99. ]
-
ZHU LZ, ZHU PH, LI R, et al. , 2021. Analysis on codon bias of PmDXR gene in Pinus massoniana Lamb [J]. For Res, 34(2): 102-113. [朱灵芝, 朱沛煌, 李荣, 等, 2021. 马尾松PmDXR基因密码子偏好性分析 [J]. 林业科学研究, 34(2): 102-113. ]
-
ZHU LZ, 2021. Cloning and function analysis of PmDXR gene in Pinus massoniana [D]. Nanjing: Nanjing Forestry University. [朱灵芝, 2021. 马尾松PmDXR基因的克隆与功能分析 [D]. 南京: 南京林业大学. ]
-
ZHU PH, CHEN Y, ZHU LZ, et al. , 2020. Codon usage bias and its influencing factors in Pinus massoniana transcriptome [J]. Sci Silv Sin, 56(4): 74-81. [朱沛煌, 陈妤, 朱灵芝, 等, 2020. 马尾松转录组密码子使用偏好性及其影响因素 [J]. 林业科学, 56(4): 74-81. ]
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摘要
干旱和土地盐渍化是制约林业可持续发展的重要因素，植物在遭受生物或非生物胁迫时，会在叶片释放萜类等挥发性物质。1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸还原酶（HDR）是MEP途径的末端活性酶，具有提供前体萜类物质和主要限速作用。为探究马尾松HDR基因是否参与干旱和盐胁迫条件下的胁迫响应，该研究克隆了马尾松HDR基因开放阅读框，并初步分析了其生物信息、组织特异性表达水平和初步功能。结果表明：（1）PmHDR基因编码区长度为1458 bp，编码485个氨基酸，其编码蛋白包含LytB/IspH基因超家族的核心序列和PLN02821多功能结构域，属于HDR家族。（2）PmHDR密码子使用偏好性较弱，偏好使用A/U结尾的密码子，烟草、拟南芥与酿酒酵母更适合作为其异源表达受体。（3）qRT-PCR结果显示，PmHDR基因在马尾松老叶中表达量最高，其次为幼叶、幼茎和老茎，在根中表达量最低。（4）构建基因表达载体pBI121-PmHDR并转化拟南芥，转基因拟南芥对干旱和盐胁迫表现出更强的抗逆性。以上研究结果表明PmHDR参与了植物干旱和盐胁迫的响应和调节，并为马尾松抗逆育种提供了一定的理论支持。
Abstract
Drought and land salinization are inhibiting factors for the sustainable development of forestry, and the plants will release volatile substances such as terpenoids during biological or non-biological stress. The 1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-buteny-4-pyrophosphate reductase is the terminal active enzyme of the MEP pathway, which provides precursor terpenoids and has the main rate-limiting effect. In order to investigate whether HDR gene of Pinus massoniana is involved in stress response under drought and salt stress, the open reading frame of PmHDR gene was cloned, and bioinformation, tissue specific expression and preliminary function were analyzed. The results were as follows: (1) The coding region length of PmHDR gene is 1458 bp, encoding 485 amino acids, and its encoded protein contains the core sequence of LytB/IspH gene superfamily and PLN02821 multifunctional structural domain, which belongs to the HDR family. (2) The PmHDR codon use preference was weak, with a preference for codons ending in A/U. Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae were more suitable as its heterologous expression receptors. (3) Results of qRT-PCR showed that the PmHDR gene was most highly expressed in old needles of Pinus massoniana, followed by young needles, young stem and old stem and least expressed in root. (4) The gene expression vector pBI121-PmHDR was constructed and transformed into Arabidopsis thaliana. The transgenic A. thaliana showed greater resistance to drought and salt stress. These results indicate that PmHDR is involved in plant response and regulation to drought and salt stress, and provide some theoretical supports for Pinus massoniana stress-resistance breeding.
Keywords
Pinus massoniana ； PmHDR ； terpenoids ； gene cloning ； stress response
