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植物的生长发育过程中经常会遭受干旱、低温、盐碱及病虫害等影响，其中干旱的危害居众多生物和非生物胁迫之首，持续影响全球生态环境（Wang et al.，2017； 张宁，2021）。在受到干旱胁迫时，植物叶片最先反应，通过关闭气孔以减少蒸腾量、累积渗透调节物以维持细胞膨压从而避免细胞器受损，此外，叶片还可通过累积酚类、萜类和生物碱等次生代谢产物来适应周围环境（Xie et al.，2020）。中国沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis）是中国特有的沙棘属沙棘（H. rhamnoides）种内亚种，也是中国栽培和种植历史最悠久的一个亚种（Wang et al.，2014），具有很强的抗旱性且能够保土固沙，在我国气候干旱的黄土高原和青藏高原广泛分布。
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在沙棘中发现的黄酮类化合物50余种（周浩楠等，2020），其具有抗氧化、降血糖、降血压及增强免疫等功能（陈秋荣，2012；张东和邬国栋，2019；祁建宏和董芳旭，2020）。黄酮类化合物主要存在于植物的果实、根、茎、叶等部位，国内学者通过对沙棘果渣、叶片、果实等不同部位的黄酮类化合物进行分离、鉴定（康健等，2017；洪道鑫等，2017；魏增云等，2020），发现其叶片与果实中活性物质一致且叶中含量最多（王军宪等，1997）。类黄酮合成包括花青素、黄酮醇、原花青素等途径，其中ANR基因编码的花青素还原酶（anthocyanidin reductase，ANR）是以苯丙氨酸为底物合成原花色素的关键酶之一，作用于花青素形成表儿茶素，在木本植物中，如茶树（Muralidaran et al.，2014）、笃斯越橘（宋冰雪等，2017）、芒果（李先良等，2017）、葡萄（Zhu et al.，2014）中均克隆出了ANR 基因，在香椿（隋娟娟等，2021）、紫花苜蓿（Xie et al.，2004）、川桑（李军等，2016）中的发现并证明其表达量与植物适应性密切相关。高国日（2018）通过转录组测序分析发现中国沙棘主要通过以ABA依赖信号途径为主的信号传递途径和以黄酮类合成途径为主的活性氧自由基清除途径响应干旱胁迫。上述研究结果表明，中国沙棘中黄酮类物质对于其应对干旱胁迫起着重要的作用，但目前在沙棘中黄酮类化合物研究仅停留在提取纯化和活性分析方面，有关中国沙棘黄酮类物质合成相关基因与干旱胁迫的相关性及其与黄酮类含量变化间关系的研究尚未见报道。
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本研究以中国沙棘转录组数据中筛选出的差异表达HrANR基因为研究对象，设计特异性引物，通过PCR扩增获取HrANR基因全序列并送测序；依托生物信息学软件分析HrANR基因的序列信息及进化关系；在以上基础上采用回流法提取中国沙棘叶总黄酮，利用紫外分光光度计法测量总黄酮含量并通过统计软件分析含量与基因表达的关系，拟讨论以下几个问题：（1）中国沙棘HrANR基因序列信息及其同源性；（2）干旱胁迫下HrANR基因的时间表达特性；（3）HrANR基因的时空表达与总黄酮含量是否存在直接关系。旨在为黄酮类与中国沙棘抗旱性之间的关系阐明提供依据。
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1 材料与方法
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1.1 试验材料
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采集青海省西宁市湟源县（101°14′11″ E、36°46′24″ N，海拔3 010 m）的中国沙棘种子在青海省玛可河育苗基地播种育苗，苗木培养采用张丹等（2021）的方法，待幼苗生长至20 cm左右时，选择健康且无病虫害的一部分幼苗采集叶片进行HrANR基因的扩增，另外一部分进行干旱胁迫处理。
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1.2 干旱胁迫处理
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选择长势一致且无病虫害的幼苗，分为对照（CK）组和干旱胁迫（drought stress，DS）处理组，CK组照常浇灌，DS组停止浇水直至苗木缺水萎蔫。在干旱胁迫处理前将苗木灌水浇透，24 h后开始试验，在胁迫第9天复水（预试验中，DS组在第10天进行复水处理的幼苗不能恢复直至枯死），于每日9点采样，每个处理组设3个平行对照。分别在胁迫处理的0 d（CK）、3 d（DS1）、6 d（DS2）、9 d（DS3）、复水48 h（RW）采集样本用于后续试验，其中一部分中国沙棘的根茎叶组织分别液氮速冻后存于-80℃，用于基因表达模式研究，另外一部分采集叶片干燥后用于黄酮类含量分析，每个组织每个处理各3次生物学重复。
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1.3 总RNA的提取及cDNA的合成
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RN38植物RNA试剂盒（大连艾德莱生物科技有限公司，50次）提取中国沙棘各组织总RNA。对微量核酸蛋白测定仪（美国，赛默飞世尔科技，NanoDrop）和2%琼脂糖凝胶电泳检测合格的RNA用PrimeScript®Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，6210A，50次）反转录获得cDNA。
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1.4 HrANR基因的扩增
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根据前期中国沙棘全长转录组测序（PLoS ONE，https://doi.org/10.1371/journal.pone.0202213）获得的HrANR基因序列设计引物HrANR-F：5′-ATAAATCGTCAACGAACC-3′和HrANR-R：5′-TTCATACCCTAACTTCTA-3′，扩增产物长度为1 017 bp，使用rTaq酶（TaKaRa，DR100A，250U）以中国沙棘叶的cDNA为模板进行PCR扩增，产物进行凝胶电泳检测，对获得的条带单一大小符合预期的扩增产物送往生工生物工程（上海）有限公司进行双向测序。
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1.5 生物信息学分析
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核苷酸和氨基酸序列特征用Editseq分析。HrANR基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、稳定性等采用ProtParam（https://web. expasy.org/protparam/）进行分析；利用Kyte-Doolittle分析HrANR蛋白的疏水性，利用Predict protein（http://www.predictprotein.org/）和Swiss model（https://swissmodel.expasy.org/）进行HrANR蛋白二级、三级结构的分析；利用SignalP 5.0（SignalP-5.0-Services-DTU Health Tech）进行HrANR蛋白信号肽预测；采用TMHMM（https://services. healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0）进行跨膜区预测；采用在线分析网站Predict protein（https://www.predictprotein. org/）进行蛋白质亚细胞定位预测；利用DNAMAN进行同源蛋白序列分析；利用NCBI中的Blastp进行同源序列的搜索，使用MEGA 6.0构建NJ进化树；利用Megalin计算同源性。
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1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析
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通过在线软件设计荧光定量引物HrANR-DL-F： 5′-AATTCACTTACAGGCACAGGGTTGG和HrANR-DL-R：5′-AGCTAGTGTCTTGGAGGCAGGATAG-3′。选择在不同胁迫下能稳定表达的基因作为内参基因，根内参基因选择TATA （F: 5′-AAGTTGGCAGCACGAAAGT ATG-3′，R: 5′-GGGGAATTTAACATCACA AGAACC-3′），叶内参基因选择HIS3（F: 5′-CCGTAAATCAGCCCC AACC-3′，R: 5′-GAACAAGCC TCTGGAATGGAA-3′），茎内参基因选择PEPC（F: 5′-GTCGTCCATCAAAAC GCAAG-3′，R: 5′-AAGCCAAGCCACACAGGTAAA-3′）。在Q2000 B荧光定量PCR仪（杭州朗基）上进行qRT-PCR，3次生物学重复。
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1.7 中国沙棘叶片黄酮类提取及含量测定
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将干旱胁迫处理的中国沙棘叶片使用冷冻干燥机（上海BILON-FD80A）干燥后，使用组织捣碎机（常州，JTLIANGYHOU-JJ-2）粉碎，过80目筛，石油醚脱脂后使用王树林（2008）的方法提取黄酮类两次，合并提取液，第一次使用50%乙醇（物料比1∶10）在70℃下回流2.0 h，第二次使用50%乙醇（物料比1∶8）在70℃下回流1.5 h。黄酮类化合物的含量用紫外分光光度计[型号DR6000，美国哈希公司（HACH）]进行测定，本应测量280 nm处原花色素含量，而该方法只适应纯度较高的原花色素溶液，因为儿茶素在此波长有最大吸收，所以测量510 nm处总黄酮含量，使用冯智鹏等（2017）的方法通过芦丁标准品（中国药品生物制品鉴定所）制作标准曲线。
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1.8 数据统计分析
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荧光定量使用2-ΔΔCt法计算各个样本HrANR基因的相对表达量，黄酮类提取使用Excel建立标准曲线，并使用Microsoft Excel 2010和SPSS 22进行数据的统计分析，图表利用Sigmaplot 14.0制作。
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2 结果与分析
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2.1 HrANR基因的克隆及序列分析
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以中国沙棘叶的总RNA经反转录合成的cDNA为模板，以HrANR-F、HrANR-R为引物进行PCR扩增，得到了单一条带的扩增结果（图1）。对扩增得到的基因测序后得到HrANR基因的序列，采用DNAMAN分析表明其ORF长度为1 017 bp。
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2.2 编码氨基酸序列分析及编码蛋白生物信息学分析
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HrANR基因编码338个氨基酸，其中Leu数量最多（10.1%），Trp数量最少（0.9%）；其中带负电荷氨基酸残基（Asp + Glu）共38个，带正电荷氨基酸残基（Arg + Lys）有35个；编码蛋白分子量为36 660.19 Da，理论等电点（pI）为6.03，为亲水性蛋白（图2），其中194位的异亮氨酸疏水性最强（2.178），而43位的谷氨酸亲水性最强（-2.633）。使用Predict protein预测中国沙棘HrANR蛋白，结果表明该蛋白亚细胞定位在细胞质中，二级结构预测发现，该基因编码蛋白中α-螺旋占40.83%，无规则卷曲占37.57%，延伸链占14.20%，β-折叠为7.40%（图3），因此说明α-螺旋和无规则卷曲是HrANR蛋白二级结构的主要构象单元。由图4 Swiss model预测的中国沙棘HrANR蛋白的三维结构模型可知，预测结果与二级结构预测一致。根据SignalP 5.0对HrANR蛋白信号肽的预测结果可知，该蛋白信号肽存在的可能性为0.15%，说明中国沙棘HrANR蛋白不存在信号肽，属于非分泌蛋白。利用TMHMM进行中国沙棘HrANR蛋白跨膜区的预测，结果表明其无跨膜结构，这与亚细胞定位结果中该蛋白定位于细胞质的结果一致。
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图1 HrANR基因PCR扩增电泳图
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Fig.1 PCR amplification electrophoretogram of HrANR gene
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2.3 HRANR同源蛋白的同源性及系统进化树
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通过NCBI查找到11个与HrANR蛋白同源 [12，中国沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis）]的序列，即香椿（Toona sinensis，1，QWB49502.1）、荔枝（Litchi chinensis，2，QRV61380.1）、巴西海岛棉（Gossypium barbadense，3，ALF38091.1）、乌苏里杨（Populus ussuriensis，4，UNN46810.1）、药蜀葵（Althaea officinalis，5，UOI87834.1）、龙眼（Dimocarpus longan，6，QRV61373.1）、可可（Theobroma cacao，7，ADD51354.1）、杧果（Mangifera indica，8，AXN94092.1）、越橘（Vaccinium corymbosum，9，AYC35398.1）、葡萄（Vitis bellula，10，AFG28175.1）、银杏（Ginkgo biloba，11，AAU95082.1）。对上述植物的ANR氨基酸序列进行多重比对（图5）、分析序列同源性（图6），并绘制NJ系统进化树（图7）。使用DNAMAN软件对多重序列快速比对，结果表明其序列一致性达83.36%，Megalin多重序列间单链一致性在57.7%~97.0%之间，其中香椿与中国沙棘HrANR编码蛋白一致性最高，达84.2%，与银杏差异性最大，达54.1%。从系统进化树关系上看，12个物种聚为两大类4个分支，其中中国沙棘与被子植物聚为一类，裸子植物银杏单独一簇，与图6差异性关系相符且符合进化规律；另外，无患子科荔枝与龙眼聚为一组，锦葵科药蜀葵和巴西海岛棉聚为一组。以上表明ANR蛋白具有明显的科属特性。
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图2 HrANR蛋白的亲/疏水性预测
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Fig.2 Prediction of hydrophobicity or hydrophilia of HrANR protein
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图3 HrANR蛋白二级结构预测
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Fig.3 Prediction of secondary structure of HrANR protein
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图4 HrANR蛋白三级结构预测
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Fig.4 Prediction of tertiary structure of HrANR protein
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2.4 HrANR基因的表达量分析
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对不同程度干旱胁迫下的中国沙棘的根、茎、叶分别进行qRT-PCR以检测HrANR基因的表达情况。由图8可知，中国沙棘根中HrANR基因表达量呈先上升后下降的趋势，在DS2时达到最小值，而后增加的趋势，复水后表达量继续上升并达到最大值；随着干旱的加剧，茎中HrANR基因表达量呈持续下降的趋势，复水后也未能恢复并继续下降；叶中HrANR基因表达量呈胁迫初期上升而后在重度胁迫以及复水后均持续下降的趋势。方差分析表明中国沙棘不同干旱胁迫处理的根、茎、叶中HrANR基因的表达差异极显著（P＜0.01）。
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2.5 不同胁迫下中国沙棘叶中的黄酮类含量
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将不同胁迫程度的两次叶片提取液合并后，吸取5 mL提取液稀释5倍后与芦丁标准液（标准曲线y=0.410 8x-0.003 3（R2=0.998 6）通过紫外分光光度计在510 nm处比对，测定黄酮类化合物含量，结果见图9。由图9可知，在胁迫前期叶片中黄酮类含量逐渐上升，在DS2达到峰值（3.38 mg·mL-1），在DS3中略有下降，而复水后又上升至最大值（3.98 mg·mL-1），不同胁迫程度下中国沙棘叶中黄酮类含量的变化差异极显著（P＜0.01）。图8和图9中HrANR基因在叶中的表达模式和黄酮类含量累积的趋势并不一致，通过SPSS分析，HrANR基因的叶表达量、茎表达量和黄酮类含量呈负相关关系（皮尔森相关系数：P叶=-0.751，P茎=-0.934），根表达量与黄酮类含量呈正相关关系（P根=0.444）。
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图5 HrANR氨基酸同源序列多重比对
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Fig.5 Multiple alignment of amino acid homology sequence of HrANR
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图6 多重序列一致性及差异性比对
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Fig.6 Alignment of percent identity and divergence of multiple sequence
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3 讨论与结论
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干旱胁迫影响植物的生长发育，为了适应胁迫，植株会迅速做出一系列生理生化响应以避免细胞器受损。研究表明胁迫下植株的机体防御、信号传递、生长发育均与次生代谢产物相关（Shao et al.，2009），其中ANR基因通过编码原花色素生物合成途径的酶而直接影响生物体总黄酮含量的变化，从而响应胁迫。中国沙棘作为药用沙棘的主要来源，其叶中含有大量的黄酮类物质，不仅具有极高的药用价值，同时高黄酮含量对中国沙棘应对干旱等逆境胁迫具有重要的作用（Li et al.，2022）。研究干旱胁迫下ANR基因的表达情况及其与黄酮类物质累积的关系，不仅有助于阐明中国沙棘抗旱分子机制，还可应用于生产实际，通过环境调控直接影响中国沙棘叶中ANR基因的表达，以达到控制沙棘叶片黄酮产量，可为开辟沙棘高黄酮类含量植株定向培育提供新的途径。
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蛋白质的结构决定其功能，本研究发现中国沙棘HrANR蛋白与杉木（王培等，2019）一样，是不具有信号肽和跨膜结构、定位于细胞质中的亲水性蛋白，二级结构与红花（鲁丹丹等，2022）、笃斯越橘（宋冰雪等，2017）相似，均以α螺旋和无规则卷曲为主；同源多重序列比较发现与香椿同源性最高，说明亲缘性最近，推测其蛋白结构和功能更相近，并且NJ进化树中12个物种存在明显种属特性，在分支内平行进化，符合形态学分类结果（中国植物志编辑委员会，1983）。
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图7 HrANR编码蛋白的系统进化树
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Fig.7 Phylogenetic tree of HrANR-encoded proteins
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马敬等（2012）发现在花生不同组织中ANR基因表达量会有所差异；鲁丹丹等（2022）对红花中ANR基因的研究表明其表达量在根和茎中较低；朱灿灿等（2010）在银杏中发现随着干旱时间的延长其体内ANR基因的表达量波动变化，但总体是增加的趋势；鲁晓翔（2012）认为一定范围内，植物的抗氧化性与ANR基因表达量成正比。本研究中HrANR基因在干旱胁迫的中国沙棘根茎叶中的表达趋势呈不同趋势，其中在叶中呈先上升后下降的趋势，茎中则随着干旱胁迫的加剧持续下降，而在根中则为先升后降而后持续上升的波动趋势，表明在胁迫过程中HrANR基因的表达对于干旱胁迫是一个动态适应过程，ANR基因与中国沙棘应对干旱胁迫关系密切。
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黄酮类物质包括黄烷酮、儿茶素和花青素（Leonard et al.，2006），黄酮类化合物本身具有抗氧化性，干旱可以诱导植物体内黄酮类化合物的累积从而提高植物的耐旱性以使其适应环境（Foyer et al.，2010），表明黄酮类物质对植物的应激和抗逆性具有重要作用。已有研究发现马铃薯（Watkinson et al.，2006）和淫羊藿（石进校等，2004）的抗旱性均与黄酮类含量明显相关，其中研究表明花青素抗氧化性远高于VC、VE和β胡萝卜素（鲁晓翔，2012）。Li等（2022）研究发现ANR基因的过表达可以促进花青素的累积，从而提高植物的抗旱能力。在本研究中，干旱胁迫初期叶黄酮类含量与干旱胁迫呈正相关，而HrANR基因的表达与之对应，呈上升趋势，在严重胁迫下二者与干旱胁迫均呈负相关，说明在一定程度的干旱胁迫下，中国沙棘可通过HrANR基因等黄酮类合成相关基因的表达以累积黄酮类来加强氧自由基的清除能力从而对胁迫进行响应，与孟庆华等（2012）的研究结果一致。而当干旱持续一定的时间后，胁迫程度可能已超过中国沙棘自身干旱胁迫承受能力，严重的胁迫使毒害物质含量增加，使中国沙棘生长受到严重影响，各种保护物质的合成亦受到了抑制。同时在变化趋势上，叶片中HrANR基因在第6天开始呈下降趋势，而黄酮类含量下降则有延迟（在胁迫第9天时开始呈下降的趋势）。复水后中国沙棘叶中黄酮类含量与HrANR基因的表达情况相反，其中黄酮类含量在复水后急剧上升，而HrANR基因在叶中的表达仍然呈下降的趋势，与之相反，中国沙棘根中HrANR基因的表达在复水后则呈急剧上升的趋势，推测由于复水时间较短，中国沙棘根系吸收的水分先满足根系自身的需要，地上部分依旧处于缺水状态，而根系中通过HrANR基因等更多的表达而合成大量的黄酮类物质被运输至叶片发挥作用，从而使叶片中黄酮类含量上升。上述结果表明，中国沙棘HrANR基因及黄酮类含量变化与其抗旱性密切相关。
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图8 中国沙棘HrANR基因在干旱胁迫下的表达模式
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Fig.8 Expression patterns of HrANR gene of sea buckthorn under drought stresses
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图9 干旱胁迫下中国沙棘叶片黄酮类含量
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Fig.9 Flavonoid contents of sea buckthorn leaves under drought stresses
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基因表达量是基于转录水平的，而RNA很不稳定，尤其是在重度胁迫下（本研究中干旱胁迫第6天和第9天），其半衰期更短、更易降解，而基因的表达产物较稳定（杨荣武，2017），因而在基因表达量下降时表达产物依然能够因为持续的累积而保持上升的趋势，从而持续发挥抗旱功能，这可能是本研究中中国沙棘中黄酮类含量与ANR基因表达不一致的原因之一。另外，植物通过筛管自上而下运输有机物，在本研究中，干旱胁迫第9天根中HrANR基因的表达量急剧上升且在复水后持续呈上升趋势，致使根系不断累积黄酮类物质，而根系中合成的黄酮类物质通过筛管运输至叶片，这可能是导致叶片中黄酮类含量与HrANR基因的表达在复水后不一致的另一主要原因。
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目前，国内外对于沙棘干旱胁迫相关基因的研究较多，但多针对于ABA信号转导途径、CA2+信号途径、MAPK蛋白激酶途径等，对于次生代谢产物与抗旱性之间相关性的研究仅有孙坤等（2015）对肋果沙棘的研究。为进一步明确HrANR基因与中国沙棘抗旱性的关系，有必要对干旱胁迫下其他黄酮类合成相关基因的表达量与黄酮类含量的关系进行综合评估，同时通过转基因手段获得过表达植株研究HrANR基因的抗旱功能，为中国沙棘抗旱机理的阐明提供依据。
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摘要
花青素还原酶（anthocyanidin reductase, ANR）是合成黄酮类物质的关键酶之一，为明确其编码基因结构及干旱胁迫下的表达模式和黄酮类物质含量及二者之间的相关性，该文从中国沙棘转录组数据中筛选获得1个ANR基因，命名为HrANR基因。采用生物信息学软件对基因序列及编码蛋白进行分析，并对不同胁迫下各组织中HrANR基因的表达量和叶中黄酮类化合物含量进行相关性分析。结果表明：（1）中国沙棘HrANR基因ORF为1017 bp，编码338个氨基酸，为稳定的亲水性蛋白，其ANR同源蛋白具有明显的科属特性。（2）干旱胁迫下HrANR基因在中国沙棘根、茎、叶中均有表达，但表达趋势不同，其中在根中的表达呈先升高后降低再升高的趋势，在茎中呈持续下降的趋势，在叶中呈先升高后持续降低的趋势。（3）通过芦丁标准曲线获得不同胁迫程度下中国沙棘叶内黄酮类的含量，表明黄酮类含量呈先持续上升，随后略有下降，复水后上升至最高点的变化趋势，表明干旱胁迫初期叶黄酮类含量与干旱胁迫呈正相关，在严重胁迫下黄酮类含量与胁迫呈负相关。（4）叶和茎的HrANR基因表达量与黄酮类含量呈负相关（P叶=-0.751，P茎=-0.934），根中呈正相关（P根=0.444）。综上表明，中国沙棘HrANR基因的表达及黄酮类含量变化与其抗旱性密切相关，其结果为中国沙棘抗旱机制的阐明提供了依据。
Abstract
Anthocyanidin reductase is one of the key enzyme involved in the synthesis of flavonoids. In order to explore the structure of ANR gene, ANR enzyme expression pattern and flavonoid content under drought stress and their correlation, a HrANR gene identified from RNA-seq data of sea buckthorn was screened and analyzed by bioinformatics soft, the expression patterns of HrANR gene in different tissues and of flavonoid contents in leaves were performed. The results were as follows: (1) The ORF of HrANR gene was 1017 bp, which encoded 338 amino acids. It was a stable hydrophilic protein, and the homologous protein had significant family and genus characteristics. (2) HrANR gene was expressed in roots, stems and leaves of sea buckthorn under drought stress, but the expression trends were different, with an increase followed by a decrease and then an increase in roots, a continuous decrease in stems, and an increase followed by a continuous decrease in leaves. (3) The flavonoid contents in leaves of sea buckthorn under different levels of stress showed a trend that first increased continuously and then decreased slightly, increased to the highest point after rehydration. The above results indicated that the expression of HrANR gene and the changes of flavonoid content were closely related to the drought resistance of sea buckthorn. The flavonoid content in leaves was positively correlated with drought stress at the beginning of drought stress and negatively correlated with drought stress under severe stress. (4) Leaf expression, stem expression and flavonoid content of HrANR gene were negatively correlated (Pleaf= -0.751, Pstem= -0.934) and root expression was positively correlated with flavonoid content (Proot= 0.444). The above results indicate that the expression of HrANR genes and changes of flavonoid content in sea buckthorn are closely related to drought resistance, and it provides a reference for elucidating the drought resistance mechanism of sea buckthorn.
