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作者简介:

张世鑫(1986-),博士,副研究员,主要从事橡胶树乳管发育和分子育种研究,(E-mail)zhangshixin_1@163.com。

通讯作者:

田维敏,博士,教授,博士生导师,主要从事橡胶树分子育种研究,(E-mail)wmtian@163.com

中图分类号:Q943

文献标识码:A

文章编号:1000-3142(2024)02-0245-12

DOI:10.11931/guihaia.gxzw202303052

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目录contents

    摘要

    次生乳管是天然橡胶合成和贮存的场所,是由橡胶树树干树皮中维管形成层细胞分裂分化而来。次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,而这些乳管的数量取决于形成层分化次生乳管的频率(乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标。前期研究中,我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)能诱导橡胶树乳管分化且组蛋白去乙酰化酶基因(HbHDA6)能够参与橡胶树乳管分化调控。由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制尚未阐明,因此该文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化产生次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以HbHDA6基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,确定与HbHDA6相互作用的蛋白。结果表明:(1)利用Gateway技术构建的均一化COR诱导橡胶树形成层组织的酵母双杂交cDNA文库,初级文库的容量为6.34×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.27×107,文库重组率为100%;次级文库的容量为7.72×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.54×107,文库重组率为100%。初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为1.1 kb和1.2 kb。(2)成功构建了筛选 HbHDA6互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6诱饵载体,并确认无自激活活性。(3)使用该诱饵载体对构建的酵母双杂交cDNA文库进行筛选,并通过NCBI_BLAST比对和去除重复以后,获得了22个与HbHDA6发生互作的蛋白,包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6等。该研究成果为解析组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的分子机制提供了理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供了候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供了新线索。

    Abstract

    The secondary laticifer is the position for synthesis and storage of natural rubber (NR), which is differentiated from the vascular cambium cells of bark in stem of rubber trees (Hevea brasiliensis). The quantity of secondary laticifer is depended on the frequency of the secondary laticifer differentiation from cambia, which is the main index of yield breeding of rubber tree. In previous studies, we found trichostatin A (TSA), an inhibitor of histone deacetylase (HDA), can also induce laticifer differentiation, and the histone deacetylase gene (HbHDA6) is a participator in laticifer differentiation. Because of the molecular mechanism of secondary laticifer differentiation regulated by histone acetylation has not been clarified. Therefore, we construct a yeast two-hybrid cDNA library used the vascular cambium tissues treatment by coronatine (COR), and screening the yeast two-hybrid library by HbHDA6 gene as the bait, for determining the proteins interacting with HbHDA6. The results were as follows: (1) The homogenized yeast two-hybrid cDNA library of vascular cambium was constructed by the technology of Gateway. The capacity of the primary library was 6.34 × 106 CFU·mL-1, the total number of clones was 1.27 × 107, and the capacity of secondary library was 7.72 × 106 CFU·mL-1, the total number of clones was 1.54 × 107, and the recombination rates of two libraries were 100%. The average length of inserted fragments was 1.1 kb and 1.2 kb in primary and secondary library, respectively. (2) The bait vector of pGBKT7-HbHDA6 for screening the proteins interacting with HbHDA6 was successfully constructed and confirmed no self-activation activity. (3) The pGBKT7-HbHDA6 bait vector was used to screen the constructed yeast two-hybrid cDNA library, and 22 proteins interacting with HbHDA6 were obtained by NCBI_BLAST comparison and removing duplicates, including CLP1, ERF3, ERF4, HSP82, LARP6a, APT5, PP2A, APT5, FBA6, etc. The results provide a theoretical basis for analyzing the molecular regulatory network of the secondary laticifer differentiation of rubber tree, and provide candidate genes for the rubber production potential of genetically modified and a new clue for the genetic improvement and breeding of high-performance NR.

  • 天然橡胶是关系国民生计的重要工业原料和战略物资,世界所需的天然橡胶主要来自巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)(田维敏等,2015)。橡胶树树干树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所,是由维管形成层纺锤状原始细胞分化而来(Gomez,1982;Hao &Wu,2000;Chao et al.,2023)。随着形成层分化的次生乳管不断向外推移,要经过幼嫩—成熟—衰老—死亡,为维持产胶部位的乳管数量,需要形成层不断分化出新的次生乳管。这些次生乳管的数量与天然橡胶产量直接相关,次生乳管数量取决于维管形成层分化次生乳管的频率(即次生乳管分化能力),是橡胶树产量育种的主要指标(田维敏等,2015; Chao et al.,2023)。前期研究中,我们团队发现外施茉莉酸(jasmonic,JA)及其前体亚麻酸(linolenic acid,LA)能诱导形成层细胞分化成次生乳管(Hao &Wu,2000; 刘惠芳等,2001; Tian et al.,2003);我们后续又发现与JA的活性形式JA-Ile结构相似的冠菌素(coronatine,COR)(Ichihara et al.,1977),在诱导橡胶树次生乳管分化的效应方面比茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)更好(张世鑫等,2011;Zhang &Tian, 2015),并建立了一种稳定的COR诱导橡胶树萌条次生乳管分化的实验系统(Zhang &Tian,2015; Zhang et al.,2015,2016; Wu et al.,2016,2023; 张世鑫等,2018)。最近,我们发现组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDA)的抑制剂——曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)也能诱导橡胶树次生乳管分化(Zhang et al.,2016),使用COR处理能够显著提高形成层区的组蛋白乙酰化程度且HDA活性和含量也受影响。基于这些工作基础,以及组蛋白乙酰化修饰作为基因转录调控的重要方式,我们推测JA诱导橡胶树次生乳管分化,可能是通过组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化相关基因的转录而实现的。

  • 酵母双杂交技术(yeast two-hybrid technology)是研究蛋白质相互作用的经典技术之一,是由Fields和 Song等人在研究真核生物基因转录调控中提出并初步建立的(Fields,1993)。随着分子生物学的发展,在酵母双杂交的基础上又建立了酵母单杂交、膜体系酵母双杂交、酵母三杂交等多项技术,用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA/RNA/配体之间相互作用的研究,在功能基因组学和互作组学研究中发挥重要作用。利用酵母双杂交系统能够快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用,并能寻找、分离与已知蛋白相互作用的配体,在研究抗原和抗体相互作用、发现新的蛋白质和发现蛋白质的新功能、筛选药物作用位点及药物对蛋白互作影响、建立基因组蛋白连锁图等方面应用广泛。与Pull down技术、凝胶阻滞技术(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance,SPR)等体外的蛋白质相互作用的研究技术相比,酵母双杂交技术能够更好地模拟细胞内的环境,可以更真实地反映蛋白质之间的相互作用情况(Phizicky &Fields,1995)。酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识,真核生物中基因转录需要反式转录激活因子的参与,真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域,即DNA结合结构域(binding domain,BD)和DNA转录激活结构域(activation domain,AD),这两个结构域能够独立分开且功能相互不影响。BD和AD分别单独起作用时,是不能激活转录反应的,只有当BD和AD两者在空间上充分接近时,才能发挥完整的转录激活因子活性,促使下游基因的转录。酵母双杂交技术的这种特点使其成为了鉴定与已知蛋白发生相互作用的未知蛋白质的常用实验技术,并且在解析蛋白与蛋白间的分子调控网络中起着重要作用(Paiano et al.,2019)。

  • 酵母双杂交cDNA文库构建技术在橡胶树分子生物学研究中也有广泛的应用,如巴西橡胶树胶乳酵母双杂交cDNA表达文库(杨子平等,2013)、巴西橡胶树胶乳均一化酵母双杂交cDNA文库(余海洋等,2016)、橡胶叶片和胶乳的cDNA文库(欧阳沫等,2016)、巴西橡胶树地上部地下部均一化酵母双杂交cDNA文库(陈洪举等,2017)、橡胶树未开割树和开割树胶乳的酵母双杂交cDNA文库(晁金泉等,2021)、橡胶树膜系统酵母双杂交cDNA文库(聂智毅等,2022)等。由于组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树乳管分化的分子机制尚未阐明,而酵母双杂交文库构建和文库筛选能够获得大量的蛋白质相互作用信息,因此使用该技术构建橡胶树次生乳管分化分子调控网络具有显著的优势。本文使用冠菌素(COR)诱导橡胶树形成层分化次生乳管的实验系统,以分离形成层组织为材料,构建酵母双杂交cDNA文库,以HbHDA6基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库,筛选与HbHDA6相互作用的蛋白。旨在通过酵母双杂交技术筛选出组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的基因或转录因子,为解析橡胶树次生乳管分化的分子调控网络提供理论基础,为转基因改良橡胶树的产胶潜力提供候选基因,为高性能天然橡胶遗传改良育种提供新线索。

  • 1 材料与方法

  • 1.1 材料

  • 植物材料为巴西橡胶树无性系热研7-33-97的一年生萌条,种植在中国热带农业科学院橡胶研究所的五队增殖苗圃内,这些萌条每年都经过锯杆,并通过基部的潜伏芽重新生长新的萌条,并在一年内生长5~6个伸长单位(extension unit,EU)(张世鑫等,2011)。

  • 主要试剂和耗材:RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP204)、质粒小提试剂盒(DP103)、酵母质粒提取试剂盒(DP112)[购于天根生化科技(北京)有限公司];mRNA分离及cDNA建库使用的试剂,即FastTrack® MAG mRNA isolation Kit(K158002)、LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix(11791-020)、UltraPureTM Phenol∶Chloroform∶Isoamyl Alcohol(25∶24∶1,V/V/V)(15593-031)、5 M Ammonium Acetate(AM9070G)、PureLink® HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(K2100-15)、ElectroMAXTM DH10BTM T1 Phage Resistant Cells(12033-015),以上均购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;Carrier DNA、培养基YPDA、培养基YPD plus、SD/Trp、SD/Leu、SD/His/Leu/Trp(TDO)、SD/Ade/His/Leu/Trp(QDO)、Aureobasidin A、X-α-Gal均购自Clontech公司;FastPfu DNA Polymerase(AP221-01)购于北京全式金生物技术股份有限公司;冠菌素(coronatine,COR)、DMSO、乙酰丁香酮(acetosyringone)、MES、MgCl2、PEG、TE、LiAc等试剂均购于Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯,枪头和离心管均为Axygen公司产品。

  • 1.2 冠菌素(COR)处理植物材料

  • 选取一年生橡胶树萌条的第三伸长单位(EU3),节间长且健壮的树干作为实验材料,在EU3树干中部,使用单面刀片刮去面积为2 cm ×4 cm的茎表皮及部分皮层,用面积略大的灭菌无尘纸包裹处理部位,施加含有6 μg·mL-1的COR溶液,用塑料封口膜缠绕并密封包裹。处理时间分别为0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、1 d、2 d和3 d。然后拆去塑料封口膜和无尘纸,切取处理部位的树皮(带部分木质部),并立即分割成小块,置于2 mL离心管中,液氮速冻。每个时间点的形成层区样品取自5株橡胶树萌条进行混合,并且每个时间点进行3组生物学重复,即每个时间点的共计处理15株橡胶树萌条。

  • 1.3 总RNA提取及mRNA 的纯化

  • 使用冰冻切片弦切的方法收集橡胶树树皮的形成层区组织,使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根,DP441)提取总RNA。通过微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性后,合格的总RNA样品于-80℃冰箱中保存备用。将得到的不同时间段COR处理的形成层区组织总RNA进行等量混合,利用磁珠法FastTrack® MAG mRNA isolation Kit(Invitrogen,K158096)对总RNA中的mRNA进行分离纯化,将mRNA进行等量混合后,用于后续的酵母双杂交文库构建。

  • 1.4 酵母双杂交文库的构建

  • 用Gateway重组技术,使用CloneMinerTM Ⅱ cDNA文库构建试剂盒能够快速构建cDNA文库。操作流程:将分离纯化并等量混合后的mRNA为模板进行反转录,先合成cDNA第一链后合成cDNA双链,再将得到的双链cDNA进行分级分离并收集。使用LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix进行BP重组反应;使用BTX指数衰减波电穿孔仪ECM630进行电转化到大肠杆菌ElectroMAX DH10B感受态细胞中。将电转化后的菌液,在摇床里37℃、220 r·min-1活化培养1 h。培养结束后,取一部分菌液涂布平板进行初级文库容量、重组率和插入片段长度的鉴定。剩余的菌液加入甘油,至终浓度20%,于-80℃保存,即得到COR诱导橡胶树形成层组织的cDNA初级文库菌液。

  • 将上一步骤中验证合格的cDNA初级文库,使用PureLink® HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Life,K2100-15)提取文库质粒。将得到的初级文库质粒,稀释到300 ng·μL-1,使用LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix进行文库质粒重组,并提取重组产物后使用BTX指数衰减波电穿孔仪ECM630将重组产物转化到大肠杆菌ElectroMAX DH10B感受态细胞中,然后进行培养,条件同上。取转化后的10 μL菌液稀释1 000倍,再取50 μL稀释后的菌液,涂布LB平板(含链霉素抗性),37℃培养过夜。进行次级文库容量、重组率和插入片段长度的鉴定。剩余的菌液加入甘油,至终浓度20%,于-80℃保存,即得到COR诱导橡胶树形成层组织的cDNA次级文库菌液。文库的细菌菌落总数(CFU)计算方法如下:

  • CFU浓度(CFU·mL-1)=平板上的克隆数/50 μL× 1 000倍×1 000 μL;

  • 文库总CFU=CFU浓度×文库菌液总体积(mL)。

  • 1.5 HbHDA6诱饵质粒构建、鉴定及自激活检测

  • HbHDA6诱饵质粒构建时,先对含有目的基因HbHDA6的载体进行PCR扩增后,进行Sfi I酶切,获得目的基因HbHDA6的克隆片段。使用Sfi I酶切,获得线性化的酵母双杂交诱饵载体(pGBKT7),再将目的基因HbHDA6的克隆片段连接到线性化的诱饵载体(pGBKT7)上。

  • 具体操作如下:根据HbHDA6基因的cDNA序列,设计引物时分别在其两端添加Sfi I的酶切位点序列,用于扩增HbHDA6基因的cDNA片段。引物序列为HbHDA6-F(5′-aaggccattacggccATGGGCG ACACAACCGGTGGT-3′)和HbHDA6-R(5′-ccggccga ggcggccTCAAGAACGCGGATGCTCTTCTCTCT-3′)。并按照FastPfu DNA Polymerase(AP221-01)高保真酶体系进行PCR扩增,使用Sfi I进行HbHDA6扩增片段的酶切和pGBKT7载体的线性化。使用Axygen胶回收试剂盒进行酶切产物回收。将回收的酶切产物,连接转化到大肠杆菌Top10中,在37℃条件下恒温培养过夜。从上述连接体系转化平板(含链霉素抗性)上随机挑取4个大肠杆菌转化子接种于LB液体培养基,37℃、220 r·min-1条件下振荡培养16 h后,用pGBKT7载体的通用引物pGBKT7-F(5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′)和pGBKT7-R(5′-TAAGAGTCACTTTAAAATTT GTAT-3′),进行PCR扩增验证,并使用1%琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增产物的检测,对扩增得到阳性条带的克隆,进行质粒抽提(Axygen质粒小量抽提试剂盒)和测序。插入片段测序结果在比对确认正确后,进行后续实验。按照表1构建不同质粒和涂布不同类型的平板,将各种质粒转入酵母受体菌株AH109中,观察并检测结果。

  • 表1 构建酵母双杂交文库所需的载体

  • Table1 Vectors for constructing yeast two-hybrid library

  • 从pGADT7+pGBKT7-HbHDA6共转化AH109长出的酵母转化子中,随机挑取了6个菌落,进行自激活检测,包括对HIS3、ADE2和MEL1共3个报告基因的检测。对HIS3、ADE2和MEL1报告基因的检测采用点板培养的方法。将转化子点板于SD-TL+X-α-Gal和SD-TLHA平板,30℃恒温培养4 d,观察其生长状态。在预先配制好的SD-TLHA板上各涂布200 μL X-α-Gal溶液,待X-α-Gal溶液被平板培养基完全吸收后,将转化子菌液进行点板并培养。

  • 1.6 pGBKT7-HbHDA6诱饵质粒筛选酵母文库

  • 用含有测序正确pGBKT7-HbHDA6诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌来制备酵母感受态细胞。将COR处理橡胶树形成层组织的cDNA初级文库质粒转入酵母感受态细胞中,并将其涂在SD-Trp-Leu-His+5 mmol·L-1 3AT平板上并倒置培养。从SD-Trp平板挑取单克隆菌斑,接种在SD-Trp液体培养基中,在30℃、220 r·min-1条件下振荡培养18 h,再转接到YPDA培养基中培养,使用紫外分光光度计,测定菌液测定初始浓度为OD600=0.2;在30℃、220 r·min-1条件下振荡培养4~5 h,中途使用紫外分光光度计测定菌液的浓度,当菌液浓度达到OD600=0.6即停止培养。将菌液离心并弃上清,重悬菌体。按照加入试剂的体积从大到小,依次加入9.6 mL的50% PEG3350,1.44 mL的1 mol·L-1 LiAc,300 μL的ssDNA(10 mg·mL-1),以及25 μg的文库质粒DNA,并混匀体系。在30℃条件下水浴孵育30 min后,在42℃条件下水浴热激25 min,在30℃条件下水浴复苏1 h,将复苏后的菌液离心并重悬菌体。从重悬菌液中取20 μL酵母培养物经梯度稀释后,分别涂在3块SD-TL平板上,用于酵母文库的转化效率检测。剩余的酵母培养物涂在SD-TLH + 5 mmol·L-1 3AT平板上,每块平板涂200 μL,共涂40块平板。在30℃条件下恒温倒置培养3~4 d,观察并记录转化结果,分析转化效率。

  • 1.7 阳性克隆鉴定和测序分析

  • 在pGBKT7-HbHDA6诱饵质粒筛选酵母双杂交文库的平板中,挑取阳性克隆的单菌落,转接到SD-TL缺陷型培养基平板中,在30℃条件下恒温倒置培养2~3 d。将在SD-TL缺陷型培养基平板上长出的初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后,接种到SD-TL和SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板上,进行HIS3、ADE2和MEL1报告基因的检测,在30℃条件下恒温培养3~4 d。

  • 对HIS3、ADE2和MEL1报告基因进行检测,显示结果为阳性对照在SD-TL和SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培养基平板上都能正常生长,并且SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培养基平板上的菌落呈现蓝色;阴性对照由于不会激活HIS3和ADE2报告基因,虽然在SD-TL缺陷型培养基平板上可以正常生长,但菌落不呈现蓝色,而在缺少Histidine和Adenine这两种成分的SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培养基平板上不能生长。因此,初始阳性克隆能在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培养基平板上生长并使菌落呈现蓝色,表明同时激活了HIS3、ADE2和MEL1 3个报告基因。

  • 为了鉴定筛选到的阳性克隆的基因信息,将上述阳性克隆的菌株,分别接种于SD-TL缺陷型液体培养基中,在30℃、220 r·min-1条件下振荡培养16 h。使用酵母质粒提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司,DP112]提取并纯化出酵母质粒。将提取纯化好的酵母质粒转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中进行扩增,在37℃、220 r·min-1条件下振荡培养16 h,使用大肠杆菌质粒小提试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司,DP103]提取大肠杆菌质粒后并送样至生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将DNA测序结果与NCBI_GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析,获得与HbHDA6发生相互作用的基因信息。

  • 2 结果与分析

  • 2.1 橡胶树树皮的形成层区组织分离、总RNA提取和mRNA分离纯化

  • 使用冰冻切片弦切的方法分离COR处理的一年生橡胶树萌条树皮形成层区组织(图1:A),通过光学显微镜观察,发现冰冻切片得到橡胶树树皮的形成层组织没有杂质,并且绝大多数形成层区细胞呈长梭形且排列致密,几乎没有其他类型的细胞(图1:B)。

  • 利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)提取的形成层组织的总RNA,使用Thermo NanoDrop2 000微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度,发现总RNA的浓度较高,平均为1 642.98 ng·μL-1,A260/A280的平均值为2.11,A260/A230的平均值为2.13;经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示28S rRNA和18S rRNA条带清晰,两个条带的亮度比值约为2∶1,说明提取的总RNA没有降解(图1:C)。本实验中提取的COR不同时间段处理橡胶树形成层组织的总RNA质量较好,可用于后续的实验。

  • 将8个时间点的COR处理形成层区组织总RNA进行等量混合后,利用磁珠法FastTrack® MAG mRNA isolation Kit(Invitrogen,K158096)对总RNA中的mRNA进行分离纯化,得到的mRNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示分化纯化的mRNA呈弥散的条带且均匀分布(图1:D),表明分离纯化得到的mRNA质量较好,可用于后续的实验。

  • 2.2 cDNA初级文库和次级文库的构建和鉴定

  • 将COR处理橡胶树形成层区组织的cDNA初级文库菌液涂板并培养后(图2:A),进行cDNA初级文库容量、重组率和插入片段长度的鉴定。结果表明,cDNA初级文库转化平板的容量(平板稀释度为1∶1 000)=317/50 μL×1 000×1 000 μL=6.34×106 CFU·mL-1,高于文库构建的实验要求1×106 CFU·mL-1;总克隆数为6.34×106 CFU·mL-1×2 mL≈1.27×107,也高于文库构建标准1×107。并对cDNA初级文库的菌斑进行检测,随机调取24个菌斑进行PCR鉴定,发现插入效率为100%,插入片段长度分布于0.6~1.2 kb之间,平均插入片段长度为1.1 kb(图2:C)。

  • 将COR处理橡胶树形成层区组织的cDNA次级文库菌液涂板并培养后(图2:B),进行cDNA次级文库容量、重组率和插入片段长度的鉴定。结果表明,cDNA次级文库转化平板的容量(平板稀释度1∶1 000)=386/50 μL×1 000×1 000 μL=7.72×106 CFU·mL-1,高于文库构建的实验要求1×106 CFU·mL-1;总克隆数为7.72×106 CFU·mL-1×2 mL≈1.54×107,也高于文库构建标准1×107。并cDNA次级文库的菌斑进行检测,随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定,发现插入效率为100%,插入片段长度分布于1.0~1.6 kb之间,平均插入片段长度为1.2 kb(图2:D)。

  • 综上所述,本研究构建的COR处理橡胶树萌条树皮形成层区组织的酵母双杂交cDNA文库质量较好,可用于后续的HbHDA6互作蛋白的筛选和鉴定实验。

  • 2.3 HbHDA6诱饵质粒构建、鉴定及自激活检测

  • 将含有HbHDA6基因的载体进行PCR扩增,获得了约1.7 kb的条带(图3:A),经过与目的基因的DNA序列进行测序比对,显示为HbHDA6的编码框。经过Sfi I酶切,获得该目的基因HbHDA6的克隆片段,并与Sfi I酶切的线性化酵母双杂交诱饵载体质粒pGBKT7载体进行连接,获得酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-HbHDA6。经过菌落PCR检测,发现条带大小均为1.7 kb(图3:B),并且测序结果显示目的基因的DNA序列比对正确,可进行后续的诱饵质粒的自激活检测实验。

  • 图1 橡胶树萌条树皮形成层组织分离、总RNA提取和mRNA纯化

  • Fig.1 Cambium tissue isolation, total RNA extraction, and mRNA purification of rubber short barks

  • 通过自激活检测实验发现对照菌株在SD-TL缺陷型平板上都能正常生长,而仅有阳性对照pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53可在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板生长。然而,在含有目的基因的pGADT7+pGBKT7-HDA6转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板上均不能生长,生长状态同阴性对照pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC一样,MEL1检测中结果也与阴性对照相同,因此不存在自激活(图3:C)。

  • 将COR处理橡胶树萌条树皮形成层区组织的酵母双杂交cDNA文库质粒转入,用含有正确pGBKT7-HDA6诱饵质粒的AH109酵母转化子作为受体菌来制备感受态细胞,从中取20 μL酵母培养物经梯度稀释后,分别涂3块SD-TL平板来检测文库转化效率(图3:D)。对平板的菌斑进行计数,结果显示HbHDA6基因筛选文库的转化子总数为(3 978/20+2 038/2+286/0.2)×1/3×8 000≈7.06×106,转化效率为7.06×106/25·μg-1≈2.82×105·μg-1

  • 图2 cDNA初级文库、次级文库的平板生长情况和插入片段的PCR检测图

  • Fig.2 Growth of cDNA primary library, secondary library and PCR detection diagrams of inserted fragments

  • HIS3、ADE2和MEL1报告基因的检测结果显示,阳性对照在SD-TL+X-α-Gal和SD-TLHA缺陷型培养基上都能正常生长,并使菌落呈蓝色,而阴性对照由于不会激活HIS3和ADE2报告基因,在SD-TL缺陷型培养基上可以正常生长但菌落不显蓝色,而在缺少Histidine和Adenine这两种成分的SD-TLHA培养基平板上不能生长。因此,本文获得的24个初始阳性克隆,能在SD-TLHA生长并使菌落显蓝色,表明同时都激活了HIS3、ADE2和MEL1报告基因(图3:E)。

  • 图3 HbHDA6诱饵质粒构建、鉴定及自激活检测图

  • Fig.3 Construction, identification, and self-activation detection diagrams of HbHDA6 bait plasmid

  • 2.4 阳性克隆鉴定和互作蛋白分析

  • 为了鉴定pGBKT7-HDA6诱饵质粒筛选到的阳性克隆基因信息,将以上阳性克隆菌株分别接入SD-TL液体培养基中振荡培养过夜并提取纯化酵母质粒,再将抽提得到的酵母质粒转化到大肠杆菌Top10新鲜感受态细胞中进行扩增,将含有阳性克隆的Top10转化子转接LB液体培养基中扩增后抽提大肠杆菌质粒,进行DNA测序分析,并与NCBI_GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。BLAST比对结果(表2)显示,筛选到与HbHDA6基因相互作用的阳性克隆质粒DNA,去除重复外,分别属于22种蛋白编码基因。

  • 根据UniProt的蛋白信息预测,可将与HbHDA6互作的22种蛋白分为氧化还原酶、水解酶、蛋白/DNA/RNA结合、运输、异构酶、染色质调节剂和糖蛋白7个类别,其中水解酶、氧化还原酶、蛋白/DNA/RNA结合3个类别的蛋白较多。根据亚细胞定位的结果显示这22种蛋白在细胞各个部位都有分布,其中亚细胞定位在细胞膜、叶绿体、线粒体和细胞核4个类别的蛋白相对较多。

  • 3 讨论与结论

  • 从动植物组织或细胞中提取的总RNA和纯化的mRNA是构建酵母双杂交cDNA文库的起始材料,能够获得高质量的总RNA和mRNA是构建高质量酵母双杂交cDNA文库的前提(Gao et al.,2014)。本研究中的橡胶树树皮的维管形成层组织是夹在韧皮部和木质部之间,为几层至十几层形成层纺锤状细胞组成且排列精密,较难获取到完整且纯净的形成层组织。前期研究中,我们发现橡胶树萌条形成层细胞层数有明显规律,在海南岛每年春季新梢生长期(3—4月),树干的形成层区开始分裂分化活动,此时形成层的细胞层数最少(约4层)(Wu et al.,2002),而7—8月正值高温高湿环境,利于橡胶树萌条生长和维管形成层细胞分裂活动,此时形成层的细胞层数量多(10~11层)(张世鑫等,2011)。本文在7—8月时,采集萌条EU3的节间树皮样品,此时的形成层细胞量多且EU3的次生韧皮部未分化出次生乳管,能够获得量多且纯净的形成层区组织。使用冰冻切片弦切获取形成层区组织,光学镜检发现冰冻切片得到橡胶树树皮的形成层区组织没有杂质,绝大多数形成层区细胞呈长梭形且排列紧密。因此,从有限的组织材料中,也能提取出含量较高、质量较好总RNA。后续使用成熟的磁珠法技术分离纯化mRNA,获得的mRNA捕获率和成功率都很高(Albretsrn et al.,1990),保证了后续构建酵母双杂交cDNA文库研究所需的高质量总RNA和mRNA。使用mRNA反转录合成cDNA,在均一化前后都进行一轮LD-PCR,这样通过两轮的LD-PCR放大,不但能够保证在起始总RNA较少的情况下纯化收集到足够量的cDNA用于文库构建,而且能够使低丰度的基因得到增加,相应地提高了筛库筛到低丰度基因的概率(杨子平等,2013;余海洋等,2016)。

  • 对酵母双杂交cDNA文库质量评判主要从3个重要的数据来分析,分别为酵母双杂交文库的单克隆数、重组率和插入片段长度。酵母双杂交文库的单克隆数代表了构建的cDNA文库完整性和覆盖度,插入片段的长度代表了cDNA文库包含基因的完整性(Van &Beyaert,1996)。cDNA文库的单克隆是保证cDNA文库完整性和覆盖度的一个重要指标,文库单克隆数大于1×106 是文库筛选所必须的(李可琪等,2016)。一方面,本文中利用GatewayTM技术构建了茉莉酸诱导橡胶树次生乳管分化形成层组织的均一化酵母双杂交cDNA文库,初级文库容量为6.34×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.27×107,次级文库的容量为7.72×106 CFU·mL-1,总单克隆数为1.54×107,文库重组率均为100%,这些数值均要高于酵母双杂交cDNA文库构建的基本要求。另一方面,构建的酵母双杂交cDNA初级文库和次级文库的插入片段平均长度分别为1.1 kb和1.2 kb,这个数值是接近于本文使用的橡胶树热研7-33-97基因组序列中公布的CDS平均长度(Tang et al.,2016)。由此可见,本文构建的COR处理橡胶树萌条树皮形成层组织的酵母双杂交文库的单克隆数、重组率和插入片段长度均达到较高水平,满足酵母双杂交文库筛选的工作。

  • 前期研究中,本团队最早发现外施茉莉酸(JA)及其前体亚麻酸(LA)能诱导形成层细胞分化次生乳管(Hao &Wu,2000;Tian et al.,2003),与茉莉酸的活性形式JA-Ile结构相似的COR可以与COI1受体结合,激活JA信号途径(Katsir et al.,2008),其诱导橡胶树乳管分化的效应比MeJA更好(张世鑫等,2011)。据此,我们建立了一种稳定的COR诱导橡胶树萌条次生乳管分化的实验系统,在COR处理后的5 d内可以观察到诱导形成的次生乳管(Zhang &Tian,2015;Zhang et al.,2015,2016;Wu et al.,2016,2023;张世鑫等,2018)。近期我们发现组蛋白去乙酰化酶(HDA)的抑制剂——曲古抑菌素A(TSA)不但能够诱导橡胶树次生乳管分化(Zhang et al.,2016),而且COR处理能够显著提高形成层区的组蛋白乙酰化程度和HDA活性,尤其是HDA6的含量和基因表达都受COR的影响(未发表资料)。基于这些工作基础以及组蛋白乙酰化修饰作为基因表达调控的重要方式,本文构建了COR处理橡胶树萌条树皮形成层组织的酵母双杂交文库,并通过HbHDA6诱饵载体进行酵母双杂交文库筛选,共筛选到与HbHDA6基因相互作用的22种蛋白。根据UniProt的蛋白信息预测,这些蛋白可分为氧化还原酶、水解酶、蛋白/DNA/RNA结合、运输、异构酶、染色质调节剂和糖蛋白7个类别,其中水解酶、氧化还原酶、蛋白/DNA/RNA结合3种类别的蛋白较多。亚细胞定位结果,显示主要集中在细胞膜、叶绿体、线粒体和细胞核等。下一步,我们将对HbHDA6与这22个互作蛋白进行点对点酵母双杂交验证,解析这些蛋白的相互作用,为后续筛选组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生乳管分化的靶标蛋白奠定基础,为构建橡胶树次生乳管分化的分子调控网络提供理论依据。

  • 表2 与HbHDA6互作的蛋白信息

  • Table2 Information of proteins interaction with HbHDA6

  • 参考文献

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