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谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase，GST，EC 2.5.1.1.8）是一种具有多功能的超家族酶，广泛存在于生物界，主要催化还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和疏水、亲电底物共价结合形成共轭物，将生物体内潜在的有毒物质和外来的有害物质隔离在液泡或转移到质外体，从而达到解毒目的（Cummins et al.，2011；陈秀华等，2013；张雪等，2017）。根据GST家族的基因结构、氨基酸序列相似性以及催化底物等性质的不同，GST家族分为7个亚家族，分别为φ（phi，F）、τ（tau，U）、ζ（zeta，Z）、θ（theta，T）、λ（lambda，L）、脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）和四氯对苯二酚脱卤酶（tetrachlorohydroquinone dehalogenase，TCHQD），其中，φ和τ是植物所有特有的GST类型（Mohsenzadeh et al.，2011）。GST蛋白均包含N端和C端2个结构域，其中，N端为GSH特异结合位点（G位点），该位点较保守，C端包含结合疏水底物的结合位点（H位点），该位点可变性较大（邢磊等，2020）。
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目前，已从拟南芥（Mohsenzadeh et al.，2011）、油菜（Wei et al.，2019）、石榴（刘龙博等，2021）等多个物种中分离鉴定了GST基因，其功能主要体现在以下三个方面：（1）催化GSH与有毒异源物质或氧化产物结合，促进其代谢、隔离或清除，从而降低有毒物质对细胞伤害（陈秀华等，2013）；（2）参与调控植物对盐胁迫、重金属胁迫等非生物胁迫条件下的抗逆能力（Lallement et al.，2014；邢磊等，2020；张创娟等，2022）；（3）参与花青素等次生代谢物的跨膜运输定位（Marrs et al.，1995）。玉米Bronze-2是研究发现的第一个在花青素积累中起重要作用的GST基因（Marrs et al.，1995）。Bronze-2的同源基因，如拟南芥TT19（GSTF12）（Sun et al.，2012）、猕猴桃AcGST1（Liu et al.，2019）、棉花GhGSTF12（Shao et al.，2021）、萝卜RsGSTF12（Niu et al.，2022）等陆续被报道，表明GST基因在花青素积累中的功能是高度保守的。由此可见，GST家族成员在植物花青素积累中发挥着重要作用。
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芥菜（Brassica juncea）是十字花科芸薹属作物，为世界重要的蔬菜、油料、调料作物。在我国，芥菜可分为根、茎、叶、薹四大类16个变种（刘佩瑛，1996），除西藏等高寒山区外，芥菜在全国各地均有栽培（万正杰等，2020）。随着生活水平的日益提高与环境条件的变化，人们对芥菜品质和品种抗性提出了新要求（符梅等，2022）。培育紫色蔬菜品种对提高蔬菜的经济价值和营养价值具有重要意义。课题组以紫茎埃芥与棒菜经多代回交及自交，选育了紫薹-绿薹芥菜近等位基因系（201-402）。该文以紫薹-绿薹芥菜近等位基因系为材料，采用同源克隆方法对芥菜BjGSTF12基因及启动子进行克隆，通过生物信息学软件对其编码的蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析、启动子序列的顺式作用元件分析，并分析其在紫薹、绿薹近等位基因系芥菜中的表达情况及其花青素含量之间的关系，拟探讨以下问题：（1）BjGSTF12基因及启动子序列在紫薹芥菜和绿薹芥菜中是否存在差异；（2）紫薹、绿薹芥菜薹茎花青素含量分析，BjGSTF12基因在紫茎芥菜和绿茎芥菜中的表达情况；（3）芥菜BjGSTF12的互作蛋白分析。本研究结果将为探究紫薹和绿薹芥菜花青素含量差异提供信息，为进一步解析BjGSTF12在芥菜薹茎花青素积累中的作用奠定基础，为芥菜种质资源的有效利用与合理保护等提供一定的理论依据。
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1 材料与方法
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1.1 材料
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供试材料为课题组选育紫薹-绿薹芥菜近等位基因系（201-402）。2022年10月至次年2月，将芥菜种植于广东省韶关市韶关学院生物与农业学院生态园连栋温室内。
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1.2 试验材料的种植和取样
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芥菜种子用7.5%的NaClO消毒10 min，用无菌水清洗4~5次，将种子播种于泥炭∶蛭石=3∶1基质中进行育苗，待芥菜幼苗长至三叶一心进行定植，统一水肥管理，在移整地时，按照每667平方米一次性施入50 kg复合肥（N-P2O5-K2为15-5-25）。移栽40 d后，待其抽薹，选取生长状态一致的紫薹芥菜、绿薹芥菜植株，取新鲜茎，撕取表皮后剪碎，液氮速冻后，保存在-80℃冰箱中备用，每个样品取3个生物重复，每个生物重复取4~6株。
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1.3 芥菜薹茎花青素含量的测定
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取0.05 g左右紫薹、绿薹芥菜表皮，切碎，放入5 mL的1%HCl甲醇溶液室温避光过夜浸提，利用UV-2600型紫外分光光度计测定波长在530 nm下的吸光值（Li et al.，2016）。
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1.4 基因组DNA、总RNA的提取及cDNA合成
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参照天根生化科技（北京）有限公司的新型基因组DNA提取试剂盒提取芥菜基因组DNA，参照普洛麦格（北京）生物技术公司的Eastep® Super植物总RNA提取试剂盒和GoScriptTM Reverse Transcription System分别提取总RNA和合成cDNA。
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1.5 基因克隆及阳性克隆鉴定
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根据十字花科基因组数据库（Brassicaceae Database）中的芥菜基因组数据Braju_tum_V2.0中的BjGSTF12基因序列（BjuVB05G21730）设计引物（表1）。
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以表1中GSTF12为引物，以紫薹芥菜薹茎DNA、cDNA样品分别为模板，克隆芥菜BjGSTF12基因。PCR产物回收扩增得到的基因产物，连接到pMD20-T载体，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过PCR鉴定后，选取阳性克隆送到广州擎科生物技术有限公司进行测序。
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1.6 生物信息学分析
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参照表2所列的生物信息学软件或网址对芥菜GSTF12基因及其编码氨基酸进行分析。
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1.7 BjGSTF12在紫薹、绿薹芥菜薹茎中的表达量分析
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根据SYBR Green® Premix Ex TaqTM进行荧光定量PCR分析，以Actin2为内参基因，使用2-ΔΔCt计算基因相对表达量（Livak &Schmittgen，2002）。
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1.8 芥菜BjGSTF12启动子的克隆与顺式作用元件分析
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以紫薹、绿薹芥菜基因组DNA为模板，以表1中GSTFpro为引物，克隆芥菜BjGSTF12启动子序列，连接pMD20-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑选阳性克隆进行测序。利用DNAMAN软件对2个品种的启动子序列进行比对，利用Plantcare网站对其启动子序列进行顺式作用元件分析，并利用TBtools对作用元件进行可视化（Chen et al.，2020）。
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1.9 统计分析与作图
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利用Microsoft Excel 2010进行数据整理，利用SPSS 19.0进行Duncan’s显著性分析，利用SigmaPlot 11.0进行作图。
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2 结果与分析
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2.1 芥菜BjGSTF12基因的克隆
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提取紫薹芥菜薹茎DNA和总RNA，将总RNA反转录为cDNA，以其为模板，利用表1中GSTF12-F/R为引物，克隆芥菜BjGSTF12基因。经过PCR扩展，获得目的条带如图1所示。测序结果显示，芥菜BjGSTF12基因的基因组序列和开放阅读框序列分别为808、651 bp。
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利用Gene Structure Display Server 2.0软件绘制芥菜BjGSTF12基因结构图。由图2可知，芥菜BjGSTF12基因序列中包含2个内含子，内含子序列分别在148~232 bp、282~353 bp之间。芥菜BjGSTF12基因全长CDS序列为651 bp，编码216个氨基酸。通过BLAST在线比对，芥菜GSTF12基因片段与甘蓝型油菜BnGSTF12（B. napus，XM_013794351）、白菜（Brassica rapa，XM_009127922.3）、拟南芥AtGSTF12（Arabidopsis thaliana，NM_121728.4）核苷酸序列的同源性分别为94%、94%和88%。因此，将该芥菜基因命名为BjGSTF12。
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2.2 芥菜BjGSTF12蛋白序列的生物信息学分析
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利用 ProtParam对芥菜BjGSTF12基因编码氨基酸序列进行分析发现，芥菜BjGSTF12基因编码216个氨基酸，分子量为24.80 kDa，原子组成为C1121H1765N297O313S12，主要由亮氨酸（Leu，11.6%）、缬氨酸（Val，9.7%）、丙氨酸（Ala，8.8%）、谷氨酸（Glu，8.8%）等氨基酸组成。该氨基酸序列的理论等电点（pI）为 5.73，平均疏水率为-0.075，脂肪酸系数为 98.38，不稳定系数为 38.30。这表明芥菜BjGSTF12为稳定性蛋白。
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图1 芥菜BjGSTF12基因的PCR产物琼脂凝胶电泳
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Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of BjGSTF12 gene from Brassica juncea
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利用NCBI网站保守结构域分析网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对芥菜BjGSTF12基因编码氨基酸进行保守结构域分析。由图3：A可知，芥菜BjGSTF12具有GST_NTERHE和GST_CTER两个结构域，保守结构域的位置为1~75、 91~207位氨基酸，1MVVKLYGQVTAACPQ RVLLCFLEKEIEFEIVHVDLDTLEQKKPEHLLRQP FGQVPAIEDGDFKLFESRAIARYYA75； 91EHRAIVD QWADVETHY FNVLAFPIVLNLVIKPRLGEECDVVL VEETKVKLEVVLDIYENRLASNRFLAGDEFTMAD LT HMPAMGHLMGTDVNRMVKARVNMNRWWEEITARP AWKKL207。由此可见，芥菜BjGSTF12具有GST-C保守结构域，属于GST基因家族成员。
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利用ExPASY ProtScale预测了芥菜BjGSTF12氨基酸序列的亲疏水性，由图3：B可知，芥菜BjGSTF12的最大正分值（2.522）位于肽链中的第116位氨基酸，最小负分值（-2.256）位于第40位氨基酸，整条肽链的亲水性氨基酸数量多于疏水性氨基酸数量。由此推测，芥菜BjGSTF12可能为亲水性蛋白。
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利用NetPhos 3.1对芥菜BjGSTF12进行了潜在磷酸化位点分析。由图3：C可知，芥菜BjGSTF12存在若干个潜在的磷酸化位点。芥菜BjGSTF12磷酸位点最多的是苏氨酸磷酸位点（threonine，Thr），为4个，酪氨酸磷酸化位点（tyrosine，Tyr）次之，为3个，丝氨酸磷酸位点（serine，Ser）最少，为1个。这说明芥菜BjGSTF12可能被苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸激酶磷酸化，从而实现其调控功能。通过SignalP 5.0预测分析芥菜BjGSTF12氨基酸序列，发现无信号肽序列，说明芥菜BjGSTF12为非分泌型蛋白。
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运用ExPASY的SOPMA对芥菜BjGSTF12的二级结构进行了分析预测。由图3：D可知，BjGSTF12蛋白含有α-螺旋（alpha helix）46.30%、延伸链（extended strand）15.28%、β-折叠（beta turn）7.41%、无规则卷曲（random coil）31.02%。由此可见，芥菜BjGSTF12蛋白的主要组成部分为α-螺旋，而延伸链、β-折叠、无规则卷曲则散布于蛋白结构中。
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利用Plant-PLoc server（www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant）预测芥菜BjGSTF12亚细胞定位发现芥菜BjGSTF12定位于细胞质中。利用TMHMM Server 2.0分析该蛋白无跨膜结构。使用SWISS-MODEL在线软件预测芥菜BjGSTF12的三级结构。由图3：E可知，芥菜BjGSTF12蛋白的主要结构为α-螺旋，延伸链、β-折叠、无规则卷曲则散分布于蛋白结构中，与二级结构预测结果一致；芥菜BjGSTF12蛋白三级结构为单体结构。
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2.3 芥菜BjGSTF12的同源性比对及系统进化分析
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将芥菜BjGSTF12与油菜BnGSTF12 （XP_048602386.1）、拟南芥AtGSTF12/AtTT19（NP_197224.1）、白菜BrGSTF12（XP_009126170.1）、萝卜RsGSTF12（XP_018444305.1）、棉花GhGSTF12（XP_016744877.2）以及猕猴桃AcGST1（PSS21435.1）等序列进行了氨基酸序列多重比对分析。由图4可知，芥菜BjGSTF12与其他物种GST氨基酸的同源性相似性介于52.07%~95.31%之间，其中，芥菜BjGSTF12与猕猴桃AcGST1的相似性最低，为52.07%，与油菜BnGSTF12相似性最高，达95.31%。
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利用MEME在线分析工具对芥菜BjGSTF12与其他物种GSTs蛋白保守结构域进行了分析。由图5可知，共获得10个保守基序，分别为Motif 1~Motif 10。在芥菜BjGSTF12与油菜、白菜、拟南芥、萝卜等物种GSTs成员中，共有6个保守基序，分别为Motif 1~Motif 6；猕猴桃AcGST1与油菜BnGSTF12还包含Motif 8和Motif 10保守基序，而猕猴桃AcGST1与棉花GhGSTF12还包含Motif 7保守基序，但其他物种的GSTs成员不含这几个基序。在7个物种的GSTs成员中，均含有Motif 1、Motif 2、Motif 4、Motif 5这4个保守基序。
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图2 芥菜BjGSTF12基因结构图
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Fig.2 Genetic structure diagram of BjGSTF12 gene from Brassica juncea
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图3 芥菜 BjGSTF12 蛋白的生物信息学分析
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Fig.3 Bioinformatic analysis of the BjGSTF12 protein from Brassica juncea
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图4 芥菜BjGSTF12蛋白与其他物种GSTs蛋白序列多重比对
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Fig.4 Multiple alignment of BjGSTF12 protein from Brassica juncea and GST proteins from other species
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为了进一步了解芥菜BjGSTF12与其他GST家族成员的进化关系，将其与50个拟南芥GST家族成员进行了进化树分析。由图6可知，拟南芥GST家族成员聚类为7个亚家族，分别为τ亚家族（28个成员）、φ亚家族（11个成员）、DHAR亚家族（3个成员）、ζ亚家族（2个成员）、θ亚家族（2个成员）、λ亚家族（2个成员）、TCHQD亚家族（1个成员）。芥菜BjGSTF12与拟南芥GSTF12先聚类在一起，后与ATGSTF11聚类在一簇，属于φ亚家族成员，而与其他亚家族成员相距较远。本研究结果再次表明，所克隆的芥菜BjGSTF12基因属于植物GST基因家族成员。
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2.4 绿薹、紫薹芥菜近等基因系花青素含量及BjGSTF12基因表达量分析
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为进一步了解芥菜BjGSTF12基因在薹茎表皮花青素合成中的作用，利用前期选育不同茎色芥菜近等位基因系（绿薹、紫薹芥菜），分析了其薹茎表皮花青素含量与BjGSTF12基因的表达情况。由图7：A、B可知，绿薹芥菜无论叶片还是薹茎、薹叶均为绿色，而紫薹芥菜叶片颜色为绿色，薹茎及幼嫩薹叶表现出明显紫色。对两种芥菜薹茎花青素含量分析表明，紫薹芥菜的花青素含量极显著高于绿薹芥菜的（P＜0.01）（图7：C）；BjGSTF12基因在绿薹芥菜中仅有微弱表达，而其在紫薹芥菜中的表达水平明显高于绿薹芥菜，二者之间差异达到极显著水平（图7：D）。比较BjGSTF12基因在绿薹芥菜和紫薹芥菜中的表达水平及其薹茎表皮花青素含量差别的结果表明，BjGSTF12在不同薹色芥菜的基因表达水平与花青素含量呈现类似的变化规律。
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图5 芥菜BjGSTF12蛋白与其他物种GSTs蛋白序列保守结构域分析
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Fig.5 Analysis of conserved domains of BjGSTF12 protein from Brassica juncea and GST proteins from other species
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2.5 芥菜BjGSTF12基因的启动子顺式作用元件预测
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从芥菜基因组数据中调取BjGSTF12翻译起始位点上游启动子序列，设计引物，分别用绿薹芥菜和紫薹芥菜基因组DNA为模板进行PCR扩增、测序，分别获得1 855、1 857 bp序列，利用DNAMAN软件进行了比对。由图8可知，两个芥菜品系的BjGSTF12启动子序列相似度为99.78%，与绿薹芥菜相比，紫薹芥菜BjGSTF12启动子在第130、1 333 bp处分别插入了1个G和1个A碱基，在第937、980 bp处的T碱基分别突变为A和G碱基。为进一步了解2个芥菜品系BjGSTF12启动子的差别，利用PlantCare在线网站预测了其作用元件，并用TBtools软件进行了可视化。由图9可知，2个品系BjGSTF12启动子序列预测的顺式作用元件相同，均含有9个真核生物转录起始核心的启动子作用元件（TATA-box）和5个启动子和增强子区域的共同顺式作用元件（CAAT-box），含有9个MYB转录因子结合位点（6个MYB作用元件、3个MYB-like sequences作用元件）、1个赤霉素响应元件（GARE作用元件）、1个厌氧诱导响应元件（ARE作用元件）、2个损伤和防御响应元件（WRE3），另外，该启动子序列还有8个未知作用元件（1个作用元件为taTAAATATct、7个作用元件为CTCC）。
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图6 芥菜BjGSTF12蛋白与50个拟南芥GSTs蛋白的进化树分析
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Fig.6 Phylogenetic tree analysis of BjGSTF12 protein from Brassica juncea and 50 GST proteins from Arabidopsis thaliana
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2.6 芥菜BjGSTF12蛋白互作关系
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利用STRING交互式数据库构建了芥菜BjGSTF12蛋白与其他蛋白的互作关系网络图，进而预测与BjGSTF12可发生互作的蛋白。选择模式植物拟南芥，构建芥菜BjGSTF12蛋白的互作关系网络图。由图10可知，芥菜BjGSTF12蛋白与二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）、查尔酮合成酶（transparent testa4/chalcone synthase，TT4/CHS）、无色花青素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）、类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase，UF3GT）、丙二酰辅酶A：花青素5-O-葡萄糖苷-6″-O-丙二酰转移酶（malonyl-CoA:anthocyanidin 5-O-glucoside-6-O-malonyltransferase，AT5MAT）、MATE转运蛋白（transparent testa12，TT12）、H+泵类型跨膜转运蛋白（autoinhibited H+-ATPase isoform 10，AHA10）、UDP-糖基转移酶超家族成员（AT4G14090）、HXXXD-型酰基转移酶家族蛋白（AT1G03495）等蛋白存在互作。其中，DFR、TT4、LDOX、UF3GT为花青素生物合成中关键酶，AT5MAT、AT4G14090、AT1G03495主要负责花青素糖基化、酰基化修饰，TT12和AHA10主要负责原花青素单体向液泡的转运。由此可见，芥菜BjGSTF12可能通过与这些互作蛋白相互作用参与花青素生物合成、修饰及转运。
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图7 不同薹色近等基因系芥菜花青素含量与BjGSTF12基因表达量情况
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Fig.7 Anthocyanin contents and expression analyses of BjGSTF12 in different stalk color near-isogenic lines of Brasscia juncea
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3 讨论与结论
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谷胱甘肽转移酶是一种多功能酶，在细胞解毒（陈秀华等，2013）、抵抗逆境胁迫（Lallement et al.，2014）、花青素等次生代谢转运（Marrs et al.，1995；Sun et al.，2012）等方面发挥重要作用。但是目前，有关芥菜GST基因的功能及其与蔬菜薹茎颜色形成之间关系的研究报道还较少。本研究从紫薹芥菜中分离BjGSTF12基因的基因组序列和开放阅读框序列，该基因序列含有3个外显子和2个内含子。利用NCBI网站分析该基因编码氨基酸序列具有GST_NTERHE和GST_CTER两个结构域，表明芥菜BjGSTF12具有GST蛋白的GST-N和GST-C保守结构域，属于GST家族成员。本研究通过进一步的系统进化树分析所获得的芥菜BjGSTF12与拟南芥φ亚家族GST成员聚类为一个类群，与拟南芥AtGSTF12的亲缘关系最近，表明该基因属于GST家族φ亚家族成员。花青素是类黄酮化合物，为植物提供从红色、粉红色、橙色到蓝色的一系列颜色，是评价植物花色、叶色、果色等器官色泽及营养品质的重要指标。花青素在细胞质中合成，由苯丙氨酸解氨酶（phenylalanin ammonialyase，PAL）、TT4/CHS、黄烷酮3-羟化酶（flavanone3-hydroxylase，F3H）、DFR、UF3GT、LDOX等酶参与完成（侯泽豪等，2017）；主要通过空泡隔离积聚在液泡中，其中包括GST、多药和有毒化合物挤出（multidrug and toxin extrusion，MATE）以及ATP结合盒（ATP binding cassette，ABC）转运体（Shao et al.，2021）。本研究在紫薹芥菜和绿薹芥菜克隆得到的BjGSTF12基因，其核苷酸序列和氨基酸序列比对结果一致，并且与芥菜基因组BjuVB05G21730基因序列也完全一致，CDS序列长度为651 bp，编码216个氨基酸残基，该序列与油菜、白菜、拟南芥、萝卜GSTF12氨基酸序列同源性较高，为84.33%~95.31%。GST蛋白除参与逆境胁迫调控外，也参与花青素的转运（Marrs et al.，1995；Kitamura et al.，2004）。在拟南芥（Sun et al.，2012）、棉花（Shao et al.，2021）、萝卜（Niu et al.，2022）等植物中陆续被报道，GSTF12参与花青素从细胞质转运到液泡的过程。此外，在猕猴桃、马铃薯等物种中，GST1也可作为花青素运输载体转运花青素至液泡（Liu et al.，2019；Zhang et al.，2023）。综上表明，植物GST基因在花青素积累中的功能是保守的。本研究发现，BjGSTF12基因在绿薹芥菜中仅有微弱表达，而在紫薹芥菜中的表达水平明显提高，并且不同薹色芥菜BjGSTF12基因表达水平与花青素含量有类似的变化规律。
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图8 绿薹、紫薹芥菜BjGSTF12启动子序列比对
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Fig.8 Alignment of BjGSTF12 promoter sequences from Brassica juncea with green stalk and purple stalk
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图9 绿薹、紫薹芥菜BjGSTF12基因启动子顺式作用元件分布图
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Fig.9 Cis-acting regulatory elements in the promoter region of BjGSTF12 genes from Brassica juncea with green stalk and purple stalk
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本研究中，尽管紫薹、绿薹芥菜在花青素含量和BjGSTF12基因表达水平方面存在明显差异，但是从2个芥菜品系中克隆的BjGSTF12基因序列完全一致，暗示BjGSTF12基因对芥菜花青素合成积累的影响可能发生在转录水平。为此，我们从绿薹芥菜、紫薹芥菜中分离BjGSTF12启动子序列，发现2个品系BjGSTF12启动子序列相似度为99.78%，紫薹芥菜BjGSTF12启动子有4处存在单碱基的突变或插入，但这2个品系BjGSTF12启动子序列的顺式作用元件种类与数目均相同，主要含有MYB转录因子结合位点、赤霉素响应元件、厌氧诱导响应元件以及损伤和防御响应元件等作用元件。前人研究表明，MYB转录因子通过调控GST促进花青素积累（Hu et al.，2016；Zhang et al.，2023）；在油菜中，GSTF12与MYB5、MYB56、MYB61、MYB118等多个MYB转录因子存在共表达（Wei et al.，2019）；Goswami等（2018）利用杂交创制富含花青素的甘蓝型油菜，研究表明TT19（GSTF12）与MYB111、TT8共同调控花青素合成和积累。此外，除MYB结合位点外，BjGSTF12启动子还受激素、环境因子等调控。然而，紫薹芥菜BjGSTF12启动子序列的突变和插入与该基因在绿薹、紫薹芥菜表达差异之间的关系，也有待进一步研究。
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利用STRING数据库分析芥菜BjGSTF12互作蛋白网络，芥菜BjGSTF12与DFR、TT4/CHS、LDOX、UF3GT等花青素合成关键酶存在互作，同时与TT12和AHA10等负责原花青素单体向液泡转运的蛋白存在互作；此外，BjGSTF12与AT5MAT、AT4G14090、AT1G03495等负责花青素糖基化、酰基化修饰蛋白也存在互作关系。然而，研究者指出GST本身并不能直接催化花青素生物合成，它仅作为载体将花青素从细胞质转运至液泡（Sun et al.，2012）。由此可见，芥菜BjGSTF12可能通过互作蛋白相互作用调控花青素的生物合成、修饰、转运，从而影响花青素的积累。然而，目前本研究还缺少足够的试验证据，今后将通过亚细胞定位、基因功能鉴定、构建酵母文库并筛选芥菜GST基因上游转录因子等方面着手，深入探究GST在芥菜薹茎花青素积累过程中生物学功能及其作用机制。
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图10 芥菜BjGSTF12蛋白的互作网络图
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Fig.10 Interaction network map of BjGSTF12 proteins from Brassica juncea
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综上所述，我们从绿薹、紫薹芥菜中克隆并分析了BjGSTF12基因、启动子序列，分析结果表明该基因属于植物GST家族的φ亚家族成员，其启动子包含的顺式作用元件种类和数目，仅存在几处碱基突变/插入，然而该基因在绿薹、紫薹芥菜中表达量存在显著差异且与芥菜薹茎花青素含量有类似的变化规律，表明BjGSTF12为功能基因，可能在芥菜薹茎花青素积累中发挥重要作用，为今后芥菜花青素积累机制研究提供了1个候选基因。然而，要想全面了解BjGSTF12调控芥菜花青素积累的具体作用机制还有待于进一步研究。
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参考文献
-
CHEN C, CHEN H, ZHANG Y, et al. , 2020. TBtools: An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J]. Mol Plant, 13(8): 1194-1202.
-
CHEN XH, WANG ZY, LI XP, et al. , 2013. Research progress on glutathione S-transferases [J]. J NE Agric Univ, 44(1): 149-153. [陈秀华, 王臻昱, 李先平, 等, 2013. 谷胱甘肽S-转移酶的研究进展 [J]. 东北农业大学学报, 44(1): 149-153. ]
-
CUMMINS I, DIXON DP, FREITAG-POHL S, et al. , 2011. Multiple roles for plant glutathione transferases in xenobiotic detoxification [J]. Drug Metab Rev, 43(2): 266-280.
-
FU M, CHEN G, TANG K, et al. , 2022. Research progress and prospect of mustard breeding [J]. Guangdong Agric Sci, 49(10): 9-18. [符梅, 陈刚, 唐康, 等, 2022. 芥菜育种研究进展与展望 [J]. 广东农业科学, 49(10): 9-18. ]
-
GOSWAMI G, NATH UK, PARK J, et al. , 2018. Transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in a high anthocyanin resynthesized Brassica napus cultivar [J]. J Biol Res-Thessalon, 25: 19.
-
HOU ZH, WANG SP, WEI SD, et al. , 2017. Anthocyanin biosynthesis and regulation in plants [J]. Guihaia, 37(12): 1603-1613. [侯泽豪, 王书平, 魏淑东, 等, 2017. 植物花青素生物合成与调控的研究进展 [J]. 广西植物, 37(12): 1603-1613. ]
-
HU B, ZHAO J, LAI B, et al. , 2016. LcGST4 is an anthocyanin-related glutathione S-transferase gene in Litchi chinensis Sonn [J]. Plant Cell Rep, 35（4): 831-843.
-
KITAMURA S, SHIKAZONO N, TANAKA A, 2004. Transparent testa 19 is involved in the accumulation of both anthocyanins and proanthocyanidins in Arabidopsis [J]. Plant J, 37(1): 104-114.
-
LALLEMENT PA, BROUWER B, KEECH O, et al. , 2014. The still mysterious roles of cysteine-containing glutathione transferases in plants [J]. Front Pharmacol, 5: 192.
-
LI H, ZHU L, YUANG G, et al. , 2016. Fine mapping and candidate gene analysis of an anthocyanin-rich gene, BnaA. PL1, conferring purple leaves in Brassica napus L. [J]. Mol Genet Genom, 291(4): 1523-1534.
-
LIU LB, SONG YX, ZHANG HJ, et al. , 2021. Genome-wide identification and expression analysis of GST gene family in pomegranate (Punica granatum) [J]. Mol Plant Breed, 19(16): 5307-5317. [刘龙博, 宋运贤, 张慧君, 等, 2021. 石榴GST基因家族全基因组鉴定及表达分析 [J]. 分子植物育种, 19(16): 5307-5317. ]
-
LIU PY, 1996. Chinese mustard [M]. Beijing: China Agricultural Press: 24-56. [刘佩瑛, 1996. 中国芥菜 [M]. 北京: 中国农业出版社： 24-56. ]
-
LIU Y, QI Y, ZHANG A, et al. , 2019. Molecular cloning and functional characterization of AcGST1, an anthocyanin-related glutathione S-transferase gene in kiwifruit (Actinidia chinensis) [J]. Plant Mol Biol, 100: 451-465.
-
LIVAK KJ, SCHMITTGEN TD, 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method [J]. Methods, 25(4): 402-408.
-
MARRS KA, ALFENLTO MR, LLOYD AM, et al. , 1995. A glutathione S-transferase involved in vacuolar transfer encoded by the maize gene Bronze-2 [J]. Nature, 375(6530): 397-400.
-
MOHSENZADEH S, ESMAEILI M, MOOSAVI F, et al. , 2011. Plant glutathione S-transferase classification, structure and evolution [J]. Afr J Biotechnol, 10(42): 8160-8165.
-
NIU M, BAO C, CHEN J, et al. , 2022. RsGSTF12 contributes to anthocyanin sequestration in radish (Raphanus sativus L. ) [J]. Front Plant Sci, 13: 870202.
-
SHAO D, LI Y, ZHU Q, et al. , 2021. GhGSTF12, a glutathione S-transferase gene, is essential for anthocyanin accumulation in cotton (Gossypium hirsutum L. ) [J]. Plant Sci, 305: 110827.
-
SUN Y, HONG L, HUANG JR, et al. , 2012. Arabidopsis TT19 functions as a carrier to transport anthocyanin from the cytosol to tonoplasts [J]. Mol Plant, 5(2): 387-400.
-
WAN ZJ, FAN YH, MENG QF, et al. , 2020. Development and prospect of mustard seed industry in China [J]. Chin Veget, 382(12): 1-6. [万正杰, 范永红, 孟秋峰, 等, 2020. 中国芥菜种业发展与展望 [J]. 中国蔬菜, 382(12): 1-6. ]
-
WEI L, ZHU Y, LIU R, et al. , 2019. Genome wide identification and comparative analysis of glutathione transferases (GST) family genes in Brassica napus [J]. Sci Rep, 9(1): 1-13.
-
XING L, GUO YY, WANG ZQ, et al. , 2020. Cloning and bioinformatics analysis of GST gene of Leymus chinensis [J]. J Shanxi Agric Univ (Nat Sci Ed), 40(5): 48-56. [邢磊, 郭园艺, 汪自庆, 等, 2020. 羊草GST基因的克隆及序列分析 [J]. 山西农业大学学报（自然科学版）, 40(5): 48-56. ]
-
ZHANG CJ, CHENG B, YANG L, et al. , 2022. Mung bean glutathione transferase-coding genes and its response to cadmium stress based on genome-wide identification and transcriptome analysis [J]. Acta Agric Boreal-Occident Sin, 31(6): 703-717. [张创娟, 程斌, 杨乐, 等, 2022. 基于全基因组和转录组的绿豆谷胱甘肽转移酶基因及其对镉胁迫的响应 [J]. 西北农业学报, 31(6): 703-717. ]
-
ZHANG X, TAO L, QIAO S, et al. , 2017. Role of glutathione transferase in plant resistance to abiotic stresses [J]. Chin Biotechnol, 37 (3): 92-98. [张雪, 陶磊, 乔晟, 等, 2017. 谷胱甘肽转移酶在植物抵抗非生物胁迫方面的角色 [J]. 中国生物工程杂志, 37(3): 92-98. ]
-
ZHANG ZH, ZHANG HL, LIU TF, et al. , 2023. Functional analysis of the anthocyanin-associated glutathione S-transferase gene StGST1 in potato [J]. Potato Res, 66(1): 215-230.
-
摘要
为了探究谷胱甘肽转移酶编码基因（GST）在芥菜花青素积累中的作用，该文以紫薹-绿薹芥菜近等位基因系为材料，克隆到1个花青素积累相关的GST基因，命名为BjGSTF12。该文对BjGSTF12编码蛋白及其启动子进行生物信息学分析，并分析其在绿薹、紫薹芥菜中的表达水平及其与花青素含量的关系。结果表明：（1）BjGSTF12的基因组和cDNA全长分别为808、651 bp，编码216个氨基酸，具有GST_N端和GST_C端保守结构域。然而，绿薹、紫薹芥菜BjGSTF12序列无区别。（2）BjGSTF12与拟南芥AtGSTF12亲缘关系最近，同属于φ亚家族。（3）2个芥菜品系BjGSTF12启动子序列存在4处碱基突变/插入，但二者顺式作用元件种类与数目相同，均含9个MYB结合位点、1个赤霉素响应元件、3个非生物胁迫响应元件。（4）紫薹芥菜花青素含量显著高于绿薹芥菜，BjGSTF12表达水平与花青素含量表现出类似变化规律。（5）互作蛋白网络分析表明，BjGSTF12与花青素合成关键酶、糖基化修饰、转运蛋白等蛋白存在互作。综上认为，BjGSTF12在芥菜薹茎花青素积累中可能发挥重要作用，BjGSTF12可能通过互作蛋白调控芥菜花青素合成、修饰、转运从而影响花青素积累。该文对深入研究GST在芥菜薹茎花青素积累的功能及作用机制奠定了一定理论基础。
Abstract
To explore the role of glutathione S-transferase gene (GST) in the accumulation of anthocyanin in Brassica juncea, one GST gene related to the anthocyanidin accumulation was cloned from near-isogenic lines of B. juncea with purple stalk and green stalk, and named as BjGSTF12. In this study, the bioinformatics characteristics of BjGSTF12 encoding protein and promoter were analyzed, the expression level of BjGSTF12 and the relationship with total anthocyanidin content were analyzed in B. juncea lines with purple stalk and green stalk. The results were as follow: (1) BjGSTF12 genes from B. juncea were successfully cloned, whose the full length of BjGSTF12 in genome and cDNA was 808 bp and 651 bp, encoding a protein of 216 amino acids. The BjGSTF12 contained the typical domains of GST proteins, namely GST_N and GST_C. However, their sequences of BjGSTF12 did not exhibit any differences between the two lines of B. juncea. (2) BjGSTF12 was closely related to AtGSTF12 in Arabidopsis, and both belonged to the φ subfamily of GST family. (3) The BjGSTF12 promoter sequences were cloned from two Brassica juncea strains of green stalk and purple stalk, and they exhibited four base mutations/insertions. However, the types and numbers of cis-acting elements did not show obvious differences between the two strains, including nine MYB transcription factor binding sites, one hormone response element, and three abiotic corresponding elements. (4) The total anthocyanidin content in B. juncea of purple stalk was significantly higher than that in green stalk ones, and the expression levels of BjGSTF12 in two lines were found to be similar to the total anthocyanidin content in both lines. (5) Protein interaction network analysis revealed that BjGSTF12 may interact with the key enzymes of anthocyanidin biosynthesis, glycosylation modification, and transporter proteins. In summary, BjGSTF12 is likely to play a key role in the accumulation of anthocyanidin in B. juncea by regulating its biosynthesis, modification, and transportation through interactions with other proteins. This study provides a theoretical reference for further study on the function of GST and the mechanism of anthocyanidin accumulation in B. juncea.
