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马醉木（Pieris japonica）为杜鹃花科（Ericaceae）马醉木属（Pieris）的一种常绿灌木植物，主要分布在我国的台湾、安徽、福建、湖北、江西和浙江等省份。除了被用作观赏植物外，马醉木的茎和叶可以治疗中暑吐泻和疥疮等疾病，亦可用作杀虫剂等（Yao et al.，2005）。现有研究表明，马醉木属中含有很多结构丰富的木藜芦烷（grayanane）、贝壳杉烷（kaurane）和木藜芦烷酚（leucothane）等类型的二萜类化学成分（Li et al.，2013a; Li et al.，2017a，b; Zheng et al.，2020）。更为重要的是，该类成分表现出多样的生物活性，包括抗炎（Zhou et al.，2018）、抗病毒（Li et al.，2013b; Li et al.，2016）、神经保护、cAMP调节（Wang et al.，2013）、钾通道调节剂（Niu et al.，2018）、拒食（Li et al.，2017b）、PTP1B抑制（Liu et al.，2014; Zhou et al.，2017）和镇痛（Sun et al.，2018; Sun et al.，2019a）等。
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为进一步研究马醉木的物质基础，并定向获取其二萜类成分，我们对滇产马醉木叶中的化学成分和乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了研究，以期为马醉木后续的开发与利用奠定一定的物质基础，同时丰富马醉木化学成分多样性，为寻求更多的活性成分提供借鉴，也为该植物的综合利用提供一定的科学依据。本研究从马醉木叶中分离并鉴定了8个二萜类化合物，分别是pierisformoside F（1）、3-epi-grayanotoxin XVⅢ（2）、3-epi-grayanotoxin B（3）、asebotoxin-X（4）、pierisformosin B（5）、asebotoxin Ⅲ（6）、rhodojaponin Ⅲ（7）和pierisformosin C（8）。其中，化合物pierisformoside F（1）为首次从该植物中分离得到，化合物pierisformosin C（8）表现出乙酰胆碱酯酶抑制活性。
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1 材料、仪器与方法
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1.1 实验药材
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所用材料于2021年5月12日采自中国科学院昆明植物研究所昆明植物园，经中国科学院昆明植物研究所昆明植物园马永鹏研究员鉴定为马醉木（Pieris japonica），其标本（KIB-Q-202101B）存放于中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室。
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1.2 实验仪器
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Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF液质联用仪（美国）；AVANCE Ⅲ 500 MHz和AV 600 MHz 核磁共振仪（德国Brucker公司）；Hanbon-NP7000C高效液相色谱仪（江苏汉邦科技有限公司）；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（9.4 mm × 250 mm，5.0 μm，美国）；柱层析硅胶粉（200~300目）和薄层色谱硅胶板（GF254）（购自青岛谱科分离材料有限公司）；MCI填料（CHP20/P120，日本三菱化学株式会社）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（Cytiva，瑞典）；C18 MB100-40/75（Chromatorex，Fuji Silysia，Japan）；Büchi MPLC C-605双梯度泵系统（瑞士）；色谱乙腈（上海星可高纯溶剂有限公司）；甲醇、氯仿、乙酸乙酯（均购自云南仁科商贸有限公司）；0.5%香草醛硫酸显色剂（自配）；Na2HPO4（Sigma）；NaH2PO4（Sigma）；乙酰胆碱酯酶（Sigma）；碘化硫代乙酰胆碱（Sigma）；DTNB（Sigma）；他克林（Sigma）；Multiskan FC（Thermo公司）。
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1.3 实验方法
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1.3.1 提取与分离
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将马醉木中的组分用0.5%的香草醛硫酸显色，根据最初显色为紫红色而随后渐渐变成蓝色，静置12 h之后颜色变为绿色的特征来定向获取其二萜类成分。取干燥马醉木叶2.5 kg粉碎后用乙酸乙酯冷浸提取3次，24 h提取1次，减压回收提取液后得到总浸膏。将浸膏（480 g）先经MCI柱层析、甲醇-水（40∶60→100∶0）梯度洗脱，再经薄层色谱显色得4个组分（Fr.A~Fr.D）。其中，Fr.A（310 g）经硅胶柱层析，选CHCl3-MeOH（30∶1→0∶1）为洗脱剂梯度洗脱，根据薄层色谱显色特征得到富含二萜组分Fr.A1和非二萜组分Fr.A2。Fr.A1（5.8 g）经Sephadex LH-20柱层析，得到2个组分Fr.A1-1和Fr.A1-2。Fr.A1-1（4.0 g）经硅胶柱层析、CHCl3-MeOH（15∶1→0∶1）梯度洗脱，得到5个组分Fr.A1-1-1-Fr.A1-1-5。Fr.A1-1-1（1.0 g）经硅胶柱层析，用CHCl3-MeOH（15∶1→0∶1）梯度洗脱，得到化合物1（30 mg）、2（26 mg）和化合物3（100 mg）。Fr.A1-1-2（300 mg）部分经RP-18柱层析，用甲醇-水（35∶65→70∶30）梯度洗脱，得到化合物4（36 mg）和化合物5（9 mg）。Fr.A1-1-3 （60 mg）经高效液相色谱（乙腈-水，30∶70，5.0 mL·min-1）纯化，得到化合物6（7.0 mg，tR = 9 min）和化合物7（1.2 mg，tR = 16 min）。Fr.A1-1-4（80 mg）经高效液相色谱（乙腈-水，20∶80，4.0 mL·min-1）纯化，得到化合物8（4.0 mg，tR = 9.7 min）。
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1.3.2 乙酰胆碱酯酶抑制活性测试
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参照文献Liu等（2020）的方法对乙酰胆碱酯酶抑制活性进行测试；分别选取DMSO和他克林作为阴性对照组和阳性对照组，对化合物1-8进行活性测定；化合物的终浓度为50.0 μmol· L-1，他克林的终浓度为0.333 μmol· L-1；每组测定均重复3次。
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2 结果与分析
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2.1 化合物结构鉴定
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马醉木叶乙酸乙酯提取物，经硅胶、Sephadex LH-20、反相半制备高效液相等色谱技术分离与纯化，得到8个化合物，利用1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS等波谱手段，结合参考文献，确定了这些二萜化合物的结构。所得二萜化合物包括木黎芦烷酚型化合物（1）和木黎芦烷型化合物（2-8），其中木黎芦酚型二萜化合物为首次从该植物中分离得到。化合物1-8的结构如图1所示。
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化合物1 白色无定型粉末。 [α]20 D-43.80（c 0.1，MeOH），UV（MeOH）λmax（log ε）202（3.8）nm，ESI-MS m/z 503 [M + Na]+，分子式C26H40O8。1H-NMR（500 MHz，methanol-d4）δH：5.02（1H，s），4.90（1H，s），4.42（1H，d，J = 7.8 Hz），1.42（3H，s），1.18（3H，s），1.08（3H，s）；13C-NMR（125 MHz，methanol-d4）δC：217.5（C-5），153.0（C-10），105.8（CH2-20），99.2（Glc-CH-1′），89.1（C-16），78.6（Glc-CH-3′），78.3（Glc-CH-5′），77.6（CH-3），75.2（Glc-CH-2′），71.7（Glc-CH-4′），62.8（Glc-CH2-6′），53.4（CH2-15），50.8（C-4），50.4（CH-9），49.3（CH-6），48.1（CH-13），46.8（C-8），44.0（CH-1），39.2（CH2-7），36.2（CH2-14），32.5（CH2-2），25.3（CH2-12），22.5（CH2-11），21.7（CH3-18），20.9（CH3-17），20.9（CH3-19）。以上数据与文献（Wang et al.，2000）比对基本一致，故鉴定化合物1为pierisformoside F。
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化合物2 白色无定型粉末。[α]20 D-21.00（c 0.1，MeOH），ESI-MS m/z 359 [M + Na]+，分子式C20H32O4。1H-NMR（500 MHz，methanol-d4）δH：5.04（1H，s），4.93（1H，s），1.35（3H，s），1.17（3H，s），1.03（3H，s）；13C-NMR（125 MHz，methanol-d4）δC：152.8（C-10），113.5（CH2-20），83.5（C-5），82.5（CH-3），81.3（C-16），72.2（CH-6），63.2（CH2-15），55.3（CH-9），51.2（C-4），48.0（CH-13），46.2（CH2-7），45.0（C-8），44.2（CH-1），39.0（CH2-14），35.9（CH2-2），26.7（CH2-11），25.3（CH3-19），24.7（CH3-17），24.3（CH2-12），19.3（CH3-18）。以上数据与文献（Sun et al.，2019a）比对基本一致，故鉴定化合物2为3-epi-grayanotoxin XVⅢ。
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化合物3 淡黄色胶状固体。[α]20 D-19.20（c 0.1，MeOH），UV（MeOH）λmax（log ε）202（3.7）nm，ESI-MS m/z 521 [M + Na]+，分子式C26H42O9。1H-NMR（500 MHz，methanol-d4）δH：5.01（1H，s），4.97（1H，s），4.31（1H，d，J = 7.8 Hz），1.35（3H，s），1.22（3H，s），1.10（3H，s）；13C-NMR（125 MHz，methanol-d4）δC：152.1（C-10），113.7（CH2-20），105.3（Glc-CH-1′），90.0（CH-3），83.1（C-5），81.2（C-16），77.8（Glc-CH-3 ′），77.7（Glc-CH-5′），75.4（Glc-CH-2′），72.5（Glc-CH-4′），71.6（CH-6），63.1（CH2-15），62.7（Glc-CH2-6′），55.4（CH-9），51.6（C-4），47.9（CH-13），46.3（CH2-7），45.0（C-8），43.9（CH-1），37.6（CH2-14），35.9（CH2-2）26.9（CH2-12），26.3（CH3-17），25.3（CH3-19），24.3（CH2-11），19.9（CH3-18）。以上数据与文献（Sun et al.，2018）比对基本一致，故鉴定化合物3为3-epi-grayanotoxin B。
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图1 化合物1-8 的结构
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Fig.1 Structures of compounds 1-8
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化合物4 白色无定型粉末。 [α]20 D-12.20（c 0.1，MeOH），UV（MeOH）λmax（log ε）202（3.2）nm，ESI-MS m/z 465 [M + Na]+，分子式C23H38O8。1H-NMR（600 MHz，methanol-d4）δH：5.53（1H，s），1.42（3H，d，J = 6.9 Hz），1.37（3H，s），1.33（3H，s），1.18（3H，s），0.96（3H，s）；13C-NMR（150 MHz，methanol-d4）δC：175.5（COCHOHCH3），85.0（C-5），83.6（CH-3），83.3（CH-14），79.8（C-16），79.0（C-10），74.1（CH-6），68.4（COCHOHCH3），60.6（CH2-15），56.5（CH-13），55.5（CH-9），52.2（C-4），51.5（C-8），51.2（CH-1），43.5（CH2-7），35.5（CH2-2），27.7（CH3-20），27.6（CH2-12），23.7（CH3-17），23.3（CH3-19），22.6（CH2-11），20.7（COCHOHCH3），19.3（CH3-18）。以上数据与文献（Sakakibara et al.，1980）比对基本一致，故鉴定化合物4为asebotoxin-X。
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化合物5 白色无定型粉末。 [α]20 D-7.20（c 0.1，MeOH），ESI-MS m/z 449 [M + Na]+，分子式C23H38O7。1H-NMR（600 MHz，methanol-d4）δH：5.49（1H，s），1.37（3H，s），1.33（3H，s），1.18（3H，s），0.96（3H，s）；13C-NMR（150 MHz，methanol-d4）δC：175.6（COCH2CH3），85.0（C-5），83.6（CH-3），82.8（CH-14），79.8（C-16），79.0（C-10），74.2（CH-6），60.7（CH2-15），56.6（CH-9），55.4（CH-13），52.2（C-4），51.5（C-8），51.1（CH-1），43.7（CH2-7），35.5（CH2-2），28.8（COCH2CH3），27.7（CH3-20），27.7（CH2-12），23.8（CH3-17），23.3（CH3-19），22.6（CH2-11），19.3（CH3-18），9.6（COCH2CH3）。以上数据与文献（Wang et al.，1998）比对基本一致，故鉴定化合物5为pierisformosin B。
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化合物6 白色无定型粉末。[α]20 D-36.00（c 0.1，MeOH），UV（MeOH）λmax（log ε）204（3.3）nm，ESI-MS m/z 463 [M + Na]+，分子式C23H36O8。其ESI-MS谱显示分子离子峰为m/z 463 [M + Na]+。1H-NMR（600 MHz，methanol-d4）δH：5.50（1H，s），4.31（1H，q，J = 6.9 Hz），1.44（3H，s），1.41（3H，d，J = 6.9 Hz），1.33（3H，s），1.22（3H，s），1.07（3H，s）；13C-NMR（150 MHz，methanol-d4）δC：175.5（COCHOHCH3），82.8（CH-14），80.2（C-5），79.9（C-16），78.1（C-10），73.3（CH-6），68.4（COCHOHCH3），65.0（CH-3），60.6（CH-2），60.3（CH2-15），56.5（CH-9），55.7（CH-13），54.4（CH-1），51.3（C-4），48.4（C-8），43.6（CH2-7），30.3（CH3-20），27.6（CH2-12），23.7（CH3-17），22.4（CH2-11），21.2（CH3-19），20.7（COCHOHCH3），20.1（CH3-18）。以上数据与文献（Sakakibara et al.，1980）比对基本一致，故鉴定化合物6为asebotoxin Ⅲ。
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化合物7 白色无定型粉末。 [α]20 D-6.20（c 0.1，MeOH），ESI-MS m/z 391 [M + Na]+，分子式C20H32O6。1H-NMR（600 MHz，methanol-d4）δH：1.42（3H，s），1.30（3H，s），1.25（3H，s），1.15（3H，s）；13C-NMR（150 MHz，methanol-d4）δC：81.3（C-16），80.4（C-5），79.8（CH-14），78.4（C-10），73.8（CH-6），65.1（CH-3），60.6（CH-2），59.7（CH2-15），56.7（CH-9），56.0（CH-1），54.7（CH-13），52.4（C-8），48.6（C-4），44.0（CH2-7），30.4（CH3-20），27.2（CH2-12），23.3（CH3-17），22.4（CH2-11），21.3（CH3-19），20.2（CH3-18）。以上数据与文献（Klocke et al.，1991）比对基本一致，故鉴定化合物7为rhodojaponin Ⅲ。
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化合物8 白色无定型粉末。 [α]20 D-1.80（c 0.1，MeOH），ESI-MS m/z 465 [M + Na]+，分子式C23H38O8。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：5.61（1H，s），1.35（3H，s），1.32（3H，s），1.20（3H，s），0.99（3H，s）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：173.0（COCH2CH3），83.2（CH-14），83.1（CH-3），82.7（C-5），78.8（CH-6），78.4（C-16），77.7（C-10），77.7（CH2-7），54.7（C-8），54.6（CH2-13），53.9（CH-9），51.9（CH2-15），51.9（C-4），49.3（CH-1），34.7（CH-2），28.5（COCH2CH3），28.2（CH3-20），26.7（CH2-12），23.1（CH3-17），23.0（CH3-18），21.7（CH2-11），18.8（CH3-19），9.2（COCH2CH3）。以上数据与文献（Wang et al.，1998）基本一致，故鉴定化合物8为pierisformosin C。
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2.2 乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选
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由表1可知，在50.0 μmol· L-1的浓度下，化合物8具有一定的乙酰胆碱酯酶抑制作用，其抑制率为（23.88±2.47）%（抑制率＜20.0%）。
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3 讨论与结论
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对马醉木叶乙酸乙酯提取部分进行分离纯化，并对其进行乙酰胆碱酯酶抑制活性测定，经鉴定得到8个高度氧化的二萜类成分，主要为木黎芦烷型二萜和木黎芦烷酚型二萜。其中，化合物1为首次从该植物中分离得到，化合物8有一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性。
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现代药理学研究表明，马醉木分离得到的化合物具有拒食性、杀虫性、镇痛和抗炎等多种生物功能。例如，Sun等（2018; 2019a，b）对分离得到的化合物pierisformoside F（1）、 3-epi-grayanotoxin XVⅢ（2）和3-epi-grayanotoxin B（3）进行了体外扭体实验，研究发现它们都具有很好的镇痛作用，在5.0 mg·kg-1的剂量下扭体抑制率超过50%；Yasushi等（1980）对分离的胃下神经输卵管进行注射分离，发现所得到的化合物asebotoxin Ⅲ（6）能刺激引起第一次快速收缩后引发强烈的第二次缓慢收缩；Klocke等（1991）采用双重选择生物测定法对分离到的化合物rhodojaponin Ⅲ（7）进行拒食活性评价，发现其具有拒食活性，后期有望将其作为杀虫剂使用。这与本研究所得到的化合物一致。但经文献调研发现，目前鲜有关于该类成分乙酰胆碱酯酶抑制作用的报道。因此，本研究对分离得到的化合物首次进行了乙酰胆碱酯酶抑制活性的测定，结果表明马醉木中具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的二萜类成分，这为今后充分利用马醉木植物资源以及使用现代植物化学手段深入挖掘该类成分，寻找具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的二萜类成分提供了研究基础。
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摘要
为研究马醉木叶中的二萜成分及其乙酰胆碱酯酶抑制活性，该研究根据薄层色谱显色特征，使用硅胶、MCI和半制备高效液相等色谱技术对其进行分离与纯化，并通过波谱数据 (NMR和MS) 分析且结合文献报道数据进行对比，鉴定了所得化合物的结构，同时采用Ellman法首次对其乙酰胆碱酯酶抑制活性进行评价。结果表明：从马醉木叶中分离并鉴定了8个二萜化合物，分别是pierisformoside F (1)、3-epi-grayanotoxin ⅩⅧ (2)、3-epi-grayanotoxin B (3)、asebotoxin-X (4)、pierisformosin B (5)、asebotoxin Ⅲ (6)、rhodojaponin Ⅲ (7) 和pierisformosin C (8)。其中，化合物1为首次从该植物中分离得到，化合物8表现出乙酰胆碱酯酶抑制活性。综上表明，马醉木中含有丰富的二萜成分和活性成分。该研究结果丰富了马醉木的化学成分多样性，为其后续综合开发和利用提供了一定的理论依据，也为寻求更多的活性成分提供了借鉴。
Abstract
In order to investigate the diterpenoid components from the leaves of Pieris japonica and their acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activities, with the aid of thin-layer chromatography color characteristics, silica gel, MCI and semi-preparative high-performance liquid chromatography technology, the target constituents were isolated and purified. The structures of the obtained compounds were identified by analyses of their spectral data (NMR and MS) and comparison of their data with those of reported in the literature. Meanwhile, AChE inhibitory effects of obtained diterpenoids were evaluated for the first time by a Ellman method. The results showed that eight diterpenoid compounds were isolated and identified from the leaves of P. japonica, namely pieriformoside F (1), 3-epi-grayanotoxin ⅩⅧ (2), 3-epi-grayanotoxin B (3), asebotoxin-X (4), pieriformosin B (5), asebotoxin Ⅲ (6), rhodojaponin Ⅲ (7), and pieriformosin C (8). Among them, Compound 1 was isolated from this plant for the first time, and Compound 8 showed AChE inhibitory activity. In conclusion, the results enriches the diterpenoids and bioactive components of P. japonica, which provides a certain theoretical basis for its further development and utilization.
关键词
杜鹃花科 ； 马醉木 ； 二萜 ； pierisformoside F ； 乙酰胆碱酯酶抑制活性
