白及（Bletilla striata）为兰科（Orchidaceae）白及属（Bletilla）多年生草本植物，别名白芨、连及草、利知子、甘根等。白及属植物全球有6种，均分布在亚洲，其中中国有4种，分别为白及、小白及、华白及、黄花白及（中国植物志，1999）。白及具有止血补肺、生肌止痛之功效，用于防治咯血、吐血、慢性胃溃疡及肿瘤、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症（中华人民共和国药典，2020）；此外，白及叶态优美、花大色艳、花期长，可在园林景观中用于布置花坛、花境或花海（石晶，2010；朱娇等，2020）。此外，白及还可用于制作粘合剂、浆丝绸、面膜或涂料以及酿酒等（刘光斌等，2005；Gouvg et al.，2009）。因此，白及是一种兼具药用、观赏和工业价值的多用途植物。

近年来，随着市场需求量的逐年上升，种植规模不断扩大，各类病害频繁爆发，如叶斑病（柯尚艳等，2018；Zhou et al.，2018）、叶褐斑病和锈病等（宋莉莎，2019），严重影响了白及的产量和质量以及观赏价值。根腐病是白及的常见病害之一，大多发生在6—8月，地下块茎出现褐色病斑，内部呈黑褐色软腐状，并伴有腥臭味，整个根部维管束被破坏，失去输水能力；地上茎秆、叶片基部和叶鞘早期表现为褐色干枯状长条形病斑，边缘黄色晕染状，后期则干枯至死，病株易连根茎从土中拔出，发病块茎呈木质化纤维。整体发病率在15%左右，危害较大，一旦受害就会严重影响药材的品质和产量。该病害易与叶斑病混淆（Zhou et al.，2018）。目前，虽然研究报道表明引起白及根腐病的病原菌主要是尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum）和腐皮镰刀菌（F. solani）（孙乐乐等，2013；宋莉莎，2019），但这些研究并未报道引起根腐病的地上部症状的病原菌。鉴于以上情况，在广西地区引起白及根腐病的病原菌是否与叶斑病致病菌一致或者与根腐病致病菌一致目前尚不清楚。中药材提取物具有低污染、低毒、低残留的特点，广泛用于中药材病害防治，如厚朴和蛇床子提取液分别对黄芪和五味子根腐病具有很好的防治效果（刘莹等，2009；马伟等，2010）。然而，这些中药材提取物对白及病害的防治效果还需要验证。本文以白及根腐病为研究对象，采用常规组织分离法分离不同组织部位的病原菌，通过形态学且结合分子生物学技术鉴定病原菌，并采用菌丝生长速率法测定中药材提取液对病原菌的抑制效果，以期明确鉴定广西地区根腐病的病原菌，并筛选出能够抑制病原菌的中药材提取物，为白及根腐病防治提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年6月，于桂林市雁山区（地处110°17′ E、25°01′ N）采集白及病株，初步判断为叶斑病或根腐病。该病害多发生在6月中旬至8月初，整体发病率在15%左右，发病初期地上部无症状，地下部根系和块茎出现褐色病斑，块茎切开后呈黑褐色软腐状，并伴有腥臭味；随着病情的加深，当地下块茎出现1/3~1/2腐烂时，根系完全腐烂，地上茎秆开始出现褐色，叶片尖部和基部出现不规则病斑，病斑中央深褐色，边缘黄褐色至淡黄色，直至萎蔫，茎秆容易被抽出（图1）。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离

参照常规组织分离法（方中达，1998），从发病植株上采集病叶、叶鞘和地下块茎，冲洗干净，在病健交界处切下约 5 mm × 5 mm 的小块组织；先用75%的酒精处理30 s，再用0.1%浓度的升汞溶液消毒 60 s、无菌水冲洗晾干、无菌滤纸吸干水分后移置于 PDA 培养基上；在每个培养皿中（Φ= 90 mm）放入3~4 块组织，于25℃恒温条件下培养3 d，对其进行纯化培养。采用平板划线法进行菌种纯化，即在无菌操作台中用接种环挑取菌丝，在PDA平板上划线，进行编号后继续置于 25℃ 恒温条件下培养，纯化至出现单个的菌落即可。

1.2.2 病原菌的致病性测定

1.2.2.1 室内回接

将3年生的白及组培苗健康植株采回实验室，采取创伤接种法进行接种。用无菌水冲洗叶片和块茎，用无菌滤纸吸干表面水分，在超净工作台内操作，步骤如下：用解剖刀将叶片背面轻轻刮伤（约 5 mm × 5 mm）；对块茎采用刺伤接种法，使用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼；将带有菌丝那一面覆盖在叶片和块茎的伤口处，以接种PDA 培养基的健康白及叶片和块茎为对照组；每个叶片处理3个伤口，粘贴菌饼，重复 3 次；每个块茎从中间切开，各处理1个伤口，粘贴菌饼，重复3次。将样品平铺于带有湿润吸水纸的平盘内，做保湿处理，6 d 后统计感病数和发病率。计算公式：发病率=（感病数/接种总数）×100%。

1.2.2.2 田间回接

选择室内回接致病的菌株，进一步进行田间回接验证。选择健康植株的叶片，用解剖刀轻轻割伤叶片上表面，面积约 5 mm × 5 mm，使用直径5 mm的打孔器取培养基中生长良好的病原菌菌饼，将带有菌丝的一面贴向叶片，并利用透明胶布粘附到已接种的叶片部位；以无菌的 PDA 培养基作对照。每个处理 3 株，每张叶片粘贴 3个菌饼，共计9个接种部位。用保鲜袋罩住 24 h，6 d 后统计感病数和发病率。计算公式：发病率=（感病数/接种总数）×100%。

1.2.2.3 致病菌重新分离

对田间回接致病的植株进行再次分离，验证是否符合柯赫式法则，病原菌的分离方法同1.2.1。

1.2.3 病原菌的形态学鉴定

对田间回接致病的病原菌，挑取生长良好的病原菌菌落，采用插片培养法置于含有 PDA培养基的一次性培养皿中，在25℃ 恒温条件下培养，3~5 d 后观察菌丝体、分生孢子的形态，用leika正置式显微镜DM2500拍照，并测量分生孢子大小（长、宽）及菌丝直径。同时，查阅文献资料进行初步鉴定。

1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定

刮取菌丝，用液氮研磨法破壁，采用CTAB法提取病原菌菌丝的 DNA。采用真菌通用引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增，将获得的DNA片段进行1%的琼脂糖凝胶电泳检验。 PCR产物的纯化和测序由武汉擎科创新生物有限科技公司完成，将所得序列与GenBank（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov）中核酸数据进行BLAST分析，利用Vector NTIAdvance11 进行比对，通过MEGA 5.0 进行UPGMA分析生成系统发育树。通过同源性分析，对病原菌菌种进行分子水平鉴定（李若瑜等，2002）。

1.2.5 中药材提取物对根腐病病原菌的抑制效应

把7种备试中药材于烘箱中60℃烘干，粉碎，过40目筛（孔径0.425 mm），密封后于-20℃下保存待用。将乙醇作为溶剂，采用3次振荡浸提法提取（韩建华等，2002），合并3次滤液进行减压浓缩至质量浓度为1 g·mL^-1，密封后于4℃冰箱中保存。采用菌丝生长速率法（吴文君，1988）测定中药材提取液对白及根腐病致病菌的抑制效果。取质量浓度1 g·mL^-1的中药提取液加入PDA培养基中，摇匀，参照前人的浓度设计梯度制成浓度分别为0.05、0.1、0.2 g·mL^-1的带药平板（马伟等，2010；刘莹等，2019），以加入无菌水的PDA培养基为空白对照。选用直径为5 mm的打孔器，打取菌落边缘的菌饼，接种于带药平板上，每组处理重复3次，于25℃恒温下培养。培养48 h，每隔24 h用十字交叉法测量菌落直径，连续记录7次结果，计算抑制生长率。计算公式：抑制生长率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径5.0 mm）]×100%。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离

根据田间症状，初步判断为根腐病或叶斑病。从感病植株的叶片、叶鞘和块茎的病健交界处分别取样，分离病原菌，共分离出病原菌18株（真菌14株、细菌4株）。其中，从叶片中分离得到2株真菌和1株细菌，从叶鞘中分离得到9株真菌和2株细菌，从块茎中分离得到3株真菌和1株细菌，这说明分离的菌种相对较多且较为复杂，但不同组织部位均没有分离到霉菌。真菌编号为GF-1~GF-14，细菌编号为GB-1~GB-4，其中GF-1和GF-7在叶片、叶鞘以及块茎中均能分离得到。图2:A示部分分离的菌株。

2.2 病原菌的致病性测定

分别对18株菌株进行室内回接，接种3 d后观察，发现真菌GF-1、GF-4、GF-5和GF-7出现较明显的致病症状（图2：B），6 d 后统计发病率（表1）。对室内接种发病率较高的GF-1、GF-4、GF-5和GF-7等进行田间回接，发现仅GF-1接种部位呈现黑斑、有烧焦状、中间部位干枯（图3：A），室内回接有明显的黄色晕斑（图2：B中的GF-1），切开根茎后有腐烂（图2：C），与田间采取病株时的病害症状基本一致；其他菌株因致病病斑和对照组没有继续扩大或者无感病症状而接种部位干枯（图3：B-E）。从接种GF-1的发病组织中重新分离获得的病原菌，经纯化培养后与接种的病原菌完全一致，符合柯赫式法则，这充分表明分离获得的病原菌为该病的致病菌。

2.3 病原菌形态学鉴定

病原菌GF-1在 PDA培养基上，于25℃恒温条件下培养 5 d，长出白色绒絮状菌落，菌丝匍匐向外、向上生长，气生，菌落絮状，白色，圆形，菌落背部中心褐色或黑褐色，周围绿褐色至黄褐色（图4：A，B）。菌丝无色，生长较快，有隔膜，直径为3.2~6.9 μm，其分生孢子梗多分枝；厚垣孢子为长方形或椭圆形，大小为（6.5~9.6）μm×（6.5~7.1）μm，分生孢子散生，呈卵形，大小为（5.3~8.9）μm×（1.4~3.6）μm（图4：C，D）。菌落培养5 d 后直径为5.2~7.0 cm（培养皿Φ= 90 mm）。对照中国真菌志没有发现类似的真菌种类，经查阅相关文献资料（Aveskamp et al.，2010），初步判断GF-1病原菌为附球菌属病原菌。

2.4 病原菌ITS 区的序列系统发育分析

对菌株 GF-1 的 ITS rDNA 的 PCR 扩增产物进行测序、校对、剪切和拼接，获得全长为552 bp的序列。将序列与 GenBank 中的相关数据进行一致性分析，结果表明菌株 GF-1的ITS 序列（TSB1G643013）与甘蔗的高粱附球菌（E. sorghinum，MN493119.1）序列一致性最高，为99.62%，而与白及中分离的高粱附球菌（E. sorghinum，MF948994.1）序列一致性为98.88%。将这些序列利用MEGA 5.0构建系统进化树，该序列与甘蔗分离的高粱附球菌（E. sorghinum，MN493119.1）聚为同一族，亲缘关系最近，与已分离鉴定的白及高粱附球菌（E. sorghinum，MF948994.1）的亲缘关系相对较远，后者与烟草高粱附球菌（E. sorghinum，KJ767080.1）聚为同一族，这可能是因致病菌自身容易变异而引起的，这些病原菌在分子进化方向上存在一定差异（图5）。

2.5 中药材提取物对白及根腐病致病菌的抑制效果

中药材提取物对根腐病致病菌的抑制效果如图6和表2所示。与含无菌水培养的菌落（对照）相比，培养基中分别含有0.1、0.2 g·mL^-1的7种中药材提取物能够完全抑制GF-1菌落的生长。当培养基中添加低浓度（0.05 g·mL^-1）的提取物时，肉桂和丁香提取物仍能完全抑制菌落的生长，八角提取物抑制菌的生长率达到99.6%；而低浓度的青钱柳、白及、厚朴和蛇床子却不能完全抑制菌落生长，菌落直径分别为13.8、25.6、6.6、9.9 mm，抑制生长率分别为82.4%、58.8%、96.8%、90.2%。

3 讨论与结论

3.1 白及根腐病病原菌的鉴定

根腐病是由腐霉、镰刀菌、疫霉等多种病原菌侵染引起的一种病害。根腐病病原菌首先引起根部腐烂，造成根部水分和养分的吸收功能逐渐减弱，随后导致整株叶片发黄、枯萎，最后全株死亡。除了这些典型特征外，本研究还发现白及根腐病会导致白及的茎基部和叶鞘出现褐色长条形斑块，这一特点与曾令祥等（2012）报道的丝核菌属病原菌（Rhizoctonia sp.）引起白及块茎腐烂病症状相似。根腐病发病率高，对药材产量和品质危害很大，目前已成为影响三七、白术、黄芪等多种药用植物生产的主要病害，并发现镰刀属真菌为主要病原菌（沈清清等，2014）。孙乐乐等（2013）报道，引起云南地区白及根腐病的病原菌是尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和腐皮镰刀菌（F. solani）；宋莉沙（2019）鉴定了贵州地区白及根腐病致病菌是腐皮镰刀菌（F. solani）。本研究通过调查、致病菌分离，结合形态学和分子序列鉴定，发现引起广西桂林地区白及根腐病的致病菌与前人（Perelló &Moreno，2005; Aldo et al.，2010；Oliveira et al.，2017；朱香，2018；Zhou et al.，2018）的报道不同，鉴定为附球菌属真菌高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）。该病菌鉴定时间较晚，国内于2018年后才逐渐报道，引起多种园艺植物叶斑病、褐斑病或环斑病（Yu et al.，2019；Laurel et al.，2021）。该致病菌引起白及叶斑病（Zhou et al.，2018）的叶片出现褐色斑块，周围有黄色晕圈；而本研究发现该病菌早期引起白及地下块茎腐烂，有腥臭味，后期导致茎基部和叶鞘基部长条形灰褐色斑块，斑块中央呈干枯状、周围黄色晕圈；而分子序列聚类则不是同一族，亲缘关系相对较远，这说明可能属于不同生理小种引起的不同病害。

3.2 中草药提取物对白及根腐病病原菌的抑制效应

化学农药常用于药用植物根腐病的防治，虽然具有疗效快、操作方便、价格低廉等优点，但易造成农药残留量超标，从而影响药材的品质；而植物源杀菌剂具有安全无毒害的作用，但控制药用植物根腐病的效果较慢，并且易受环境影响（穆向荣等，2014）。丁香酚是丁香提取物的主要成分，通过干扰微生物的细胞膜结构起到抗菌作用（于未博，2020）；北细辛主要化学成分为萜类化合物，具有提高免疫力功能、抗菌等功效，蛇床子主要成分蛇床子素具有较好的速效性（马伟，2010；肖瑶，2019）；刘莹等（2009）发现厚朴主要活性成分厚朴酚具有抗炎抗菌等作用；赵庆芳等（2011）发现同种物质丙酮溶液的抑菌效果明显好于水溶液。高粱附球菌 （E. sorghinum）能分泌一种类似于苯乙酸的毒素，不仅具有很强的致病性（朱香，2018），而且该病原菌寄主范围广泛，易感染葫芦科、豆科、十字花科、杨柳科、禾本科、马齿苋科、百合科及天南星科的植物（李润根等，2020）。目前，未见有关该致病菌的生物防治研究。本研究利用乙醇提取了7种中药材的提取物，观察了对白及致病病原菌的室内抑制作用，发现0.1 g·mL^-1和0.2 g·mL^-1的青钱柳、白及、厚朴、八角、肉桂、蛇床子、丁香的提取物均能完全抑制高粱附球菌（E. sorghinum）的生长，0.05 g·mL^-1的八角、肉桂和丁香的提取物也基本能完全抑制生长，抑制生长率达到99.6%或100%。因此，这些中药材提取物室内抑制菌的生长非常显著，而室外田间抑制效果以及施用浓度却还有待进一步研究。

参考文献