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剑叶凤尾蕨（Pteris ensiformis）为凤尾蕨属植物，又名细叶凤尾草、凤尾草、井栏草、凤凰草、井边茜，在我国分布于华南、西南、华东及台湾等地，以全草或根茎入药（张艳等，2016；Shi et al.，2017）。剑叶凤尾蕨有清热利湿、活血破瘀、消肿解毒的功效（Liva et al.，2009；潘炉台等，2012；管玉格等，2018），可用于痢疾、黄疸、淋证、跌打损伤等疾病的治疗（管玉格等，2018）。有研究表明，剑叶凤尾蕨中含有二萜类、倍半萜类、黄酮类、酚酸类等化合物（张艳等，2016；Hou et al.，2020），其中二萜类和倍半萜类化合物具有一定的抗肿瘤活性，而二萜类化合物抗肿瘤活性较好，尤其是母核为对映-贝壳杉烷型的二萜，如pterisolic acid C能有效控制人胃癌细胞BGC-823、人结肠癌细胞HCT-116和肝癌细胞Hep G2（张艳等，2016），但尚未发现有关黔产剑叶凤尾蕨化学成分和生物活性研究的报道。因此，为更深入研究黔产剑叶凤尾蕨植物的化学成分，以获得更多含量较高、活性较强、低毒性的天然化学成分，本课题从黔产剑叶凤尾蕨醇提物中分离得到15个化合物，经波谱数据分析分别鉴定为2-羟基-乙酰基吡咯（1）、N-（3-羧丙基）-2-乙酰基吡咯（2）、3-羟基-2-甲基吡啶（3）、N-甲基羟胺（4）、pterosin S 13-O-glucoside（5）、obtupterosin C（6）、ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid（7）、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid（8）、β-谷甾醇（9）、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside（10）、5，5′-二丁氧基-2，2′-双环呋喃（11）、5，5′-二（2-乙基-己氧基）-2，2′-双环呋喃（12）、黑麦草内酯（13）、丁二酸（14）、富马酸（15）。化合物1为新天然产物，除化合物8和化合物9外，其余化合物均为首次从剑叶凤尾蕨中分离得到，其中化合物1、3、4为首次从凤尾蕨属中分离得到。本研究初步探究了部分化合物的抗肿瘤及抗凝血活性，在浓度为40 μmol·L-1时，化合物1、2、3、5、6、10可抑制肿瘤细胞HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231和SW480的体外肿瘤生长；当样品浓度为2.0 mmol·L-1时，化合物1、2、3、5、6显示出不同程度的抗凝血活性。
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1 仪器与材料
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Bruker Avance NEO 600 MHz核磁共振光谱仪、Bruker Daltonics Compact质谱仪（德国BRUKER仪器公司）；ICAN傅立叶变换红外光谱仪（天津市能谱科技有限公司）；X-5显微熔点测定仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；WFH-203B三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；柱色谱硅胶（100~200目、200~300目、300~400目，青岛海洋化工厂分厂）；CHP 20P 75~150 μm MCI GEL（日本三菱化学公司）；30~60目聚酰胺（台州市路桥四甲生化塑料厂）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、冰醋酸（贵州祥辉仪器有限公司，AR）。
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Cellometer mini细胞计数仪（美国Nexelom公司）；370 CO2培养箱、MULTISKAN FC酶标仪（美国Thermo公司）; MC-4000血凝仪（德国美创医疗仪器生产贸易有限公司）；093UK-K272A凝血质控血浆、APTT试液、PT试液、TT试液（德国TECO公司）；HL-60白血病细胞、A549肺癌细胞、SMCC-7721肝癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞、SW480结肠癌细胞（美国ATCC公司）；N1001A顺铂、D1106A紫杉醇（美仑生物科技公司）；MTS试剂盒（美国Promega公司）。
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试验药材采自贵州省黔东南苗族侗族自治州黎平县，经贵州中医药大学赵俊华教授鉴定为凤尾蕨科凤尾蕨属植物剑叶凤尾蕨（Pteris ensiformis），植物凭证标本存放于贵州中医药大学生药学实验室。
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2 提取与分离
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干燥剑叶凤尾蕨药材19.5 kg。常温下用95%工业甲醇浸渍，每次7 d，共浸渍提取7次（95%甲醇提取1次，90%甲醇提取3次，70%甲醇提取3次），合并提取液，减压回收溶剂得到浸膏约7.8 kg。将浸膏用适量温水溶解，采用液-液萃取法，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇进行萃取，分别减压回收溶剂得到石油醚部位1 590 g、乙酸乙酯部位340 g、正丁醇部位2 550 g。
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乙酸乙酯部位（340 g）采用MCI树脂（GELCHP 20P）反相柱色谱初步分离，以甲醇-水为洗脱系统（3∶7、1∶1、3∶2、7∶3、4∶1、9∶1、10∶0）进行梯度洗脱，得到Fr.A~Fr.G共7个组分。Fr.A（172 g）经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-乙酸乙酯（30∶1→0∶1）、乙酸乙酯-甲醇（20∶1→1∶1）进行梯度洗脱，结合重结晶得到化合物3（23 mg），将剩余流分按TLC检测结果合并，分别得到Fr.A-1~Fr.A-6。Fr.A-1（45 g）经硅胶柱色谱，结合凝胶柱色谱及重结晶等方法，得到化合物11（23 mg）、1（29 mg）、4（8 mg）。Fr.B（41 g）经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇（100∶1→1∶1）进行梯度洗脱，得到Fr.B-1~Fr.B-6。Fr.B-1、Fr.B-2经硅胶柱色谱及重结晶，得到化合物13（76 mg）、2（20 mg）、8（18 mg）。Fr.C（17 g）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（20∶1→3∶1）进行洗脱，重结晶后得到化合物7（34 mg），并得到6个组分Fr.C-1~Fr.C-6。Fr.C-3和Fr.C-5经多次硅胶柱色谱、凝胶柱层析及重结晶，得到化合物9（384 mg）和化合物12（7 mg）。将Fr.C剩余样品部分与Fr.D合并（12 g），经C18反相柱色谱，以甲醇-水（1∶1、3∶2、7∶3、85∶15、10∶0）进行梯度洗脱，得到Fr.CD-1~Fr.CD-3。其中，Fr.CD-1经硅胶柱色谱，结合凝胶柱色谱与重结晶得到化合物10（64 mg）。
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正丁醇部位（2 550 g）经硅胶柱色谱，以乙酸乙酯-甲醇（1∶0、50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1）进行梯度洗脱，得到Fr.H~Fr.N共7个组分。Fr.H（220 g）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（15∶1→1∶1）进行洗脱，得到Fr.H-1~Fr.H-5。其中，Fr.H-4（57 g）经硅胶柱色谱，结合凝胶柱色谱及重结晶得到化合物14（45 mg）。
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Fr.I（383 g）经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（30∶1→3∶1）进行洗脱，得到Fr.I-1~Fr.I-5。Fr.I-3经反复硅胶柱色谱及重结晶得到化合物15（14 mg）。Fr.L（397 g）经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（50∶1→1∶1）进行洗脱，得到Fr.L-1~Fr.L-7。Fr.L-4（48 g）经C18反相柱色谱，以甲醇-水（1∶1、3∶2、7∶3、85∶15、10∶0）进行梯度洗脱，得到Fr.L-4-1~Fr.L-4-5。其中，Fr.L-4-2经硅胶柱色谱及重结晶得到化合物6（29 mg）和化合物5（57 mg）。
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3 结构鉴定
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化合物1 白色结晶（甲醇），熔点（melting point，mp）：111.9~131.1℃；在254 nm的紫外波长下观察有荧光。HR-ESI-MS数据显示， [M+Na]+ m/z 148.036 4（计算值C6H7NO2Na，148.036 9），确定该化合物的分子式为C6H7NO2，不饱和度为4。红外光谱（IR）数据显示，在1 644.7 cm-1处有吸收提示可能有羰基，在3 311.4 cm-1处有吸收提示可能有羟基。
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由1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）数据可知，δH 7.09（1H，dd，J = 2.4，1.4 Hz），7.00（1H，dd，J = 3.9，1.4 Hz），6.24（1H，dd，J = 3.9，2.4 Hz）推测该化合物可能含有2个双键上的氢信号，δH 4.63（2H，s）推测为连氧碳上的氢信号且与季碳相连。由13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）数据可知，化合物1有6个碳信号，其中δC 189.9推测为1个羰基碳信号，δC 65.2推测有1个连氧碳信号，δC 130.1、126.6、117.4、111.2推测可能有2个双键上的碳信号。结合13C-NMR和DEPT谱可推断出该化合物含有6个碳，其中1个亚甲基、3个次甲基和2个季碳。综合以上数据，可初步推断出该化合物为吡咯生物碱类化合物。
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由1H-1H COSY谱可知，δH 6.24（H-4）与δH 7.00（H-3）、7.09（H-5）相关，可推出C3-C4-C5片段。据NOESY谱中δH 4.63（H-7）与δH 7.00（H-3）相关且在HMBC谱中，δH 4.63（H-7）与δC 189.9（C-6）有相关信号，显示该羟甲基连接在C-6位。δH 6.24（H-4）与δC 117.4（C-3），126.6（C-5），130.1（C-2）有相关信号，δH 7.00（H-3）与δC 111.2（C-4），126.6（C-5），130.1（C-2）有相关信号，δH 7.09（H-5）与δC 117.4（C-3），111.2（C-4），130.1（C-2）有相关信号。
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综上所述，鉴定化合物1的结构如图1所示，此化合物为新天然产物，命名为2-羟基-乙酰基吡咯。化合物的HMBC、1H-1H COSY、NOESY谱相关信号见图2，具体核磁数据见表1。
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图1 化合物1的结构式
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Fig.1 Structural formula of Compound 1
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图2 化合物1的结构及主要1H-1H COSY、HMBC相关
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Fig.2 Structure and key 1H-1H COSY, HMBC correlations of Compound 1
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化合物2 C10H13NO3，白色结晶（甲醇）。HR-ESI-MS： [M+Na]+ m/z 218.078 7。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.11（1H，dd，J = 4.1，1.7 Hz，H-3），7.04（1H，t，J = 2.1 Hz，H-5），6.16（1H，dd，J = 4.1，2.5 Hz，H-4），4.36（2H，t，J = 6.9 Hz，H-1′），2.42（3H，s，H-7），2.22（2H，t，J = 7.4 Hz，H-3′），2.00~1.96（2H，m，H-2′）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ: 131.0（C-2），122.8（C-3），109.4（C-4），132.7（C-5），190.3（C-6）， 27.1（C-7），49.6（C-1′），27.7（C-2′），31.5（C-3′），176.6（C-4′）。以上数据与文献（李蒙等，2019）报道一致，故鉴定化合物2为N-（3-羧丙基）-2-乙酰基吡咯。
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化合物3 C6H7NO，白色结晶（甲醇）。HR-ESI-MS： [M+H]+ m/z 110.060 0。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.85（1H，dd，J = 4.9，1.4 Hz，H-6），7.16（1H，dd，J = 8.2，1.4 Hz，H-4），7.08（1H，dd，J = 8.2，4.9 Hz，H-5），2.39（3H，s，H-7）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：147.5（C-2），153.8（C-3），123.4（C-4），123.7（C-5），139.2（C-6），18.4（C-7）。以上数据与文献（段洁等，2009）报道一致，故鉴定化合物3为3-羟基-2-甲基吡啶。
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化合物4 白色粉末。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：4.17（1H，m，-NH），3.17（3H，d，J = 5.1 Hz，-CH3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：48.8（-NCH3）。以上数据与文献（张宝等，2018）报道一致，故鉴定化合物4为N-甲基羟胺。
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化合物5 白色结晶（DMSO）。HR-ESI-MS： [M+Na]+ m/z 435.161 8，C20H28O9。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.44（1H，s，H-4），5.03（1H，d，J = 4.8 Hz，H-14β），4.87（1H，d，J = 5.6 Hz，H-14α），4.61（1H，t，J = 4.8 Hz，H-3），4.18（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1′），3.81（1H，d，J = 8.2 Hz，H-13α），3.65（1H，d，J = 6.4 Hz，H-6′α），3.61（1H，d，J = 8.7 Hz，H-13β），3.42（1H，s，H-6′β），3.13（1H，d，J = 4.5 Hz，H-5′），3.10（2H，d，J = 7.8 Hz，H-12），3.09（1H，d，J = 3.7 Hz，H-3′），3.04（1H，d，J = 9.1 Hz，H-4′），2.96（1H，d，J = 8.3 Hz，H-2′），2.44（3H，s，H-11），2.43~2.40（1H，m，H-2），1.21（3H，d，J = 7.3 Hz，H-10）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：205.1（C-1），53.5（C-2），73.8（C-3），126.3（C-4），145.0（C-5），137.3（C-6），138.6（C-7），131.0（C-8），154.0（C-9），12.7（C-10），20.8（C-11），28.9（C-12），68.3（C-13），54.8（C-14），103.0（C-1′），73.6（C-2′），77.0（C-3′），70.2（C-4′），76.9（C-5′），61.2（C-6′）。以上数据与文献（Murakami et al.，1985）报道一致，故鉴定化合物5为pterosin S 13-O-glucoside。
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化合物6 白色结晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.51（2H，s，H-4，4′），5.11（2H，d，J = 12.1 Hz，H-14α，14′α），5.00（2H，d，J = 12.1 Hz，H-14β，14′β），4.74（2H，d，J = 4.1 Hz，H-3，3′），4.25（2H，d，J = 7.8 Hz，Glc-1，1′），4.06（2H，d，J = 7.4 Hz，H-13α，13′α），3.84（2H，s，Glc-6α，6′α），3.69（2H，d，J = 9.6 Hz，H-13β，13′β），3.66（2H，s，Glc-6β，6′β），3.31（2H，s，Glc-3，3′），3.27（2H，s，Glc-2，2′），3.26（2H，s，Glc-5，5′），3.21（4H，d，J = 7.9 Hz，H-12，12′），3.19（2H，s，Glc-4，4′），2.52（6H，s，H-11，11′），1.34（6H，d，J = 7.3 Hz，H-10，10′）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：207.8（C-1，1′），54.9（C-2，2′），76.1（C-3，3′），127.7（C-4，4′），147.3（C-5，5′），138.5（C-6，6′），139.6（C-7，7′），132.9（C-8，8′），155.3（C-9，9′），13.0（C-10，10′），21.5（C-11，11′），29.9（C-12，12′），70.2（C-13，13′），57.8（C-14，14′），104.6（Glc-1，1′），71.6（Glc-2，2′），78.0（Glc-3，3′），75.1（Glc-4，4′），78.0（Glc-5，5′），62.7（Glc-6，6′）。以上数据与文献（Peng et al.，2020）报道一致，故鉴定化合物6为obtupterosin C。
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化合物7 C20H30O4，白色结晶（甲醇）。HR-ESI-MS： [M+Na]+ m/z 357.203 6。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：3.88（1H，d，J = 5.4 Hz，H-11′），2.43~2.37（2H，m，H-6），2.26（1H，p，J = 6.8 Hz，H-2′），2.17~2.12（1H，m，H-7′），1.95（1H，d，J = 3.1 Hz，H-12′），1.92（1H，s，H-16），1.90（1H，d，J = 3.1 Hz，H-1′），1.89（1H，d，J = 2.7 Hz，H-12），1.88~1.83（1H，m，H-13），1.80（1H，ddd，J = 13.6，11.7，2.5 Hz，H-3′），1.73（1H，td，J = 13.3，3.5 Hz，H-9），1.47~1.42（1H，m，H-2），1.42~1.38（1H，m，H-7），1.38~1.34（1H，m，H-5），1.23（3H，d，J = 6.9 Hz，H-17），1.21（3H，s，H-20），1.18（2H，d，J = 12.4 Hz，H-14），1.13~1.08（1H，m，H-1），1.06（1H，dd，J = 13.5，4.4 Hz，H-3），0.96（3H，s，H-18）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：40.6（C-1），20.0（C-2），39.0（C-3），44.6（C-4），57.5（C-5），21.3（C-6），36.3（C-7），52.5（C-8），62.3（C-9），39.7（C-10），65.7（C-11），34.4（C-12），35.9（C-13），38.3（C-14），224.8（C-15），50.6（C-16），11.5（C-17），29.4（C-18），181.3（C-19），16.0（C-20）。以上数据与文献（Maosong et al.，2016）报道一致，故鉴定化合物7为ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid。
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化合物8 C20H28O4，白色结晶（甲醇）。HR-ESI-MS： [M+Na]+ m/z 355.187 9。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：5.72（1H，s，H-17），5.24（1H，s，H-17），4.01（1H，d，J = 4.6 Hz，H-11），3.03（1H，d，J = 4.0 Hz，H-13），2.43（1H，d，J = 11.8 Hz，H-9），1.22（3H，s，H-19），0.99（3H，s，H-20）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ： 40.9（C-1），20.1（C-2），39.0（C-3），44.7（C-4），57.5（C-5），21.2（C-6），37.8（C-7），52.0（C-8），63.7（C-9），40.0（C-10），66.7（C-11），41.4（C-12），38.5（C-13），35.3（C-14），212（C-15），152.2（C-16），112.7（C-17），29.5（C-18），181.4（C-19），16.3（C-20）。以上数据与文献（张德志等，1990）报道一致，故鉴定化合物8为ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid。
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化合物9 白色针状结晶（氯仿）。1H-NMR（600 MHz，Chloroform-d）δ：5.35（1H，d，J = 4.5 Hz，H-6），3.56~3.48（1H，m，H-3），1.00（3H，s，CH3-19），0.92（3H，d，J = 6.4 Hz，CH3-21），0.84（3H，d，J = 2.5 Hz，CH3-29），0.82（3H，d，J = 6.5 Hz，CH3-26），0.80（3H，s，CH3-27），0.67（3H，s，CH3-18）；13C-NMR（150 MHz，Chloroform-d）δ：37.4（C-1），32.1（C-2），72.0（C-3），42.5（C-4），140.9（C-5），121.9（C-6），31.8（C-7），32.1（C-8），50.3（C-9），36.7（C-10），21.2（C-11），39.9（C-12），42.4（C-13），56.9（C-14），24.5（C-15），28.4（C-16），56.2（C-17），12.0（C-18），18.9（C-19），36.3（C-20），19.2（C-21），34.1（C-22），26.2（C-23），46.0（C-24），29.3（C-25），20.0（C-26），19.5（C-27），23.2（C-28），12.1（C-29）。以上数据与文献（Song et al.，2013）报道一致，故鉴定化合物9为β-谷甾醇。
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化合物10 C26H38O9，白色结晶（甲醇）。HR-ESI-MS： [M+Na]+ m/z 517.240 8。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：5.71（1H，s，H-17α），5.41（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1′），5.23（1H，s，H-17β），4.00（1H，d，J = 4.3 Hz，H-11），3.83（1H，d，J = 11.9 Hz，H-13），3.69（1H，dd，J = 12.0，4.1 Hz，H-9），3.40（1H，d，J = 9.1 Hz，H-3′），3.37（1H，s，H-4′），3.36（1H，d，J = 1.3 Hz，H-5′），3.35（1H，s，H-2′），3.03~3.00（2H，m，H-6′），2.47（1H，d，J = 12.0 Hz，H-14α），2.21（1H，d，J = 13.1 Hz，H-3β），2.10~2.06（1H，m，H-2α），2.04~1.98（1H，m，H-1β），1.97（1H，s，H-2β），1.94（2H，d，J = 3.2 Hz，H-6），1.83~1.77（1H，m，H-7β），1.48~1.44（1H，m，H-14β），1.38~1.37（1H，m，H-7α），1.35（2H，s，H-12），1.26（3H，s，H-18），1.23（1H，d，J = 6.7 Hz，H-5），1.14~1.11（1H，m，H-1α），1.09（1H，d，J = 4.1 Hz，H-3α），0.99（3H，s，H-20）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：40.8（C-1），19.9（C-2），38.9（C-3），45.0（C-4），58.0（C-5），21.0（C-6），37.7（C-7），52.0（C-8），63.6（C-9），40.1（C-10），66.8（C-11），41.3（C-12），38.5（C-13），35.3（C-14），212.1（C-15），152.4（C-16），112.6（C-17），29.0（C-18），178.0（C-19），16.3（C-20），95.6（C-1′），74.0（C-2′），78.7（C-3′），71.1（C-4′），78.7（C-5′），62.4（C-6′）。以上数据与文献（Kazuo et al.，1977）报道一致，故鉴定化合物10为ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside。
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化合物11 C16H22O4，白色油状物。HR-ESI-MS： [M+Na]+ m/z 301.141 0。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.71（2H，dd，J = 5.7，3.4 Hz，H-3，3′），7.66（2H，dd，J = 5.7，3.4 Hz，H-4，4′），4.21（4H，t，J = 6.6 Hz，H-6，6′），1.66~1.60（4H，m，H-7，7′），1.39~1.33（4H，m，H-8，8′），0.88（6H，dt，J = 22.5，7.5 Hz，H-9，9′）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：131.8（C-2，2′），128.8（C-3，3′），131.7（C-4，4′），167.2（C-5，5′），65.2（C-6，6′），30.1（C-7，7′），18.8（C-8，8′），13.7（C-9，9′）。以上数据与文献（Liu et al.，2010）报道一致，故鉴定化合物11为5，5′-二丁氧基-2，2′-双环呋喃。
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化合物12 C24H38O4，黄色油状物。HR-ESI-MS： [M+Na]+ m/z 413.266 2。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：7.72（2H，d，J = 9.1 Hz，H-3，3′），7.62（2H，d，J = 9.1 Hz，H-4，4′），4.31~4.21（4H，m，H-6，6′），1.71（2H，dt，J = 20.5，6.6 Hz，H-7，7′），1.49~1.43（4H，m，H-12，12′），1.44~1.40（4H，m，H-8，8′），1.39（4H，m，H-10，10′），1.36~1.33（4H，dd，J = 19.3，7.4 Hz，H-9，9′），0.97（6H，dd，J = 19.3，7.4 Hz，H-13，13′），0.93（6H，t，J = 7.4 Hz，H-11，11′）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：133.6（C-2，2′），129.9（C-3，3′），132.4（C-4，4′），169.3（C-5，5′），69.1（C-6，6′），40.2（C-7，7′），31.6（C-8，8′），30.1（C-9，9′），24.0（C-10，10′），14.4（C-11，11′），25.0（C-12，12′），11.4（C-13，13′）。以上数据与文献（Zhi et al.，2015）报道一致，故鉴定化合物12为5，5′-二（2-乙基-己氧基）-2，2′-双环呋喃。
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化合物13 白色结晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：5.75（1H，s，H-7），4.22（1H，p，J = 3.5 Hz，H-3），2.42（1H，dt，J = 13.5，2.6 Hz，H-4），1.99（1H，dt，J = 14.4，2.7 Hz，H-2），1.76（3H，s，H-11），1.74（1H，d，J = 4.2 Hz，H-4a），1.53（1H，dd，J = 14.5，3.8 Hz，H-2），1.46（3H，s，H-9），1.28（3H，s，H-10）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：174.5（C-2），113.3（C-3），185.7（C-3a），37.2（C-4），47.9（C-5），67.2（C-6），46.4（C-7），89.0（C-7a），27.0（C-8），31.0（C-9），27.4（C-10）。以上数据与文献（Yang et al.，2020）报道一致，故鉴定化合物13为黑麦草内酯。
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化合物14 白色结晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：2.52（4H，s，H-2，3）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：176.2（C-1，4），29.8（C-2，3）。以上数据与文献（李燕等，2007）报道一致，故鉴定化合物14为丁二酸。
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化合物15 白色结晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，Methanol-d4）δ：6.76（2H，s，H-2，3）；13C-NMR（150 MHz，Methanol-d4）δ：168.0（C-1，4），135.2（C-2，3）。以上数据与文献（谭冰心等，2017）报道一致，故鉴定化合物15为富马酸。
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化合物1-15的结构式如图3所示。
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4 抗肿瘤、抗凝血活性筛选结果
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4.1 抗肿瘤活性筛选结果
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选取化合物1、2、3、5、6、10，采用MTS法对HL-60白血病细胞、 A549肺癌细胞、SMMC-7721肝癌细胞、MDA-MB-231乳腺癌细胞和SW480结肠癌细胞进行筛选，以顺铂（cisplatin，DDP）、紫杉醇（taxol）作为阳性对照。由表2可知，6个化合物对HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231、SW480肿瘤细胞均显示出不同的抗肿瘤活性。
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图3 化合物1-15的结构式
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Fig.3 Structural formulas of compounds 1-15
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4.2 抗凝血活性筛选结果
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通过测定化合物1、2、3、5、6、10人质控血浆活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）和凝血酶时间（thrombin time，TT）的影响来进行抗凝血活性测定，APTT和TT两组是以依诺肝素（enoxaparin，LMWH）为阳性对照，PT组是以肝素（heparin，HEP）为阳性对照。由表3可知，与空白对照组（control，Con.）相比，当样品浓度为2.0 mmol·L-1时，化合物1、2、3、6对APTT有微弱缩短作用，化合物1、5、6对PT有微弱延长作用。
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注：与空白对照比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。
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Note: Comparison with blank control, * represents P＜0.05，** represents P＜0.01，*** represents P＜0.001.
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5 讨论与结论
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本研究共分离得到15个化合物，其中化合物1为新天然产物，除化合物8、9外，其余化合物均为首次从剑叶凤尾蕨中分离获得。经查阅文献，化合物6对HCT-116细胞表现出细胞毒活性（段洁等，2009），化合物8具有抗肿瘤、抗炎、抗血小板聚集等药理活性（姜纪武等，1996），化合物9具有降胆固醇、降血糖、抗氧化、抗炎、抑菌等作用（陈跃平等，2021）。本研究对化合物1、2、3、5、6、10进行了抗肿瘤及抗凝血活性筛选。在浓度为40 μmol·L-1时，6个化合物均可抑制肿瘤细胞HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231及SW480的体外肿瘤生长；在样品浓度为2.0 mmol·L-1时，化合物1、2、3、6对APTT有缩短作用，化合物1、5、6对PT有延长作用。
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综上所述，本试验结果丰富了黔产剑叶凤尾蕨的化学成分及生物活性，显示黔产剑叶凤尾蕨中的化学成分结构多样且在抗肿瘤方面具有潜在的应用前景，为剑叶凤尾蕨植物在药用价值上的开发利用提供了物质基础及科学依据。但是，该文未对每种肿瘤细胞进行多种细胞系研究，有待进一步研究。
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摘要
为研究剑叶凤尾蕨（Pteris ensiformis）的化学成分，该研究选用硅胶、凝胶、MCI、C18等柱色谱进行分离纯化，结合1H-NMR、13C-NMR、MS、IR等波谱数据鉴定化合物结构，并通过MTS和APTT、PT以及TT等方法对所分离得到的部分单体化合物进行抗肿瘤和抗凝血活性筛选。结果表明：（1）从剑叶凤尾蕨中分离得到15个化合物，分别为2-羟基-乙酰基吡咯（1）、N-(3-羧丙基)-2-乙酰基吡咯（2）、3-羟基-2-甲基吡啶（3）、N-甲基羟胺（4）、pterosin S 13-O-glucoside（5）、obtupterosin C（6）、ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid（7）、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid（8）、β-谷甾醇（9）、ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside（10）、5, 5′-二丁氧基-2, 2′-双环呋喃（11）、5, 5′-二 (2-乙基-己氧基)-2, 2′-双环呋喃（12）、黑麦草内酯（13）、丁二酸（14）、富马酸（15）。化合物1为新的吡咯生物碱类天然产物，化合物1-7、10-15为首次从剑叶凤尾蕨中分离得到，化合物1、3、4为首次从凤尾蕨属植物中分离得到。（2）活性测试结果表明，在浓度为40 μmol·L-1时，化合物1、2、3、5、6、10对肿瘤细胞HL-60、A549、SMMC-7721、MDA-MB-231及SW480的体外肿瘤生长有抑制作用；在样品浓度为2.0 mmol·L-1时，化合物1、2、3、6对APTT有缩短作用，化合物1、5、6对PT有延长作用。该研究结果丰富了黔产剑叶凤尾蕨的化学成分，为抗肿瘤药物的研发提供了物质基础。
Abstract
To study the chemical constituents of Pteris ensiformis, silica gel, gel, MCI, C18 and other column chromatography were used for separation and purification, and their structures were identified by 1H-NMR, 13C-NMR, MS, IR and othe spectral data; the anti-tumor and anti-coagulation activities of some monomers were screened by MTS, APTT, PT and TT. The results were as follows： (1) A total of 15 compounds were isolated from P. ensiformis, the compounds were 2-hydroxy-acetylpyrrole (1), N-(3-carboxypropyl)-2-acetylpyrrole (2), 3-hydroxy-2-methylpyridine (3), N-methylhydroxylamine (4), pterosin S 13-O-glucoside (5), obtupterosin C (6), ent-11α-hydroxy-15-oxokauran-19-oic acid (7), ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid (8), β-sitosterol (9), ent-11α-hydroxy-15-oxokaur-16-en-19-oic acid-O-glucopyranoside (10), 5, 5′-dibutoxy-2, 2′-bifuran (11), 5, 5′-di(2-ethyl-hexyloxy)-2, 2′-bifuran (12), (-)-loliolide (13), succinic acid (14), fumaric acid (15). Compound 1 is a new natural product of pyrrole alkaloids. Compounds 1-7, 10-15 were isolated from P. ensiformis for the first time, and compounds 1, 3, 4 were isolated from Pteris for the first time. (2) The results of activity test showed that compounds 1, 2, 3, 5, 6 and 10 inhibited the growth of tumor cells HL-60, A549, SMMC-7721, MDA-MB-231 and SW480 in vitro at a concentration of 40 μmol·L-1, At the concentration of 2.0 mmol·L-1, compounds 1, 2, 3 and 6 shortened APTT and compounds 1, 5 and 6 prolonged PT. The study enriches the chemical constituents of P. ensiformis from Guizhou and provides a material basis for the development of anti-tumor drugs.
