禾本科植物果实类型多为颖果，其果皮不开裂且与种皮高度愈合，难以分离，故又称为种子（本文通称为种子）（伍虹雨等，2023）。种子是植物的生殖器官之一，一般由胚、胚乳及皮层构成。胚是种子萌发成苗的关键，而胚乳为胚的生长发育及萌发提供能源支持和营养物质，皮层则是种子的保护结构（金银根，2018）。禾本科植物种子具有极为发达的胚乳组织，前人研究认为胚乳组织占种子总体积的90%左右（林树燕等，2011），胚则占2%~3%的体积（陈娟，2006）。目前，禾本科植物种子胚和胚乳发育已有相关研究报道，如扬州大学王忠团队对水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）以及玉米（Zea mays）等传统农业作物在不同处理条件下胚和胚乳的发育展开研究，分析农作物胚和胚乳的发育对不同条件的响应机理（陈娟，2006；陈义芳等，2009；王敏，2011；荆彦平，2014；李栋梁，2014； 邵珊珊等，2018；郝朵，2021）；罗富成等（2016）、李造哲等（2016）、杨小菊等（2000）、孟庆沂（2020）使用石蜡切片方法对纳罗克非洲狗尾草（Etaria sphacelata cv. Narok.）、披碱草（Elymus dahuricus）、龙须草（Eulaliopsis binata）与偃麦草（Elytrigia repens）种子的发育进行研究，为该植物生殖生物学研究奠定基础。由于竹类植物开花现象较为少见，种子材料较难采集，因此关于竹类植物胚和胚乳的发育研究较少，仅有林树燕等（2011）和伍虹雨等（2023）系统研究异叶苦竹（Arundinaria simonii f. heterophyllus）、金佛山方竹（Chimonobambusa utilis）种子发育过程中胚和胚乳的发育；而黄新红（2008）、乔士义和廖光庐（1984）仅对成熟期种子或是发育初期的种子进行胚或胚乳的研究，缺少整个发育过程中胚和胚乳的变化。

毛竹（Phyllostachys edulis）隶属于禾本科（Poaceae）刚竹属（Phyllostachys），为大型常绿散生竹，是经济价值较高的优质笋材两用竹种（Chen et al.，2006）。毛竹是我国种植面积最广、研究最多的竹种，在生物量（苏文会等，2019；王树梅等，2021）、基因表达（李真等，2021；袁婷婷等，2021）、群落结构（李领寰，2015；王秀云等，2022）以及种子表型（徐振国等，2020；梁梅华等，2022）等方面具有深入研究。此外，关于毛竹生殖生物学已有相关研究报道，乔士义和廖光庐（1984）采集开花初期毛竹子房，通过切片方式观察毛竹受精过程以及初生胚乳核分裂，初步分析了毛竹种子开花初期胚和胚乳的发育形态，但未对毛竹种子整个发育过程中胚和胚乳的形态发育进行研究；孙立方（2012）对毛竹花器官形态结构、花序及花药发育、花粉形态及双受精作用展开深入研究，揭示了毛竹开花前后生殖器官的形态变化，但是未过多涉及毛竹种子发育过程中胚和胚乳的研究。综上认为，禾本科植物生殖生物学研究大多集中在水稻、小麦等传统农作物以及披碱草、偃麦草等材料易采集的植物，而竹类植物因开花少见、材料采集不易而导致相关研究较少。近年来，桂林海洋山一带毛竹开花结实现象较为常见，为开花结实研究提供契机。本研究以桂林海洋山为研究区域，以开花毛竹为研究材料，采用石蜡制片法观察毛竹种子胚、胚乳及皮层的发育，拟探讨以下问题：（1）毛竹胚的发育特征和营养供给；（2）毛竹胚乳的发育特征和营养供给；（3）毛竹果皮、种皮的发育特征。旨在完善毛竹生殖生物学相关内容，为进一步了解竹类植物胚和胚乳的发育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点位于桂北地区灌阳县，地理位置为110°45′32″ E、25°16′42″ N，海拔高度为822 m。该地区属于中亚热带气候，夏热冬冷，四季分明，年均气温为17.9℃，年均降水量为1 540.7 mm，年均日照时间为 1 400.2 h。试验林地为毛竹天然林，土壤类型为红土，林下植物多为耐荫杂草和灌木，如五节芒 （Miscanthus floridulus）、半边旗（Pteris semipinnata）、蕨（Pteridium aquilinum var. latiusculum）、四蕊朴（Celtis tetrandra）、茯苓（Poria cocos）等。

1.2 样品采集

2022年5月，在开花前对样地内毛竹进行每木检尺，测定毛竹胸径、年龄、株高、枝下高以及郁闭度等林分因子。试验地毛竹为天然林，共有开花毛竹52株，均为多年生毛竹，无当年生及二年生毛竹，平均胸径为8.3 cm。试验地毛竹于2022年6月10日进入开花期，6月20日进入盛花期（开花面积超过总面积的二分之一）。于毛竹盛花期至种子成熟期间（2022年6月20日—8月20日），挑选3株胸径接近、生长状况一致、无病虫害的毛竹，将其压弯后使用马克笔点颖和挂牌标记的方式记录开花时间。前30 d每日固定100粒自然授粉的子房，后30 d每间隔10 d固定100粒发育期种子。将采集到的样品使用双面刀片横切，后按部位分别置于盛有FAA固定液[V（70%酒精）∶V（冰乙酸）∶V（甲醛）=18∶1∶1]的玻璃瓶中进行固定。

1.3 试验方法

将固定的种子经不同浓度酒精梯度脱水，经1/2酒精+1/2二甲苯、100%二甲苯（2次）透明后，放入1/2二甲苯+1/2石蜡的溶液中在42℃烘箱中过夜，次日将其置于60℃的石蜡溶液中浸蜡，间隔3~4 h更换1次石蜡溶液，共更换3次。后经包埋、制片及脱蜡复水，使用铁矾-苏木精染色后经不同浓度酒精脱水，使用固绿复染，后正常脱水透明、中性树胶封片。显微镜（Nikon Eclipse Ni-U）下观察拍照。

2 结果与分析

2.1 毛竹种子胚发育

毛竹种子胚的发育与水稻、燕麦（Avena sativa）、金佛山方竹以及异叶苦竹等禾本科单子叶植物种子胚的发育过程较为相似，可大致分为5个阶段：合子阶段、原胚阶段、胚芽鞘阶段、幼胚生长阶段以及成熟阶段。毛竹种子在花后1 d进入合子阶段，精卵细胞结合形成受精卵，另一精细胞与极核结合生成初生胚乳核，在形成受精卵后合子陷入休眠期（图版I：A）。原胚阶段发生在花后5~28 d，在花后5 d左右合子进行第一次有丝分裂并形成具有基细胞和顶细胞的两细胞原胚（图版I：B）。此后，顶细胞先纵裂后横向分裂形成三细胞原胚，后顶细胞向不同方向不断分裂形成多细胞原胚（图版I：C-E）；在花后24 d左右多细胞原胚不断分裂分化形成的种胚呈圆形，又称球形胚（图版I：F），后种胚进一步纵向和横向分裂分化在花后28 d左右形成梨形胚（图版I：G）。在花后30 d左右毛竹种胚进入胚芽鞘阶段，该时期种胚一侧分化出现凹陷，形成胚芽鞘原基（图版I：H）。在花后40 d左右毛竹种胚进入成熟阶段，该阶段毛竹种胚器官分化已基本完成，具备盾片、胚芽鞘、胚根鞘、外胚叶、胚根、胚轴等器官，并且分化形成5个完全叶原基（图版I：I）。胚的形态分化完成后，进一步积累营养物质，并进行生理上的充实，经过脱水后胚便进入休眠期（图版I：J）。由于未采集花后30~40 d之间的毛竹种子样品，因此未得到该时期种胚石蜡切片，但结合花后30、40 d的切片可推测，该阶段为幼胚生长阶段，种胚由胚芽鞘阶段迅速分裂分化形成盾片、胚芽、胚根及胚轴等基本结构。在毛竹胚的发育过程中，胚柄细胞仅进行少数几次分裂，并随着胚的分化形成达到成熟（花后40 d），胚柄细胞逐渐消失。

图版 I 毛竹胚的发育过程

Plate I Embryo development of Phyllostachys edulis

2.2 毛竹种子胚乳发育

毛竹种子胚乳发育类型与多数禾本科植物一致，为核型胚乳发育类型。按照禾本科植物胚乳发育过程，可将毛竹种子胚乳发育分为4个阶段：游离核时期、细胞化时期、细胞分化时期以及成熟期。花后1~5 d毛竹胚乳进入游离核时期，毛竹种子在双受精作用后产生初生胚乳核，初生胚乳核在该时期不断进行核分裂且不产生细胞壁（图版Ⅱ：A、B）。由于游离核不间断分裂以及中央液泡的增大，因此游离核被挤向胚囊壁边缘，沿胚囊壁分布，在该时期胚囊体积增长较快。花后6 d左右毛竹胚乳进入细胞化时期，在胚附近的游离核出现细胞质丝后形成细胞壁，其后胚囊壁边缘游离核逐渐形成细胞壁。随着细胞化进程的推移，形成细胞壁的胚乳细胞开始向心、向合点端分裂，在花后20 d左右整个胚囊中基本无游离核存在，细胞化期基本完成。细胞化后期在部分胚乳细胞中发现小型淀粉粒，主要分布在细胞核附近（图版Ⅱ：B-H）。花后20 d左右毛竹胚乳进入细胞分化时期，约在花后30 d结束细胞分化。在该时期靠近胚囊壁附近的数层胚乳表层细胞分化形成糊粉层细胞，除糊粉层外的细胞则分化形成淀粉胚乳细胞。糊粉层胚乳细胞发育特点为其细胞形态明显小于淀粉胚乳细胞，其细胞核较大，细胞质较浓，与淀粉胚乳细胞相比淀粉较少。淀粉胚乳细胞发育特点为其分化时间较早，在细胞化末期便开始分化，细胞内部已开始积累淀粉粒，随着细胞分化期的推移淀粉粒逐渐增加充满整个细胞（图版Ⅱ：I-N）。花后30 d毛竹胚乳进入成熟阶段，直至种子成熟。在该阶段淀粉胚乳细胞开始程序性死亡，其细胞壁逐渐解体，细胞核逐渐消失。细胞壁的解体以及淀粉粒不断堆积，导致淀粉胚乳细胞中呈现淀粉叠加在一起的现象（图版Ⅱ：O-T）。而糊粉层细胞仍保持完整，具有细胞核、细胞膜等基本结构且与种皮紧密贴合，随着发育周期的推移，糊粉层细胞由数层减少至1层。在成熟期间，糊粉层细胞内部也在积累营养物质，该营养物质呈小颗粒状。在各时期切片中均有退化后的珠心细胞，随着毛竹种子不断的发育，退化后的珠心细胞也在不断消解，花后60 d仅剩4~5层将要完全消解的珠心细胞。

2.3 毛竹种子果皮和种皮的发育

毛竹种子具有果皮和种皮，其中果皮由子房壁发育而来，种皮则由珠被发育而来。花后1 d（合子阶段），珠被细胞有4~18层，其细胞较小，呈规整的四边形，细胞核明显。果皮细胞则分为内果皮、中果皮及外果皮3部分，其中内果皮与珠被细胞相连，有3~5层，其细胞形态较小且呈长方形；中果皮为薄壁组织，细胞形态极不规整且远大于内果皮细胞、珠被细胞以及外果皮细胞，具有明显的细胞核及较浓的细胞质；外果皮有4~8层，细胞呈正方形，细胞核极为明显（图版Ⅲ：A、A-1、A-2）。

发育至花后10 d（多细胞原胚阶段），珠被细胞层数开始减少，由4~18层减少至4~10层，形态及大小则无变化；内果皮细胞层数由3~5层减少至2~4层，形态也存在减小的趋势；中果皮细胞增大并呈不规则形状，部分中果皮细胞内部的小颗淀粉粒围绕在细胞核周围，该时期中果皮细胞分裂活动旺盛，在部分细胞中能观测到双细胞核现象；外果皮由4~8层减少至2~6层，形状也由正方形转变为长方形，远离胚的一端外果皮层数越多，离胚越近外果皮层数则越少（图版Ⅲ：B、B-1、B-2）。发育至花后20 d（多细胞原胚阶段），珠被细胞层数进一步减少，由4~10层减少至2~4层，形状呈长方形，细胞壁较厚并呈现黄色（未染色前）；内果皮层数由2~4层减少至2~3层，细胞形态呈圆形；中果皮细胞增大，呈不规则形状，并具有更多的淀粉粒，靠近维管束附近的中果皮形态与其他部分中果皮具有显著性差异，维管束附近中果皮细胞形态更多呈长条形；外果皮层数由2~6层减少至2~4层（图版Ⅲ：C、C-1、C-2）。

发育至花后30 d（胚芽鞘阶段），珠被细胞大多仅剩2层，靠近维管束部分有4层；内果皮细胞仅剩1层，紧密贴合珠被细胞；中果皮细胞逐渐破裂，细胞膜、细胞壁等逐渐消解，靠近维管束部分中果皮细胞则被挤压变小，形态与珠被、内果皮细胞无异；外果皮细胞则呈长方形，细胞相较于之前时期更为修长，并且仅有外层细胞具有细胞核（图版Ⅲ：D、D-1、D-2）。发育至花后40 d（成熟胚阶段），珠被细胞仅剩1层；内果皮细胞紧密贴合珠被细胞；靠近维管束的中果皮细胞逐步消解，仅部分细胞具有细胞核，而远离维管束部分则无中果皮，仅剩外果皮、内果皮与种皮； 外果皮细胞呈长条形，进一步变长且具有细胞核 （图版Ⅲ：E、E-1、E-2）。花后50~60 d，靠近维管束的内果皮、中果皮及外果皮内含物质基本消失，仅剩角质化细胞壁的残体（图版Ⅲ：F-G-2）。

图版 Ⅱ 毛竹胚乳的发育过程

Plate Ⅱ Endosperm development of Phyllostachys edulis

图版 Ⅲ 毛竹种子皮层结构

Plate Ⅲ Cortical structure of Phyllostachys edulis

3 讨论与结论

3.1 胚发育特征及营养供给

乔士义和廖光庐（1984）仅观测毛竹子房1室、胚珠1枚、花粉和胚囊的发育基本同步以及受精过程，未对毛竹胚的发育有进一步认知；孙立方（2012）对成熟毛竹种子进行解剖，简单描述毛竹成熟胚、果皮等结构。本文系统研究毛竹胚的发育过程，阐述毛竹胚在不同发育阶段的形态演变，认为毛竹胚的发生与水稻（王敏，2011）、燕麦（董瑞峰，2008）、异叶苦竹（林树燕等，2011）等植物相似，属于禾本型，其成熟胚具有胚芽、胚根、胚轴、外胚叶等禾本科植物特征。与其他禾本科植物相比，毛竹胚的发育具有以下特点：（1）禾本科植物经过双受精作用形成合子后，合子会陷入短暂的休眠状态，毛竹休眠时间相对较长，为4~5 d，与异叶苦竹相似。而小麦、燕麦休眠时长为1~2 d，水稻休眠时长为8~10 h。（2）禾本科植物由合子阶段到胚的形成需要一定的发育时间，毛竹由合子到胚的形成所需时间最长，为40 d左右，而异叶苦竹所需时间较长约30 d，水稻、燕麦等需要14 d左右。（3）毛竹胚的发育过程中出现球形原胚，与水稻、燕麦、华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）、寒竹（Chimonobambusa marmorea）等禾本科植物发育过程较为相似。但异叶苦竹、金佛山方竹与毛竹有所差异，在其发育过程中并未出现球形原胚。（4）毛竹虽与金佛山方竹、异叶苦竹等同属于竹亚科植物，但在种胚形态上具有显著差异。金佛山方竹种胚呈不规则形状，盾片体积占比较大；异叶苦竹种胚呈细长的三角形，盾片体积占比也较大。毛竹成熟种胚形态呈直角三角形或等腰三角形，与巨龙竹种胚相似，并且种胚中盾片体积较小。（5）在合子阶段观察到反足细胞迅速增殖，由合点端转移至胚囊边缘，在合子进行第一次有丝分裂前消失。反足细胞存在时间为2~3 d，略短于异叶苦竹。

前人研究认为，反足细胞一般在受精前或受精后消失，在受精前后其主要功能是运输珠心细胞营养物质，提供胚囊发育所需营养（杨小菊等，2000；王丽和赵桂仿，2002；林树燕等，2011；李造哲等，2016），这与本研究结果相符合。本研究认为在受精后，胚的营养供给不仅来源于反足细胞，还可能来源于胚囊壁、胚柄以及胚乳细胞。金银根（2018）指出大多数被子植物胚囊表面具有吸收机能，能够消化周边的珠心细胞及珠被细胞，吸收营养物质以供胚乳和胚的正常发育。本研究发现在胚乳和胚的发育过程中，珠心细胞逐渐消失，而胚乳细胞不断分裂分化逐渐充满珠心，消失的珠心细胞可能是被胚囊表面所消化，为胚乳和胚提供营养。经观察发现，胚柄连接着珠心组织以及珠被细胞，由此可以推测胚的分裂分化所需营养物质可能由胚柄细胞进行运输、传递；在花后40 d未发现胚柄细胞，其原因可能是胚的分裂分化已基本形成，可通过胚乳细胞供给营养物质，因此胚柄细胞消失不见；在不同发育阶段的胚的周边发现破碎的胚乳细胞以及仅剩细胞壁的胚乳细胞，并且随着种子的发育最终仅剩细胞壁的胚乳细胞被堆积在一起，由此可以推测胚能够通过表皮细胞吸收程序化死亡的胚乳细胞营养物质来维持自身的分裂分化活动；或者是仅剩细胞壁的胚乳细胞负责运输胚发育所需营养物质。

3.2 胚乳发育特征及营养供给

本研究发现，毛竹种子胚乳类型为核型胚乳，其发育早于胚的发育，这与前人的研究结果一致（乔士义和廖光庐，1984；董瑞峰，2008；林树燕等，2011；王敏，2011）。毛竹胚乳发育与异叶苦竹、小麦等禾本科植物相比，仅在发育周期方面有所差异，在胚乳细胞分裂分化的各阶段的形态特征、营养物质积累等方面均表现一致。毛竹种子胚乳的发育经历游离核时期、细胞化时期、细胞分化期及成熟时期4个阶段，不同阶段的胚乳细胞呈不同特征。花后1~5 d为游离核时期，受精极核不断分裂形成胚乳细胞核并分布在胚囊壁附近，该阶段尚未产生细胞壁。花后6~20 d为细胞化时期，该时期游离细胞核形成细胞壁并不断分裂，进而充满整个胚囊，而珠心细胞则进一步消解。花后20~30 d为细胞分化时期，该时期胚乳细胞分化形成淀粉胚乳细胞以及糊粉层细胞，并开始积累淀粉等营养物质。花后30~60 d则为成熟时期，该阶段淀粉胚乳细胞逐步积累淀粉颗粒，并发生程序性死亡，在该过程中细胞壁、细胞核等逐步消解，淀粉胚乳细胞死亡进程由内向外逐渐扩展。虽然淀粉胚乳细胞结构基本消失，但是淀粉体及蛋白质等物质的积累尚未停止，这与王忠等（2012）的研究结果一致。在成熟过程中，糊粉层细胞也在积累颗粒状营养物质，王忠等（2012）研究认为糊粉层细胞内部的颗粒状营养物质是非淀粉胚乳细胞需要的物质，如一些矿质元素经糊粉层细胞代谢形成的植酸钙镁颗粒与蛋白质等物质结合形成复杂的糊粉粒、脂肪酸和磷酸甘油合成的脂类圆球体。在整个发育过程中，糊粉层细胞始终具备完整的细胞结构，其原因可能是糊粉层细胞在种子萌发过程中起到合成淀粉酶、蛋白酶等水解内胚乳贮藏物关键酶的作用，可认为糊粉层细胞为种子萌发过程中的养分供给起到重要的协同作用（王忠等，1995，2012；张文虎等，2012）。

本研究认为，胚乳细胞发育过程中的营养供给可能由反足细胞、胚囊壁、维管束和退化后的珠心细胞以及糊粉层细胞进行转运，并且在各时期的主要转运对象各有不同。花后1~3 d主要承担转运功能的是反足细胞和胚囊壁，反足细胞消失后则是胚囊壁，胚囊壁通过消化珠心细胞，吸收营养物质保障胚乳发育。王忠等（1995）、陈义芳等（2009）、李小刚（2013）研究认为，胚和胚乳的发育方式导致其与子房之间无胞间连丝及维管束的联系，由维管束运输来的营养物质须经过质外体途径才能输送至胚和胚乳，水稻等植物则是由糊粉层细胞及退化后的珠心细胞充当质外体。花后20 d毛竹胚乳细胞进入细胞分化时期，胚乳细胞分化形成糊粉层细胞，糊粉层细胞与退化后的珠心细胞共同形成质外体，由质外体连接维管束，接受并运输来自维管束的营养物质。

3.3 果皮和种皮的发育特征

在种子发育过程中皮层主要功能是运输、合成营养物质及保护胚和胚乳的发育（金银根，2018）。

毛竹种子具有种皮和果皮，种皮由珠被细胞发育而来，果皮由子房壁发育而来。珠被细胞在发育过程中层数呈递减趋势，由4~18层减少至1层，其细胞形态由规整的正方形转变成长方形，细胞壁逐渐增厚，内含物逐渐消失，仅剩细胞壁。果皮分为内果皮、中果皮及外果皮3部分，内果皮连接珠被细胞，随着种子发育，其最终与珠被细胞紧密结合形成种皮；中果皮为薄壁组织，内含叶绿体，可进行光合作用并合成营养物质，是毛竹种子在发育过程中呈绿色的原因；外果皮则是主要的保护结构，其细胞壁较厚，能承受胚乳体积增大带来的机械压力（顾蕴洁等，2002；王利凯，2008；刘大同等，2017）。在毛竹种子发育过程中，内果皮细胞层数由3~5层减少至1层，形态由长方形逐渐转变成圆形，花后30 d与珠被细胞紧密结合。中果皮细胞层数较多，形态极不规整并远大于内果皮细胞、珠被细胞以及外果皮细胞，花后1~20 d中果皮细胞逐渐变大、增多，细胞开始合成淀粉粒等营养物质以供给皮层、胚乳和胚的发育。花后20 d胚乳细胞充满整个胚囊，进入营养物质积累阶段，随着胚乳细胞营养物质的积累及体积的增大，向外产生机械压力挤压果皮，而中果皮作为薄壁组织无较厚的细胞壁等组织，因此中果皮细胞承受机械压力较大，开始解体。随着种子的不断发育，中果皮解体速度加快，至花后40 d远离维管束组织的中果皮基本解体完毕，靠近维管束组织的中果皮细胞仍然存在。直至花后50~60 d毛竹种子成熟，中果皮细胞内含物基本消失，仅剩角质化细胞壁的残体，其与外果皮一同形成保护结构。在毛竹种子发育过程中外果皮细胞层数由4~8层逐渐减少为1层，细胞形态由正方形逐渐转变为长条形，细胞壁逐渐增厚，细胞内含物逐渐消解。花后50~60 d外果皮与仅剩角质化细胞壁残体的中果皮结合，最终形成保护结构。毛竹种子果皮、种皮发育与小麦、水稻、异叶苦竹、寒竹等植物较为一致，均表现为随着种子的成熟以及胚乳体积的增大，中果皮细胞逐渐失去活力，与外果皮细胞、种皮细胞等共同形成保护结构。但毛竹种子果皮的发育与金佛山方竹有所区别，金佛山方竹果实隶属于浆果，其果皮细胞并未随着种子的成熟而消解。

参考文献