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奶牛乳房炎是我国奶牛养殖业的常见疾病，主要是由金黄色葡萄球菌、链球菌、无乳链球菌等引起的炎症（王丽芳等，2020）。目前，奶牛乳房炎的防治主要依靠抗生素，但抗生素的长期滥用会引起耐药菌的产生，威胁公共卫生安全（徐鸿润等，2021）。临床上，中草药被广泛用于细菌感染、炎症消除等疾病的防治，因其毒副作用较小，且不易产生耐药性（张晓东等，2021），为抗奶牛乳房炎药物的研究提供了新思路。研究表明，中草药的天然有效成分可以直接抑制致病菌的生长繁殖，减弱其致病性，雪白睡莲花、蒲公英、连翘、金银花等提取物均对奶牛乳房炎的致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有明显的抑制作用（钟华晨等，2020; 刘丹丹等，2021）; 中草药中皂苷类、黄酮类等天然活性成分可以通过影响炎症因子的分泌，增强免疫能力，抵御致病菌的入侵进而降低奶牛乳房炎的发病率（候昆等，2019）。
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大青（Clerodendrumcyrtophyllum）又称路边青、山大青，为马鞭草科大青属植物，主要分布于我国华东、中南、西南（四川除外）各省区（裴鉴和陈守良，1982）。《本草纲目》中记载大青味苦性寒，有清热解毒的功效。在贵州省黔东南苗族地区，大青是一味常用的民族药物，苗医用大青的水煎液内服来治疗小儿感冒发烧，疱疹病毒感染如口疮、带状疱疹等疾病（陆科闵和王福荣，2006）。大青提取物具有一定的抗菌活性（白云霄等，2013），但其中的活性成分未被阐明。因此，为深入探究大青中抗菌活性成分，拟为大青抗奶牛乳房炎药物的研发提供基础研究数据。本研究以黔产大青为研究对象，依托民族医药研究平台，采用现代色谱分离手段、现代波谱学技术和现代药理学方法，拟探讨以下问题:（1）黔产大青乙醇提取物的化学成分;（2）分离得到的部分化合物的抗菌活性。
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1 材料与方法
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1.1 材料、仪器和试剂
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1.1.1 材料
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大青药材采自于贵州省贵定县云雾镇，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为马鞭草科大青属植物大青（Clerodendrumcyrtophyllum）。凭证标本（GZQSY2015D45）存放于贵州民族大学天然药物化学实验室。乳房链球菌（Streptococcus uberis）、无乳链球菌（S. agalactiae）由广东省农业科学院提供。
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1.1.2 仪器和试剂
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Avance NEO400型核磁共振波谱仪（德国 BruKer 公司）; Xevo G2-S QTof型质谱仪（美国 Waters 公司）; UltiMate3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）; XBridge BEH C18半制备型色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm，美国 Waters 公司）; Rotavapor R-3型数显旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）; LiChroperp RP-18（40~63 μm，德国 Merck 公司）; Sephedex LH-20（瑞典 Pharmacia 公司）; 柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂公司产品）; ZF-6型三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）; HZT-A1000型电子天平（福州闽衡电子仪器有限公司）; DB-1型电热板（常州国华电器有限公司）; 全波长酶标仪（芬兰 Thermo 公司）; 全自动酶标仪（美国 BioTek 公司）; MTT噻唑蓝（北京 Solarbio 生物科技有限公司）; PBS磷酸缓冲液（北京 Solarbio 生物科技有限公司）; SDS十二烷基硫酸钠（分析纯，美国 Sigma 公司）; 甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等分析纯试剂（成都科隆化学品有限公司）; 甲醇、乙腈等色谱纯试剂（上海星可高纯溶剂有限公司）; 显色剂为5%硫酸乙醇溶液。
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1.2 方法
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1.2.1 提取与分离
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将25 kg干燥的大青（地上部分）粉碎，用95%乙醇热回流提取3次，每次2 h，提取液合并，经减压浓缩后得到粗浸膏1 136 g。粗浸膏用水混悬，得到悬浮液，然后依次用等体积的石油醚、二氯甲烷、正丁醇进行萃取，之后分别对其进行减压浓缩得到石油醚部位172 g，二氯甲烷部位41 g，正丁醇部位429 g，水部位373 g。
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取石油醚部位103 g，经硅胶柱（石油醚∶乙酸乙酯=200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、5∶1、1∶1）梯度洗脱，得到13个不同流分，石油醚∶乙酸乙酯=200∶1洗脱得到流分Fr.a，石油醚∶乙酸乙酯=100∶1洗脱得到流分Fr.b1-2，石油醚∶乙酸乙酯=50∶1洗脱得到流分Fr.c1-2，石油醚∶乙酸乙酯=20∶1洗脱得到流分Fr.d1-3，石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脱得到流分Fr.e1-3，石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脱得到流分Fr.f1-2。Fr.b1经反复重结晶得到化合物1（589.5 mg）; Fr.b2经硅胶柱（石油醚∶乙酸乙酯=50∶1）、Sephadex LH-20 柱（二氯甲烷∶甲醇=1∶1）洗脱得到化合物2（8.4 mg）、3（10.2 mg）。Fr.d1经反复重结晶得到化合物4（114.2 mg）; Fr.d2经硅胶柱（石油醚∶乙酸乙酯=30∶1）、Sephadex LH-20 柱（二氯甲烷∶甲醇=1∶1）洗脱得到化合物5（7.2 mg）; Fr.d3经硅胶柱（石油醚∶乙酸乙酯=20∶1）洗脱得到化合物6（9.1 mg）。Fr.e2经硅胶柱（石油醚∶乙酸乙酯=10∶1）洗脱得到化合物7（9.8 mg）。Fr.f1经硅胶柱（二氯甲烷∶甲醇=30∶1）、2次Sephadex LH-20 柱（二氯甲烷∶甲醇=1∶1）洗脱得到化合物8（18.3 mg）; Fr.f2经硅胶柱（二氯甲烷∶甲醇=30∶1）洗脱得到化合物9（52.1 mg）。
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取正丁醇部位397 g，经大孔树脂D101柱以乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）梯度洗脱，得到11个不同流分，30%乙醇洗脱流分Fr.A; 50%乙醇洗脱流分Fr.B1-3; 70%乙醇洗脱流分Fr.C1-4; 90%乙醇洗脱流分Fr.D1-2; 100%乙醇洗脱流分Fr.E。Fr.B2经反相RP-18柱分离，甲醇-水（35%~100%）梯度洗脱，得到Fr.B2-1~Fr.B2-4。取Fr.B2-3经2次Sephadex LH-20 柱（甲醇）洗脱，得到化合物11（11.7 mg）; 经半制备高效液相色谱（C18柱，水∶乙腈=78∶22）分离，得到化合物10（19.2 mg）。取Fr.B3经反相RP-18柱分离和甲醇-水（35%~100%）梯度洗脱，得到Fr.B3-1~Fr.B3-3，取Fr.B3-2经Sephadex LH-20 柱（甲醇）分离和硅胶（二氯甲烷∶甲醇=30∶1~1∶1）梯度洗脱，得到化合物12（27.4 mg）。Fr.C1经反相RP-18柱分离和甲醇-水（30%~100%）梯度洗脱，得到Fr.C1-1~Fr.C1-5。取Fr.C1-2经Sephadex LH-20 柱（甲醇）分离和半制备高效液相色谱（乙腈∶0.1%磷酸水溶液=18∶82）纯化后得到化合物13（21.1 mg）、14（15.3 mg）。Fr.C2经反相RP-18柱分离和甲醇-水（30%~100%）洗脱后，得到Fr.C2-1~Fr.C2-4。取Fr.C2-1经2次Sephadex LH-20 柱（二氯甲烷∶甲醇=1∶1）、硅胶柱（二氯甲烷∶甲醇=20∶1）洗脱得到化合物15（37.4 mg）; 取Fr.C2-2经Sephadex LH-20 柱（二氯甲烷∶甲醇=1∶1）、硅胶柱（二氯甲烷∶甲醇=12∶1）洗脱，反复重结晶得到化合物16（29.5 mg）; 取Fr.C2-3经两次Sephadex LH-20 柱（二氯甲烷∶甲醇=1∶1）、半制备高效液相色谱（水∶甲醇=56∶44）洗脱，得到化合物17（7.7 mg）。Fr.C3经反相RP-18柱分离和甲醇-水（35%~100%）洗脱后，得到Fr.C3-1~Fr.C3-4。取Fr.C3-3经Sephadex LH-20 柱（甲醇）、硅胶柱（二氯甲烷∶甲醇=20∶1）洗脱，得到化合物18（53.2 mg）。
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1.2.2 抗菌活性实验
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抗菌活性测定参考课题组前期建立的一种定量检测细菌活菌数的MTT方法（马林玉等，2021），取适量乳房链球菌、无乳链球菌分别接种于肉汤培养基，于37℃培养12 h，分别将菌液稀释至106 CFU·mL-1，备用。取96孔培养板，每孔加入菌液90 μL，将96孔板划分DMSO阴性对照组、氨苄青霉素阳性对照组和8个浓度的给药组，每组设置3个复孔，取10 μL样品溶液加入给药组各孔。于37℃暗培养24 h（无乳链球菌无氧环境）。每孔加入45 μL 0.5 mg·mL-1 MTT溶液。空白凋零组加入与MTT等量的PBS，继续避光培养4 h。显色的菌液离心（12 000 r·min-1、4℃、10 min），弃上清液，加入125 μL DMSO。向已完全溶解的产物中加入150 μL的SDS，取200 μL混合溶液转移至96孔板中，用全自动酶标仪测定OD570。
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2 结果与分析
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2.1 结构鉴定
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化合物1 无色针状结晶，C30H50O，ESI-MS m/z:449.4 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:1.18（3H，s，H-28），1.05（3H，s，H-27），1.01（3H，s，H-30），1.00（3H，s，H-26），0.95（3H，s，H-29），0.88（3H，d，J = 6.5 Hz，H-23），0.87（3H，s，H-25），0.72（3H，s，H-24）; 13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:22.41（C-1），41.65（C-2），213.36（C-3），58.34（C-4），42.27（C-5），41.41（C-6），18.37（C-7），53.22（C-8），37.57（C-9），59.60（C-10），35.47（C-11），30.12（C-12），39.38（C-13），38.42（C-14），32.55（C-15），36.14（C-16），30.63（C-17），42.91（C-18），35.75（C-19），28.30（C-20），32.90（C-21），39.82（C-22），6.96（C-23），14.79（C-24），18.08（C-25），18.80（C-26），20.39（C-27），32.22（C-28），35.16（C-29），31.92（C-30）。以上数据与文献（Toshihiro et al.，1992）一致，故鉴定化合物1为木栓酮。
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化合物2 白色油状物，C46H80O2，ESI-MS m/z:687.4 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.12（1H，t，J = 3.6 Hz，H-12），4.51（1H，m，H-3），2.29（1H，m，H-2′），1.07（3H，s，H-27），1.01（3H，s，H-25），0.98（3H，s，H-26），0.92（3H，d，J = 7.2 Hz，H-30），0.91（3H，s，H-23），0.89（3H，s，H-24），0.89（3H，d，J = 6.7 Hz，H-29），0.80（3H，s，H-28）; 13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:38.59（C-1），23.79（C-2），80.75（C-3），37.90（C-4），55.41（C-5），18.40（C-6），33.02（C-7），40.18（C-8），47.78（C-9），36.95（C-10），23.52（C-11），124.48（C-12），139.78（C-13），42.22（C-14），28.81（C-15），26.76（C-16），33.90（C-17），59.21（C-18），39.76（C-19），39.80（C-20），31.40（C-21），41.69（C-22），28.24（C-23），17.01（C-24），15.88（C-25），16.97（C-26），23.39（C-27），28.24（C-28），17.66（C-29），21.55（C-30）; 173.88（C-1′），35.02（C-2′），34.58-22.85（C-3′-15′），14.28（C-16′）。以上数据与文献（Fatma et al.，2016）一致，故鉴定化合物2为α-amyrin palmitate。
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化合物3 无定形白色粉末，C46H80O2，ESI-MS m/z:687.6 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:4.69（1H，s，H-29），4.57（1H，s，H-29），4.47（1H，dd，J = 10.6，5.7 Hz，H-3），2.30（2H，t，J = 7.5 Hz，H-2′），1.68（3H，s，H-30），1.03（3H，s，H-27），0.94（3H，s，H-24），0.86（3H，s，H-23），0.79（3H，s，H-16′）; 13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:37.98（C-1），23.89（C-2），80.78（C-3），38.51（C-4），55.52（C-5），18.14（C-6），34.35（C-7），40.99（C-8），50.48（C-9），38.19（C-10），21.09（C-11），25.32（C-12），37.23（C-13），42.97（C-14），27.58（C-15），35.71（C-16），43.14（C-17），48.43（C-18），48.15（C-19），151.10（C-20），29.85（C-21），40.14（C-22），28.11（C-23），16.12（C-24），16.72（C-25），16.31（C-26），14.66（C-27），18.35（C-28），109.50（C-29），19.43（C-30）; 173.89（C-1′），35.01（C-2′），25.24（C-3′），29.32-29.97（C-4′-13′），32.08（C-14′），22.84（C-15′），14.27（C-16′）。以上数据与文献（Lin &Tome，1988）一致，故鉴定化合物3为sambuculin A。
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化合物4 无色针状结晶，C29H46O，ESI-MS m/z:433.3 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.35（1H，d，J = 3.5 Hz，H-6），5.24（1H，dd，J = 15.3，7.9 Hz，H-22），5.21（1H，dd，J = 12.7，7.5 Hz，H-23），4.69（2H，m，H-27），3.93（1H，m，H-3），1.25（3H，s，H-19），1.65（3H，s，H-26），1.02（3H，d，J = 4.7 Hz，H-21），0.83（3H，t，J = 7.6 Hz，H-29），0.69（3H，s，H-18）; 13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:37.33（C-1），31.72（C-2），71.92（C-3），42.34（C-4），140.82（C-5），121.80（C-6），31.98（C-7），32.02（C-8），50.23（C-9），36.60（C-10），21.15（C-11），39.76（C-12），42.35（C-13），56.93（C-14），24.40（C-15），29.79（C-16），55.96（C-17），12.14（C-18），19.48（C-19），40.28（C-20），20.88（C-21），137.29（C-22），130.12（C-23），52.08（C-24），148.71（C-25），20.31（C-26），109.60（C-27），25.79（C-28），12.23（C-29）。以上数据与文献（Kitajima &Tanaka，1993）一致，故鉴定化合物4为22-dehydroclerosterol。
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化合物5 无色油状物，C20H28O3，ESI-MS m/z:339.2 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:6.12（1H，m，H-3′），5.76（1H，s，H-9），2.38-2.44（2H，m，H-2），2.07（3H，s，H-13），1.98（3H，d，J = 1.5 Hz，H-5′），1.89（3H，s，H-4′），1.87（3H，s，H-12），1.04（3H，s，H-14），1.02（3H，d，J = 6.8 Hz，H-15）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:31.46（C-1），29.70（C-2），73.27（C-3），46.28（C-4），42.23（C-5），40.77（C-6），127.79（C-7），192.36（C-8），125.67（C-9），167.43（C-10），144.29（C-11），20.96（C-12），21.46（C-13），16.16（C-14），9.80（C-15）; 167.58（C-1′），126.93（C-2′），137.56（C-3′），14.57（C-4′），19.36（C-5′）。以上数据与文献（Wang et al.，2014）一致，故鉴定化合物5为isopetasin。
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化合物6 无色针状结晶，C46H80O2，ESI-MS m/z:703.6 [M+K]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:4.64（2H，d，J = 7.1 Hz，H-30），4.48（1H，dd，J = 10.7，5.6 Hz，H-3），1.04（3H，s，H-27），1.03（3H，s，H-26），1.00（3H，s，H-25），0.99（3H，s，H-28），0.90（3H，s，H-23），0.88（3H，s，H-24），0.87（3H，d，J = 6.0 Hz，H-29），0.84（3H，s，H-16′）; 13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ:38.44（C-1），23.71（C-2），80.55（C-3），37.85（C-4），55.47（C-5），18.17（C-6），33.98（C-7），40.95（C-8），49.94（C-9），37.02（C-10），21.40（C-11），25.18（C-12），38.75（C-13），42.33（C-14），25.87（C-15），40.01（C-16），35.28（C-17），47.65（C-18），38.54（C-19），153.66（C-20），25.04（C-21），39.02（C-22），27.97（C-23），16.57（C-24），15.89（C-25），16.36（C-26），14.14（C-27），26.30（C-28），19.25（C-29），107.40（C-30）; 173.75（C-1′），34.05（C-2′），25.18（C-3′），29.69（C-4′-C-13′），31.94（C-14′），22.71（C-15′），18.10（C-16′）。以上数据与文献（Patra et al.，1981）一致，故鉴定化合物6为taraxasteryl palmitate。
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化合物7 白色针状结晶，C29H48O，ESI-MS m/z:451.4 [M+K]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.35（1H，d，J = 5.1 Hz，H-6），5.15（1H，dd，J = 15.2，8.6 Hz，H-22），5.02（1H，dd，J = 15.2，8.6 Hz，H-23），3.53（1H，m，H-3），1.01（3H，s，H-19），0.92（3H，d，J = 6.5 Hz，H-21），0.85（3H，d，J = 3.5 Hz，H-27），0.83（3H，d，J = 1.7 Hz，H-26），0.81（3H，d，J = 4.5 Hz，H-29），0.68（3H，s，H-18）; 13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:37.39（C-1），29.29（C-2），71.96（C-3），42.46（C-4），140.89（C-5），121.87（C-6），32.04（C-7），32.04（C-8），50.27（C-9），36.65（C-10），21.23（C-11），39.82（C-12），42.42（C-13），56.91（C-14），24.45（C-15），29.07（C-16），56.19（C-17），12.00（C-18），19.54（C-19），40.64（C-20），21.23（C-21），138.46（C-22），129.41（C-23），51.38（C-24），31.78（C-25），21.36（C-26），19.17（C-27），25.55（C-28），12.12（C-29）。以上数据与文献（贾瑞芳等，2021）一致，故鉴定化合物7为豆甾醇。
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化合物8 无色油状物，C52H88O7，ESI-MS m/z:847.6 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ:5.35（1H，d，J = 3.3 Hz，H-6），5.23（1H，dd，J = 15.2，7.8 Hz，H-22），5.17（1H，dd，J = 15.2，7.1 Hz，H-23），4.70（2H，m，H-27），4.37（1H，d，J = 7.6 Hz，H-1′），1.99（3H，s，H-26），1.02（3H，s，H-19），1.01（3H，d，J = 6.6 Hz，H-21），0.99（3H，s，H-18），0.81（3H，s，H-29），0.69（3H，s，H-17″）; 13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ:37.30（C-1），31.95（C-2），79.72（C-3），39.70（C-4），140.36（C-5），122.06（C-6），34.29（C-7），31.88（C-8），50.19（C-9），36.72（C-10），21.08（C-11），38.93（C-12），42.27（C-13），56.87（C-14），25.00（C-15），28.72（C-16），55.92（C-17），12.06（C-18），19.38（C-19），40.23（C-20），20.85（C-21），137.16（C-22），130.12（C-23），52.01（C-24），148.55（C-25），20.22（C-26），109.55（C-27），25.71（C-28），12.14（C-29）; 101.26（C-1′），76.18（C-2′），73.77（C-3′），73.42（C-4′），70.38（C-5′），63.57（C-6′）; 174.33（C-1″），34.29（C-2″），31.88（C-3″），29.70（C-4″-C-14″），24.33（C-15″），22.71（C-16″），14.13（C-17″）。以上数据与文献（Xu et al.，2013）一致，故鉴定化合物8为22-dehydroclerosterol-3-O-β-D-（6′-O-margaroyl）-glucopyranoside。
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化合物9 白色无定形粉末，C35H56O6，ESI-MS m/z:595.4 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ:5.33（1H，s，H-6），5.22（1H，dd，J = 12.6，4.8 Hz，H-22），5.19（1H，dd，J = 12.2，5.1 Hz，H-23），4.68（2H，s，H-27），4.22（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1′），1.61（3H，s，H-26），0.98（3H，d，J = 6.7 Hz，H-21），0.96（3H，s，H-19），0.79（3H，t，J = 7.3 Hz，H-29），0.67（3H，s，H-18）; 13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ:36.85（C-1），31.43（C-2），76.95（C-3），38.34（C-4），140.48（C-5），121.21（C-6），29.29（C-7），31.43（C-8），49.65（C-9），36.25（C-10），21.49（C-11），38.34（C-12），41.80（C-13），56.26（C-14），23.88（C-15），28.31（C-16），55.30（C-17），11.88（C-18），19.12（C-19），40.44（C-20），19.94（C-21），136.84（C-22），129.59（C-23），51.31（C-24），147.70（C-25），20.71（C-26），109.98（C-27），25.23（C-28），12.02（C-29）; 100.81（C-1′），73.49（C-2′），76.78（C-3′），70.11（C-4′），76.95（C-5′），61.11（C-6′）。以上数据与文献（Saeedan et al.，1997）一致，故鉴定化合物9为3-O-β-D-galactopyranosyl-（24β）-ethylcholesta-5，22，25-trien。
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化合物10 淡黄色粉末，C31H40O15，ESI-MS m/z:675.3 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ:7.56（1H，d，J = 15.8 Hz，H-7′），7.29（1H，d，J = 1.7 Hz，H-2′），6.82（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5′），6.40（1H，d，J = 15.8 Hz，H-8′），5.06（1H，s，H-1′′′），4.38（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1″），3.82（3H，s，3-OCH3），3.79（3H，s，3′-OCH3），2.76（2H，m，H-7），1.12（3H，d，J = 6.1 Hz，H-6′′′）; 13C-NMR（100 MHz，DMSO） δ:132.80（C-1），112.70（C-2），147.90（C-3），147.42（C-4），117.34（C-5），121.25（C-6），36.68（C-7），72.22（C-8），56.41（3-OCH3）; 127.05（C-1′），117.96（C-2′），151.54（C-3′），149.77（C-4′），115.56（C-5′），124.99（C-6′），147.80（C-7′），113.98（C-8′），167.65（C-9′），57.33（3′-OCH3）; 104.03（C-1″），76.21（C-2″），80.95（C-3″），70.51（C-4″），76.24（C-5″），62.43（C-6″）; 102.97（C-1′′′），72.07（C-2′′′），71.87（C-3′′′），73.37（C-4′′′），70.83（C-5′′′），19.79（C-6′′′）。以上数据与文献（高映等，2017）一致，故鉴定化合物10为肉苁蓉苷D。
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c化合物11 淡黄色粉末，C26H30O11，ESI-MS m/z:541.2 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:9.57（1H，d，J = 7.9 Hz，H-9′），7.61（1H，d，J = 15.7 Hz，H-7′），7.00（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2），6.86（1H，dd，J = 8.2，1.9 Hz，H-6），6.78（1H，d，J = 8.1 Hz，H-5），6.74（1H，dd，J = 8.0，16.0 Hz，H-8′），4.37（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1″），3.91（3H，s，3-OCH3），3.83（3H，s，3′-OCH3）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:133.52（C-1），110.82（C-2），149.12（C-3），147.83（C-4），116.17（C-5），119.96（C-6），90.18（C-7），52.17（C-8），71.95（C-9），56.44（3-OCH3）; 129.67（C-1′），114.39（C-2′），145.92（C-3′），152.75（C-4′），131.33（C-5′），120.29（C-6′），156.26（C-7′），127.14（C-8′），196.28（C-9′），56.76（3′-OCH3）; 104.34（C-1″），75.14（C-2″），78.03（C-3″），71.56（C-4″），78.17（C-5″），62.69（C-6″）。以上数据与文献（孟永海，2007）一致，故鉴定化合物11为 tortoside F。
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化合物12 淡黄色粉末，C20H20O6，ESI-MS m/z:379.1 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:9.58（1H，d，J = 7.8 Hz，H-9′），7.62（1H，d，J = 15.8Hz，H-7′），7.29（1H，s，H-6′），7.23（1H，d，J = 1.3 Hz，H-2′），6.95（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2），6.83（1H，dd，J = 8.2，1.8 Hz，H-6），6.78（1H，d，J = 8.1 Hz，H-5），6.69（1H，dd，J = 15.7，7.8 Hz，H-8′），5.61（1H，d，J = 6.4 Hz，H-7），3.91（3H，s，3′-OCH3），3.82（3H，s，3-OCH3）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:133.91（C-1），110.55（C-2），149.19（C-3），147.83（C-4），131.25（C-5），119.99（C-6），90.10（C-7），54.65（C-8），64.54（C-9），56.78（3-OCH3）; 129.62（C-1′），114.21（C-2′），146.02（C-3′），152.94（C-4′），130.85（C-5′），119.80（C-6′），156.16（C-7′），127.09（C-8′），196.19（C-9′），56.37（3′-OCH3）。以上数据与文献（Li et al.，2017）一致，故鉴定化合物12为balanophonin。
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化合物13 黄色粉末，C21H20O11，ESI-MS m/z:471.1 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ:12.99（1H，s，5-OH），7.44（1H，d，J=8.3，2.2Hz，H-6′），7.42（1H，d，J = 2.1 Hz，H-2′），6.90（1H，d，J = 8.3 Hz，H-5′），6.78（1H，d，J = 2.1 Hz，H-8），6.75（1H，s，H-3），6.44（1H，d，J = 2.1 Hz，H-6），5.08（1H，d，J = 7.4 Hz，H-1″）; 13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ:164.50（C-2），103.20（C-3），181.94（C-4），161.16（C-5），99.56（C-6），162.97（C-7），94.74（C-8），156.98（C-9），105.37（C-10）; 121.39（C-1′），113.60（C-2′），145.82（C-3′），149.98（C-4′），116.02（C-5′），119.21（C-6′）; 99.88（C-1″），73.15（C-2″），77.19（C-3″），69.56（C-4″），76.42（C-5″），60.63（C-6″）。以上数据与文献（周志强，2013）一致，故鉴定化合物13为木犀草苷。
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化合物14 黄色粉末，C29H36O15，ESI-MS m/z:647.2 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:7.56（1H，d，J = 12.8 Hz，H-7′），7.03（1H，d，J = 1.4 Hz，H-2′），6.92（1H，dd，J = 8.0，1.4 Hz，H-6′），6.75（1H，d，J = 6.6 Hz，H-5′），6.67（1H，d，J = 1.4 Hz，H-2），6.65（1H，d，J = 6.4 Hz，H-5），6.52（1H，dd，J = 1.4，7.8 Hz，H-6），6.25（1H，d，J = 12.7 Hz，H-8′），5.16（1H，s，H-1 J′′′），4.34（1H，d，J = 6.3 Hz，H-1″），1.06（3H，d，J = 4.9 Hz，H-6′′′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:131.39（C-1），117.07（C-2），145.94（C-3），144.49（C-4），114.55（C-5），121.26（C-6），36.41（C-7），70.33（C-8）; 127.53（C-1′），116.28（C-2′），146.66（C-3′），149.65（C-4′），116.48（C-5′），123.25（C-6′），148.01（C-7′），115.17（C-8′），168.31（C-9′）; 104.00（C-1″），76.04（C-2″），81.65（C-3″），71.91（C-4″），75.78（C-5″），62.19（C-6″）; 102.94（C-1′′′），72.18（C-2′′′），72.21（C-3′′′），73.66（C-4′′′），70.42（C-5′′′），18.40（C-6′′′）。以上数据与文献（高燕萍等，2016）一致，故鉴定化合物14为类叶升麻苷。
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化合物15 黄色粉末，C15H10O6，ESI-MS m/z:309.0 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:12.96（1H，s，5-OH），10.81（1H，s，7-OH），9.91（1H，s，3′-OH），9.39（1H，s，4′-OH），7.40（1H，dd，J = 8.3，2.3 Hz，H-6′），7.38（1H，d，J = 2.2 Hz，H-2′），6.88（1H，d，J = 8.3 Hz，H-5′），6.66（1H，s，H-3），6.43（1H，d，J = 2.1 Hz，H-8），6.18（1H，d，J = 2.0 Hz，H-6）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:164.76（C-2），102.48（C-3），182.49（C-4），161.85（C-5），98.78（C-6），164.97（C-7），93.65（C-8），158.05（C-9），103.91（C-10）; 122.32（C-1′），112.78（C-2′），145.68（C-3′），149.64（C-4′），115.41（C-5′），118.92（C-6′）。以上数据与文献（李勇军等，2005）一致，故鉴定化合物15为木犀草素。
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化合物16 白色结晶，C17H24O8，ESI-MS m/z:379.1 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，DMSO）δ:6.68（2H，s，H-3，5），6.33（1H，d，J = 16.3 Hz，H-7），6.24（1H，m，H-8），4.89（1H，d，J = 7.3 Hz，H-1′），3.76（6H，s，2-OCH3，6-OCH3），1.83（3H，d，J = 5.8 Hz，H-9）; 13C-NMR（100 MHz，DMSO）δ:134.07（C-1），153.16（C-2，6），104.54（C-3，5），133.62（C-4），131.21（C-7），125.34（C-8），18.61（C-9），56.81（2-OCH3，6-OCH3）; 103.09（C-1′），74.64（C-2′），77.66（C-3′），70.40（C-4′），77.00（C-5′），61.37（C-6′）。以上数据与文献（刘燕等，2015）一致，故鉴定化合物16为 acantrifoside E。
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化合物17 白色胶状，C32H50O13，ESI-MS m/z:665.3 [M+Na]+。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:6.47（1H，s，H-14），4.44（1H，d，J = 7.9 Hz，H-1′），4.33（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1″），3.22（1H，d，J = 7.9 Hz，H-3），1.20（3H，s，H-20），1.19（3H，d，J = 6.8 Hz，H-17），1.17（3H，d，J = 6.9 Hz，H-16），1.01（3H，s，H-18），0.86（3H，s，H-19）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:34.59（C-1），26.53（C-2），88.10（C-3），39.41（C-4），52.72（C-5），18.87（C-6），33.12（C-7），133.52（C-8），132.28（C-9），38.87（C-10），147.54（C-11），141.10（C-12），139.48（C-13），116.46（C-14），25.24（C-15），22.51（C-16），22.80（C-17），27.84（C-18），16.92（C-19），19.55（C-20）; 106.62（C-1′），73.83（C-2′），76.86（C-3′），70.31（C-4′），76.74（C-5′），61.44（C-6′）; 103.96（C-1″），74.08（C-2″），79.07（C-3″），69.66（C-4″），76.65（C-5″），60.90（C-6″）。以上数据与文献（Hu et al.，2018）一致，故鉴定化合物17为 trichotomside B。
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化合物18 淡黄色粉末，C30H38O15，ESI-MS m/z:637 [M-H]-。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ:7.59（1H，d，J = 15.8 Hz，H-7′），7.07（1H，s，H-2′），6.95（1H，d，J = 8.3 Hz，H-6′），6.80（1H，d，J = 3.2 Hz，H-5′），6.78（1H，d，J =3.2 Hz，H-2），6.73（1H，d，J = 1.8 Hz，H-5），6.66（1H，d，J = 1.8 Hz，H-6），6.28（1H，d，J = 15.9 Hz，H-8′），5.19（1H，s，H-1′′′），4.37（1H，d，J = 7.9 Hz，H-1″），3.80（3H，s，3-OCH3），2.80（2H，t，J = 6.8 Hz，H-7），1.09（3H，d，J = 6.2 Hz，H-6′′′）; 13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ:132.71（C-1），116.97（C-2），147.12（C-3），146.66（C-4），112.69（C-5），121.14（C-6），36.40（C-7），72.22（C-8），56.40（3-OCH3）; 127.53（C-1′），115.18（C-2′），147.37（C-3′），149.63（C-4′），116.48（C-5′），123.23（C-6′），147.97（C-7′），114.57（C-8′），168.27（C-9′）; 104.02（C-1″），76.03（C-2″），81.63（C-3″），71.93（C-4″），75.80（C-5″），62.22（C-6″），102.93（C-1′′′），70.43（C-2′′′），72.02（C-3′′′），73.67（C-4′′′），70.32（C-5′′′），18.42（C-6′′′）。以上数据与文献（李友宾等，2005）一致，故鉴定化合物18为肉苁蓉苷 C。
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2.2 抗菌活性结果
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采用MTT法测试大青粗提物对乳房链球菌、无乳链球菌的抗菌活性。结果显示，正丁醇部位Fr.B3、Fr.C1、Fr.D2组分对乳房链球菌有抗菌活性，IC50分别为7.02、0.89、6.79 mg·mL-1; Fr.B3、Fr.C1、Fr.C3、Fr.C4、Fr.D2 5份粗提物对无乳链球菌有抗菌活性，IC50分别为2.38、0.72、1.31、4.63、0.98 mg·mL-1。这表明Fr.C1部位具有一定的抗菌活性。
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图1 化合物1-18结构式
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Fig.1 Structures of compounds 1-18
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采用同样的方法对经过粗筛活性较好的部位Fr.C1分离得到的2个单体化合物进行抗菌活性测试，测定结果为化合物13对乳房链球菌有一定的抑制活性，MIC为0.18 mg·mL-1，对无乳链球菌无明显抑制活性; 化合物14对乳房链球菌和无乳链球菌均无明显抑制活性。
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3 讨论与结论
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本研究对黔产大青乙醇提取物中化学成分进行分离鉴定，从中共得到了18个化合物。经查阅相关文献，化合物2、3、5、6、8-13、16-18均为首次从大青中分离得到。部分化合物的抗菌活性试验结果表明，化合物13对乳房链球菌有一定的抑制活性。
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木犀草苷（13）是木犀草素（15）7-OH配糖化后的一种苷，研究表明木犀草素（15）能通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构完整性和抑制DNA拓扑异构酶活性发挥抗菌效果（王倩和谢明杰，2010），木犀草苷（13）对乳房链球菌的抑制作用是否也通过上述机制得以实现，还有待进一步深入研究。本次实验中虽然类叶升麻苷（14）未表现出抗菌活性，但该化合物具有较强抗氧化活性（杨建华等，2009），可以对抗因炎症反应而产生的过氧化物，进而修复炎症组织。奶牛乳房炎是由多种因素引起的炎症反应，主要是病原微生物的感染，常见致病菌有无乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌等（张晓东等，2021）。此外，奶牛乳房组织新陈代谢旺盛，体内自由基含量过高引起氧化应激，亦可损伤奶牛乳房细胞进而诱发乳房炎（郭咏梅和闫素梅，2021）。如果将具有抗奶牛乳房炎致病菌作用的木犀草苷（13）与对抗炎症反应的类叶升麻苷（14）联用，是否能显著增强对奶牛乳房炎的防治效果，还需进一步探究。本研究丰富了大青化学成分的物质基础，初步探讨了其抗菌活性成分，为后续大青抗奶牛乳房炎药物的研发提供了一定参考，拓展了苗族医药在动物疾病防治方面的应用。
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参考文献
-
BAI YX, ZHANG NN, JIANG CY, 2013. Research on in vitro antibacterial activity of extract with Chinese herb pairs [J]. Resour Dev Mark, 29(6): 572-573. [白云霄, 张妞妞, 江长优, 2013. 中药药对提取物体外抑菌活性研究 [J]. 资源开发与市场, 29(6): 572-573. ]
-
FATMA ES, HANAA K, DINA AH, et al. , 2016. Phytochemical investigation of the bioactive extracts of the leaves of Ficus cyathistipula Warb [J]. Z Naturforsch C J Biosci, 71(5-6): 141-154.
-
GAO Y, PENG CY, CHEN XY, et al. , 2017. Studies on the phenylethanoid glycosides from the fresh roots of Rehmannia glutinosa [J]. Chin Med Mat, 40(9): 2073-2076. [高映, 彭财英, 陈祥云, 等, 2017. 鲜地黄中苯乙醇类化合物分离与鉴定 [J]. 中药材, 40(9): 2073-2076. ]
-
GAO YP, ZHONG GY, SHEN YH, 2016. Chemical constituents from Incarvillea sinensis var. Przewalskii [J]. Chin Trad Herb Drugs, 47(5): 712-716. [高燕萍, 钟国跃, 沈云亨, 2016. 黄花角蒿的化学成分研究 [J]. 中草药, 47(5): 712-716. ]
-
GUO YM, YAN SM, 2021. Regulation and mechanism of selenium on oxidative stress and inflammation in dairy cows [J]. Chin J Anim Nutr, 33(8): 4213-4220. [郭咏梅, 闫素梅, 2021. 硒对奶牛乳腺氧化应激及炎症反应的调控作用及其机制 [J]. 动物营养学报, 33(8): 4213-4220. ]
-
HOU K, TONG JJ, XIONG BH, et al. , 2019. Application progress of plant extracts on prevention and treatment of mastitis in dairy cow [J]. Chin J Anim Nutr, 31(7): 3009-3015. [侯昆, 童津津, 熊本海, 等, 2019. 植物提取物防治奶牛乳房炎的应用进展 [J]. 动物营养学报, 31(7): 3009-3015. ]
-
HU HJ, ZHOU Y, HAN ZZ, et al. , 2018. Abietane diterpenoids from the roots of Clerodendrum trichotomum and their nitric oxide inhibitory activities [J]. J Nat Prod, 81(7): 1508-1516.
-
JIA RF, LIU HX, HUANG ML, et al. , 2021. Chemical constituents from Agastache rugosa [J]. Chin Trad Herb Drugs, 52(10): 2884-2889. [贾瑞芳, 刘荷秀, 黄美玲, 等, 2021. 苏藿香化学成分研究 [J]. 中草药, 52(10): 2884-2889. ] KITAJIMA J, TANAKA Y, 1993. Constituents of Prunus zippeliana leaves and branches [J]. Chem Pharm Bull, 41(11): 2007-2009.
-
LIN CN, TOME WP, 1988. Antihepatotoxic principles of Sambucus formosana [J]. Planta Med, 54(3): 223-224. LI JL, LI N, XING SS, et al. , 2017. New neo-lignan from Acanthopanax senticosus with protein tyrosine phosphatase 1B inhibitory activity [J]. Arch Pharm Res, 40(11): 1265-1270.
-
LIU DD, LUO J, XIANG WW, et al. , 2021. Antimicrobial and anti-inflammatory effects of crude extract of Nymphaea candida on major pathogens in cow mastitis in vitro [J]. Prog Vet Med, 42(7): 17-21. [刘丹丹, 罗洁, 向薇薇, 等, 2021. 雪白睡莲花粗提物对奶牛乳房炎主要致病菌体外抑菌和抗炎作用 [J]. 动物医学进展, 42(7): 17-21. ]
-
LIU Y, WANG ZY, HE WJ, et al. , 2015. Chemical constituents from stems and leaves of Micromelum integerrimum [J]. Acta Pharm Sin, 50(4): 475-479. [刘燕, 王志尧, 贺文军, 等, 2015. 小芸木茎和叶中化学成分研究 [J]. 药学学报, 50(4): 475-479. ]
-
LI YB, LI J, LI P, et al. , 2005. Isolation and characterization of phenylethanoid glycosides from Clerodendron bungei [J]. Acta Pharm Sin, (8): 722-727. [李友宾, 李军, 李萍, 等, 2005. 臭牡丹苯乙醇苷类化合物的分离鉴定 [J]. 药学学报, (8): 722-727. ]
-
LI YJ, HE X, LIU LN, et al. , 2005. Studies on chemical constituents in herb of Polygonum orientale [J]. Chin J Chin Mat Med, (6): 444-446. [李勇军, 何迅, 刘丽娜, 等, 2005. 荭草化学成分的研究 [J]. 中国中药杂志, (6): 444-446. ]
-
LU KM, WANG FR, 2006. Miao medical Science [M]. Guiyang: Guizhou Science Press: 206-208. [陆科闵, 王福荣, 2006. 苗族医学 [M]. 贵阳: 贵州科学出版社: 206-208. ]
-
MA LY, HU JY, LIN X, et al. , 2021. Study on viable count of Streptococcus agalactia causing bovine, mastitis by MTT method [J]. Chin J Anim Infect Dis, 29(6): 100-104. [马林玉, 胡家银, 林煊, 等, 2021. MTT法检测奶牛乳房炎无乳链球菌活菌数的研究 [J]. 中国动物传染病学报, 29(6): 100-104. ]
-
MENG YH, 2007. Study on chemical constituents of Cirsium Setosum(Wild. ) MB. [D]. Harbin: Heilongjiang University of Chinese Medicine. [孟永海, 2007. 小蓟的化学成分研究 [D]. 哈尔滨: 黑龙江中医药大学. ]
-
PATRA A, MUKHOPADHYAY AK, MITRA AK, 1981. Carbon-13 resonance assignments of some friedelanes and taraxasteranes [J]. Org Magn Reson, 17(3): 166-168.
-
PEI J, CHEN SL, 1982. Flora of China [M]. Beijing: Science Press, 65: 165. [裴鉴, 陈守良, 1982. 中国植物志 [M]. 北京: 科学出版社, 65: 165. ]
-
SAEEDAN B, SUMAYYA S, CHOUDHAPY, et al. , 1997. A steroidal glycoside from Clerodendron inerme [J]. Phytochemistry, 45(8): 1721-1722.
-
TOSHIHIRO A, KAZUHIRO Y, TOSHITAKE T, et al. , 1992. Triterpenoid ketones from Lingnania chungii MOCLURE: arborinone, friedelin and glutinone [J]. Chem Pharm Bull, 40(3): 789-791.
-
WANG CF, LI JP, RU Y, et al. , 2014. Petasins from the rhizomes of Ligularia fischeri and its derivatives [J]. Rec Nat Prod, 8(2): 156.
-
WANG LF, YANG J, ZHONG HC, et al. , 2020. Pathogenic microorganisms associated contamination in raw milk of dairy cows with mastitis and corresponding control measures [J]. Anim Husb Feed Sci, 41(5): 52-57. [王丽芳, 杨健, 钟华晨, 等, 2020. 乳房炎源生鲜乳中病原微生物的污染现状及防控措施 [J]. 畜牧与饲料科学, 41(5): 52-57. ]
-
WANG Q, XIE MJ, 2010. Antibacterial activity and mechanism of luteolin on Staphylococcus aureus [J]. Acta Microbiol Sin, 50(9): 1180-1184. [王倩, 谢明杰. 2010. 木犀草素对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及其机制 [J]. 微生物学报, 50(9): 1180-1184. ]
-
XU RL, WANG R, DING L, et al. , 2013. New cytotoxic steroids from the leaves of Clerodendrum trichotomum [J]. Steroids, 78(7): 711-716.
-
XU HR, LIU PY, XING XG, et al. , 2021. Progress on probiotics and their replacement of antibiotics in the treatment of dairy cow mastitis [J]. Chin Dairy Cattle, 378(10): 1-4. [徐鸿润, 刘沛尧, 邢小光, 等, 2021. 益生菌及其替代抗生素治疗奶牛乳腺炎研究进展 [J]. 中国奶牛, 378(10): 1-4. ]
-
YANG JH, HU JP, RENA K, et al. , 2009. Structure-activity relationships of phenylethanoid glycosides in plants of cistanche salsa on antioxidative activity [J]. Chin Med Mat, 32(7): 1067-1069. [杨建华, 胡君萍, 热娜·卡斯木, 等, 2009. 肉苁蓉属植物中六种苯乙醇苷类化合物抗氧化活性的构效关系研究 [J]. 中药材, 32(7): 1067-1069. ]
-
ZHANG XD, YANG WJ, MENG R, et al. , 2021. Research progress on the effect of Chinese herbal feed additives on dairy cow mastitis [J]. Chin Feed, 677(9): 1-6. [张晓东, 杨文娇, 孟然, 等, 2021. 中草药饲料添加剂对奶牛乳房炎的影响研究进展 [J]. 中国饲料, 677(9): 1-6. ]
-
ZHONG HC, ZHANG SF, FENG XH, et al. , 2020. Study on the antibacterial effect of plant extracts on the pathogenic bacteria of dairy cow mastitis [J]. Heilongjiang Anim Sci Vet Med, 611(23): 117-121. [钟华晨, 张三粉, 冯小慧, 等, 2020. 植物提取物对奶牛乳房炎致病菌的抑菌效果研究 [J]. 黑龙江畜牧兽医, 611(23): 117-121. ]
-
ZHOU ZQ, 2013. Studies on chemical constituents of Callicarpa nudiflora [D]. Nanchang: Nanchang University. [周志强, 2013. 裸花紫珠化学成分的研究 [D]. 南昌: 南昌大学. ]
-
摘要
大青(Clerodendrum cyrtophyllum)是苗族地区常用的药用植物。为研究黔产大青的化学成分及其抗菌活性,该研究采用大孔吸附树脂、反相柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20 柱色谱、半制备高效液相色谱等方法对大青95%乙醇提取物进行分离和纯化,并根据波谱数据鉴定所得化合物结构,采用MTT法评价其抗菌活性。结果表明:从大青中分离得到18个化合物,分别鉴定为木栓酮(1)、α-amyrin palmitate(2)、sambuculin A(3)、22-dehydroclerosterol(4)、isopetasin(5)、taraxasteryl palmitate(6)、豆甾醇(7)、22-dehydroclerosterol-3-O-β-D-(6′-O-margaroyl)-glucopyranoside(8)、3-O-β-D-galactopyranosyl-(24β)-ethylcholesta-5,22,25-trien(9)、肉苁蓉苷D(10)、tortoside F(11)、balanophonin(12)、木犀草苷(13)、类叶升麻苷(14)、木犀草素(15)、acantrifoside E(16)、trichotomside B(17)、肉苁蓉苷C(18),其中化合物2、3、5、6、8-13、16-18均为首次从大青中分离得到。活性测试结果表明,化合物13对乳房链球菌有一定的抑制作用。该研究丰富了大青化学成分,为其在抗奶牛乳房炎药物的研发提供了参考。
Abstract
Clerodendrum cyrtophyllum is a common medicinal plant used by Miao people. In order to study the chemical constituents and antibacterial activities of C. cyrtophyllum in Guizhou, China. Macroporous adsorption resin, reversed phase column chromatography, silica gel column chromatography, Sephadex LH-20 column chromatagraphy, and semi-preparative high performance liquid chromatography were used to separate and purify 95% ethanol extracts from C. Cyrtophyllum. The antibacterial activities were evaluated by MTT method. The results showed 18 compounds were isolated and identified as friedelin (1), α-amyrin palmitate (2), sambuculin A (3), 22-dehydroclerosterol (4), isopetasin (5), taraxasteryl palmitate (6), stigmasterol (7), 22-dehydroclerosterol-3-O-β-D-(6′-O-margaroyl)-glucopyranoside (8), 3-O-β-D-galactopyranosyl-(24β)-ethylcholesta-5,22,25-trien (9), cistanoside D (10), tortoside F (11), balanophonin (12), luteoloside (13), acteoside (14), luteolin (15), acantrifoside E (16), trichotomside B (17), cistanoside C (18). Among of them, compounds 2, 3, 5, 6, 8-13, 16-18 were all isolated from C. cyrtophyllum for the first time. Besides,biological activity test showed Compound 13 had antibacterial activity against Streptococcus uberis. The study enriches the chemical composition of C. cyrtophyllum, and provides reference for the drug development of anti-mastitis of dairy cows.