Page 152 - 《广西植物》2021年第9期
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ϟ ጢ ጢ ԡ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ϟ 卷
橡胶树的侧根ܦ幼茎ܦ稳定期叶片ܦ雌花ܦ种仁ྉ外胚
ϟজ 材料与方法 乳ɯܦ树皮ܦ萌条的形成层区和胶乳等样品进行组织
特异性表达ᖔ每个样品均来自 ሕ 棵树样品的混合ᤥ
ϓॹϓ ̵ᤇ᤹ᓣʐԣጇ 基因的克隆 采集胶乳样品时ᖔ弃去前 ϟቝᔽႿ 流出的胶乳ᖔ取割胶
̵ᤇ᤹ᓣʐጢ 基因的开放阅读框ྉ ᨃèɯ 信息来自 后 ጲጢ ቝᔽႿ 流出的胶乳ᖔ胶乳直接在 ϟጢ ቝᓂ શᑕ༁ᔀ
巴西橡胶树无性系 ऊዶఋዶ୩ Ꭾ᥋ሕሕ᥋ँᎮ 基因组测序结 ʢᔀᔀ 离心管中与裂解液 ୩ᓂྉఋ᧧ዶશ᥈ጶશ શዶᡱʢᔀᡱ ۪ࣼʢᔀ
果ྉఋᑕႿ੫ ᔀᡷ ᑕᖔ ԡϟᤃɯᖔ得到的基因序列信息经过 ۪ᑕႿᡷᔽᡷᖔ᧕۪࿗࿗ϟɯ 以胶乳与裂解液的体积比为 ϟᨒ ጢ
ାᑕ༁ᡷ 比对后ᖔ设计 ᨃè 引物扩增出基因开放阅读 进行混合ᖔ置于冰上ᖔ立即提取总 શዶ 或ͱऐԡ ቩ 保
框并测序确认ᤥ 存备用ଫ其他组织样品采集后ᖔ液氮速冻ᖔ液氮研磨
引物序列 ̵ᤇ᤹ᓣʐጢ᥋ᨃè 为 ጢࣕ᥋ዶఋ᥈᥈ऊ᥈᥈ዶ᥈ዶዶ 后提取总 શዶ 或ͱऐԡ ቩ保存备用ᤥ
᥈ऊዶ᥈ऊఋ᥈᥈ఋ᥋ሕࣕᖔ̵ᤇ᤹ᓣʐጢ᥋ᨃ 为 ጢࣕ᥋ఋఋዶዶऊఋऊዶఋዶ ϓॹ 割胶处理
ዶዶఋऊऊዶऊऊఋऊऊዶ᥈᥈ऊ᥋ሕࣕᤥ 使用橡胶树无性系 一天时间中橡胶树的韧皮部组织膨压在凌晨
ऊዶఋዶ୩ Ꭾ᥋ሕሕ᥋ँᎮ 的胶乳 ዹ᧕શዶ 作为模板ᖔ进行 ۪ऊ 时段最高ᖔ割胶后的排胶动力最大ᖔ随后在一天中
扩增 ̵ᤇ᤹ᓣʐጢ 基因的全长 ዹ᧕શዶᤥ ۪ऊ 程序᧥ँጢ 逐步降低ᖔ到了晚上逐步恢复ྉ ାࣼᡷᡷᔀʢᢃ ᪲ ାᆍᑕᡷቝᑕႿᖔ
ቩ 预变性 ሕቝᔽႿଫँጢቩ 变性 ሕԡ ༁ᖔጢᤃ ቩ 退火 ሕԡ ༁ᖔᎮ ϟँᤃᤃɯᤥ 凌晨时环境温度低ᖔ能够降低黄色体破裂
ቩ 延伸 ቝᔽႿᖔ循环 ሕጢ 次ଫᎮ ቩ 延伸 ԡ ቝᔽႿଫϟᤃ ቩ 导致 的胶乳凝集ᖔ 增加排胶的时间 ྉ ୩ၤᔽ ᔀᡷ ᑕᖔ
终止反应ᤥ۪ऊ 产物通过 ϟᠮ的琼脂糖凝胶电泳 ԡϟँɯᤥ 此外ᖔ橡胶生物合成关键酶基因表达还具
检测ᖔ回收并纯化目的条带ᖔ连接转化到 ᡱጶዶ୩ɟ᥋ 有明显的昼夜节律性ྉ杨鹏等ᖔԡϟँɯᤥ 为避免割胶
ାࣼႿᡷ ୩ᔽቝᡱᔀ 载体上ᖔ挑取阳性单克隆ᖔ使用 ᥘϟሕ 时间ܦ环境温度和节律性等因素对本实验的干扰ᖔ
引物进行菌落 ۪ऊ 筛选ᖔ选取插入 ᧕શዶ 片段正确 割胶组和对照组需在同一时间进行割胶和采集胶
的阳性单克隆ᖔ送到广州天一测序公司进行测序ᖔ 乳ᤥ 选取同一林段且割龄一致的巴西橡胶树无性
以确定克隆基因 ዹ᧕શዶ 序列的准确性ᤥ 系 ऊዶఋዶ୩ Ꭾ᥋ሕሕ᥋ँᎮ 的开割树ᖔ分为割胶和对照两组ᖔ
ϓॹԣ 同源性分析和系统进化分析 割胶组的橡胶树 ሕጢ 株ᖔ在同一时间进行割胶处理
通过 શऊା᧧ ᨃè ᔽႿʛᔀʢ 工具对获得的 ̵ᤇ᤹ᓣʐጢ 后ᖔ分别在割胶后的 ԡጢܦܦᤃܦϟܦ࿗ܦ࿗ऐܦᎮ ၤ 等时间
基因序列进行 ᨃè 预测和确定ᖔ使用 ᧕શዶᥘዶશ 点进行第二次割胶ᖔ采集第二次割胶的胶乳作为不
Ꭾԡ 软件将 ᨃè 序列翻译为相应的氨基酸序列ᖔ并 同时间割胶处理的样品ᤥ 对照组的 ሕጢ 株橡胶树不
进 行 序列同源性 比 对ଫ 使用 શऊା᧧ ऊᆍႿ༁ᔀʢᔀʛ 进行同一时间割胶处理ᖔ仅在割胶组第二次割胶时
᧕ᆍቝᑕᔽႿ༁ 工具和 ୩ᥘዶఋ 工具获取 ̀ᤦᥘᔀʛጢ 蛋白 进行割胶ᖔ采集的胶乳样品作为不同时间割胶处理
的 保守结构域 信 息ଫ 使用 ጶ۪ዶ୩ᢃ 网站的 的对照ᤥ 每个时间点的开割树胶乳样品来自 ጢ 棵树
۪ʢᆍᡷ۪ᑕʢᑕቝܦ۪ʢᆍᡷ୩ዹᑕᔀ 和 ఋᥘᡱʢᔀʛ ୩ᔀʢᔀʢ 等工具进行 胶乳样品的混合ᖔ并采集 ሕ 个生物学重复ᤥ
̀ᤦᥘᔀʛጢ 蛋白的理化性质ܦ亲疏水性以及跨膜结 ϓॹጇ 植物激素等化学因子处理
构的推测ଫ使用 ఋၤᔀ ᡱʢᔀʛᔽዹᡷᔀʛ શᓂ୩ 进行氨基酸序列 用单面刀片刮去面积为 ዹቝ ġ ࿗ዹቝ 的萌条
的核定位信号的预测ଫ使用 ୩ۼ᧧୩୩᥋ᥘᨃ᧕ጶᓂ 工具对 茎表皮及部分皮层ᖔ用灭菌的脱脂棉包裹处理部
᥋ϟ
̀ᤦᥘᔀʛጢ 蛋白的三级结构进行预测ᤥ 位ᖔ分别施加含有 ࿗ ጢԡԡ ဂ੫ኼቝᓂ ᤃ᥋ାዶྉ 对照组为
通过 Ȯ᥈᧧ 网站 ۪ၤᢃᡷᆍझᆍቝᔀ 工具检索到来源于陆 灭菌水ɯܦጢԡ ԡԡԡ ဂ੫ኼቝᓂ ᥈ዶྉ对照组为灭菌水ɯܦ
᥋ϟ
生植物和藻类的 ᤃጢ 个 ᥘᔀʛጢ 的蛋白序列ᤥ 本文 ጢ ԡԡԡ ဂ੫ኼቝᓂ ጶఋྉ对照组为灭菌水ɯܦԡԡሕ ဂ੫ኼ
᥋ϟ
将橡胶树 ̀ᤦᥘᔀʛጢ 蛋白序列和其他陆生植物和藻 ቝᓂ 曲古抑菌素 ዶྉᡷʢᔽዹၤᆍ༁ᡷᑕᡷᔽႿ ዶᖔ ఋ୩ዶɯྉ对照组为
᥋ϟ
᥋ϟ 冠菌素
类的 ᤃጢ 个 ᥘᔀʛጢ 的蛋白序列进行系统进化分析ᖔ ጢᠮ ᧕ᥘ୩ᨃ 溶液 ɯܦ ᤃ ሕँ ဂ੫ ኼ ቝᓂ
使用 ᥘጶ᥈ዶ ᤃ 软件绘制 શᔀᔽ੫ၤᤦᆍʢ ᢼᆍᔽႿᔽႿ੫ 系统进化 ྉዹᆍʢᆍႿᑕᡷᔽႿᔀᖔ ऊᨃɯྉ 对照组为灭菌水ɯ 的溶液ᖔ利
树ᖔ并进行 ϟ ԡԡԡ ᤦᆍᆍᡷ༁ᡷʢᑕᡱ 的统计学检测ᤥ 用塑料封口膜包裹ᖔ分别处理 ϟܦܦऐܦ࿗ܦ࿗ऐܦᎮܦ
ϓॹᇺ 组织特异性表达 ϟԡ ၤᖔ拆去脱脂棉和塑料封口膜ᖔ收集处理部位的
所用材料为巴西橡胶树无性系 ऊዶఋዶ୩ Ꭾ᥋ሕሕ᥋ँᎮ 胶乳ᤥ 每个时间点的胶乳样品来自 ጢ 根萌条的胶
的开割成龄树和一年生萌条ᖔ均种植在中国热带农 乳混合ᖔ并采集 ሕ 个生物学重复ᤥ
业科学院试验场三队基地ᤥ 同一时间采集同一棵 按照同样的方法ᖔ 使用 ᤃ ሕँ ဂ੫ ኼ ቝᓂ ऊᨃ
᥋ϟ
