Page 75 - 《广西植物》2023年第11期
P. 75
１１ 期 罗志宏等: 桐花树活性内生真菌筛选及其抗菌化学成分的研究 ２ ０ ３ ５
用ꎬ拟探讨桐花树内生真菌代谢产物的抗菌药用 １.２ 方法
价值ꎬ为抗生素的开发拓展资源和提供物质基础ꎮ １.２.１ 桐花树内生真菌的分离与鉴定 参考 Ｓｈａｎ
等(２０１２)的方法分离桐花树内生真菌ꎬ新鲜树叶
１ 材料与方法 用无菌水漂洗 ３ 次后ꎬ浸泡在 ７０％ 乙醇中 ３０ ｓꎬ
０.２％升汞处理 ２０ ｍｉｎꎬ无菌水反复漂洗 ５ 次ꎬ无菌
１.１ 材料和仪器 滤纸吸干树叶表面水分ꎮ 用剪刀将树叶剪成约
乙腈 为 色 谱 纯 ( 上 海 星 可 高 纯 溶 剂 有 限 公 ０.５ ｃｍ 的碎片ꎬ均匀地放置在 ＭＢ 培养基、查氏培
司)ꎬ甲醇、乙酸乙酯、石油醚等化学试剂为分析纯 养基和虎红(琼脂)培养基上ꎬ置于 ２８ ℃ 恒温箱中
(广东光华科技股份有限公司)ꎻＤＮＡ 提取试剂盒 培养ꎮ 待菌落长出后ꎬ挑取形态、色泽不同的菌落
[ＤＰ３０５ꎬ天根生化科技(北京)有限公司]ꎻＰＣＲ 试 接种于新的培养基上ꎬ连续多次纯化ꎬ直至得到单
剂盒(２×ＥａｓｙＴａｑ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘꎬ北京全式金生物 一菌落ꎮ 纯菌株保藏在 ４ ℃ 下ꎬ备用ꎮ
技 术 股 份 有 限 公 司 )ꎻ 引 物 ＩＴＳ１ ( ５′￣ 取少量新鲜菌体ꎬ根据试剂盒的操作说明提
ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３′) / ＩＴＳ４ ( ５′￣ 取真菌基因组 ＤＮＡꎬ以获得的 ＤＮＡ 为模板ꎬ采用
ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′) [ 生 工 生 物 工 程 真菌核糖体转录间隔区通用引物 ＩＴＳ１ 和 ＩＴＳ４ 进
(上海)股份有限公司合成]ꎻ柱层析硅胶ꎬ薄层硅 行 ＰＣＲ 扩增ꎮ １％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物ꎬ
胶板(烟台江友硅胶开发有限公司)ꎻ抗菌活性指 扩增成功后送至生工生物工程(上海) 股份有限公
示菌: 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ( ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ￣ 司进行测序ꎮ 测序结果提交到 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库应
ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ４３３００)、 表 皮 用 ＢＬＡＳＴ 比对序列相似性ꎬ下载同源性较高的序
葡 萄 球 菌 ( Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ ＡＴＣＣ 列ꎮ 运用 ＭＥＧＡ Ｘ 软件的 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ 法构建
１２２２８)、 铜 绿 假 单 胞 菌 ( Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 系统发育树ꎬ按照 ｐ￣ｄｉｓｔａｎｃｅ 方法计算进化距离ꎬ
ＡＴＣＣ １０１４５ )、 粘 性 放 线 菌 ( Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ 可靠性设置 １ ０００ 次 ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 计算得出ꎮ
ＡＴＣＣ １５９８７ )、 藤 黄 微 球 菌 ( Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ １.２.２ 桐花树内生真菌发酵产物的制备 内生真菌
ＡＴＣＣ ４９７３２ )、 枯 草 芽 孢 杆 菌 ( Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ 菌株接种至 ＭＢ 液体培养基ꎬ２８ ℃、１８０ ｒｍｉｎ 条
￣１
ＡＴＣＣ ６０５１ )、 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ( Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ 件下培养 ３~ ５ ｄꎬ即获得种子液ꎮ 将种子液接种到
ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ １４２２２)、 大 肠 杆 菌 ( Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 装有大米固体培养基的 １ ０００ ｍＬ 锥形瓶中ꎬ共 ２
ＡＴＣＣ ２５９２２)、肺炎克雷伯菌(Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 瓶ꎮ 在 ２８ ℃下静置培养 ３０ ｄꎮ 乙酸乙酯超声提取 ３
ＡＴＣＣ１３８８３ ) 和 鲍 曼 不 动 杆 菌 ( Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ 次ꎬ合并提取液ꎬ减压回收溶剂ꎬ得到菌株发酵产物ꎮ
ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＡＴＣＣ １９６０６)由广西中医药大学海洋药 １.２.３ 桐花树内生真菌发酵产物的抑菌活性测试
物研究院保藏ꎻ查氏培养基、虎红( 琼脂) 培养基、 采用滤纸片琼脂扩散法筛选桐花树内生真菌发
ＭＢ 培养基用于桐花树内生真菌分离ꎻ大米培养基 酵产物的抑菌活性ꎮ 发酵产物溶解在 ＤＭＳＯ 中ꎬ
(大米 １００ ｇ、海盐 １.５ ｇ、蒸馏水 １１０ ｍＬ)用于内生 初始浓度为 ５０ ｍｇｍＬ ꎮ 阳性对照氨苄青霉素
￣１
真菌的扩大发酵ꎻ桐花树叶于 ２０２０ 年 ９ 月采集于 钠和环丙沙星溶解在 ＤＭＳＯꎬ初始浓度为 ０.１ ｍｇ
￣１
广西钦州市茅尾海康熙岭红树林自然保护区ꎮ ｍＬ ꎮ ＤＭＳＯ 作为阴性对照ꎮ 吸取 ３ μＬ 待测样品
ＬＣ￣２０３０Ｃ ３Ｄ Ｐｌｕｓ 型高效液相色谱仪(日本岛 到直径为 ６ ｍｍ 的无菌滤纸片上ꎬ载样滤纸片贴于
津公司)ꎻＡｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ５００Ｍ 超导核磁共振波谱 有指示菌的 ＬＢ 平板上ꎬ３７ ℃ 培养 １６ ｈꎮ 采用十字
仪(Ｂｒｕｋｅｒ 公司)ꎻＥＹＥＬＡ Ｎ￣１３００Ｄ 型旋转蒸发仪 交叉法记录抑菌圈的直径ꎮ 通过抑菌圈直径大小
(东京理化器械株式会社)ꎻＣ１０００ 型 ＰＣＲ 仪( Ｂｉｏ￣ 评价发酵产物活性ꎬ从而筛选出能够产生抗菌物
Ｒａｄ 公 司)ꎻ ｓｅｐａｃｏｒｅ 型 中 压 制 备 色 谱 仪 ( 瑞 士 质的活性菌株ꎮ
Ｂｕｃｈｉ 公司)ꎻＳＨＺ￣ＣＢ 型循环水真空泵( 巩义市予 １.２.４ 菌株 Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ. ＧＸＩＭＤ０２０２９ 扩大发酵和
华仪器有限公司)ꎻＫＱ￣２５０ＤＢ 型超声仪( 巩义市 代谢产物的分离 Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ. ＧＸＩＭＤ０２０２９ 的
予华仪器有限公司)ꎻ电泳仪( 北京六一生物科技 发酵方法同 １.２.２ 项下ꎬ发酵数量扩大至 １００ 瓶ꎮ
有限公司)ꎻ凝胶成像分析仪( ＶＩＬＢＥＲ ＬＯＵＲＭＡＴ 用乙酸乙酯浸提发酵产物 ５ 次ꎬ减压浓缩ꎬ得到浸
公司)ꎻ培养箱(上海精宏实验设备有限公司)ꎮ 膏 ９５ ｇꎮ 浸膏经正相硅胶(２００ ~ ３００ 目) 柱层析ꎬ
