Page 67 - 《广西植物》2023年第6期

６ 期 魏春梅等: 滇水金凤花距发育相关基因 ＡＢＰ 的克隆及表达分析 １ ０ ５ ３

甲ꎬ是具有观赏、生态、药用以及经济价值的重要 ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ / )来预测 ＩｕＡＢＰ 基因结构
花卉材料(Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ 滇水金凤作为观赏 域ꎻ 运 用 Ｔａｒｇｅｔ Ｐ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.
植物不仅具有花色多样、花形奇特的特点ꎬ其花距 ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ? ＴａｒｇｅｔＰ￣２.０) 预测 ＩｕＡＢＰ 蛋白

的长短、数量及颜色各异还具有很好的研究价值ꎮ 的 亚 细 胞 定 位ꎻ 借 助 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ ( ｈｔｔｐｓ: / /
迄今为止ꎬ国内外尚未见有关滇水金凤 ＡＢＰ 基因 ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ) 预测 ＩｕＡＢＰ 蛋白
的相关报道ꎮ 因此ꎬ在滇水金凤中克隆 ＡＢＰ 基因 的三维空间结构ꎻ利用 ＤＮＡＭＡＮ ｖ９.０ 对 ＩｕＡＢＰ 蛋
并分析其分子机制及表达特征ꎬ对深入研究其在 白进 行 比 对 分 析ꎻ 运 用 ＭＥＧＡ￣Ｘ 软 件 的 邻 接 法
花距发育中的调控机制具有重要意义ꎮ 本研究在 (Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ＝ １ ０００)进行系统进化分析ꎮ
课题组前期滇水金凤转录组测序的基础上ꎬ对滇 １.４ 滇水金凤 ＡＢＰ 时空表达模式分析
水金凤花距发育相关基因 ＡＢＰ 进行克隆ꎬ借助在 分别提取滇 水 金 凤 ３ 个 时 期 ( 花 苞 期、始 花
线软件与 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析ꎬ利用生物信息学方法ꎬ通 期、盛花期)和 ２ 个部位(檐部和距部) 花距器官的
过对 ＡＢＰ 基因的进化关系、结构特征、组织表达等 ＲＮＡꎬ逆转录合成的 ｃＤＮＡ 备用ꎮ ＩｕＡＢＰ 基因 ｑＲＴ￣
进行分析ꎬ拟探讨以下问题:(１) 滇水金凤 ＡＢＰ 蛋 ＰＣＲ 引物为 ｑＡＢＰＦ(５′￣ＣＧＧＧＣＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＴ
白亲缘进化关系ꎻ(２)该蛋白的基本理化性质和结 ＡＣ３′)、ｑＡＢＰＲ(５′￣ＴＴＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＡＡＴＣ′)ꎬ
构特征ꎻ(３) 滇水金凤 ＡＢＰ 基因在花距发育的不 内参基因为 ＩｕＡｃｔｉｎ[ＡｃｔｉｎＦ(５′￣ＴＧＡＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴ
同时期和不同部位中的表达模式ꎮ ＧＴＴＴＧ￣３′)、ＡｃｔｉｎＲ (５′￣ＡＣＣＴＴＣＣＧＣＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣ
Ｃ￣３′)]ꎮ 以 ３ 个时期的 ２ 个部位的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ
１ 材料与方法 借助 Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ⅱ(Ｒｏｃｈｅ) 实时定量 ＰＣＲ 仪
进行基因表达相对定量分析ꎮ 反应体系为 ２０ μＬꎬ
１.１ 材料 反应程序为预变性 ９５ ℃ꎬ５ ｍｉｎꎻ变性 ９５ ℃ꎬ１０ ｓꎬ退
材料为西南林业大学后山试验大棚的滇水金 火 ６０ ℃ꎬ２０ ｓꎻ延伸 ７２ ℃ꎬ２０ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 每个样
凤ꎬ采 取 其 花 苞 期 ( Ｓ１)、 始 花 期 ( Ｓ２) 和 盛 花 期 品进行 ３ 个重复ꎬ采用 ２ －△△Ｃｔ 法计算ꎮ 将盛花期花
(Ｓ３) 的 花 距 距 部 和 花 距 檐 部 进 行 目 的 基 因 的 距距部定义为单位 １ 作为对照ꎬ对 ＩｕＡＢＰ 基因在不
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 实验(图 １)ꎮ 同时期和不同部位的时空表达模式进行分析ꎮ
１.２ 总 ＲＮＡ 的提取与 ＡＢＰ 基因的克隆
利用 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 ( ＯＭＥＧＡ) 提 取 滇 水 ２ 结果与分析
金凤花器 官 总 ＲＮＡꎻ 根 据 逆 转 录 试 剂 盒 ( 全 式
金) 将 ＲＮＡ 逆转录成 ｃＤＮＡꎬ保存在 － ２０ ℃ 条件 ２.１ 滇水金凤 ＡＢＰ 基因的克隆及序列分析
下备用ꎮ 根据滇水金凤花距转录组设计的特异性扩增
以滇水金凤转录组中的 ＩｕＡＢＰ 基因为依据ꎬ 引物ꎬ以花距器官的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ采用 ＲＴ￣ＰＣＲ
对 引 物 进 行 设 计ꎬ 并 送 往 生 工 合 成ꎮ 引 物 为 克隆获得 ＡＢＰ 的基因片段(图 ２:Ａ)ꎮ

ＩｕＡＢＰＦ( ５′￣ＡＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＣＧＴＴＴＴＣ￣３′)、 ＩｕＡＢＰＲ 运用 ＥｘＰａｓｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ 对滇水金凤 ＡＢＰ 基因
( ５′￣ＴＴＡＡＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣ￣３′)ꎮ 以 滇 编码的 蛋 白 进 行 分 析ꎬ ＩｕＡＢＰ 全 长 ６２７ ｂｐꎬ 编 码
水金 凤 花 距 的 ｃＤＮＡ 为 模 板 进 行 ＡＢＰ 基 因 的 ２０８ ａａꎬ相对分子量为 ２２ １０８.６ Ｄａꎬ理论等电点为

ｃＤＮＡ 扩增ꎬ扩增体系为 ２０ μＬꎬ反应条件:９５ ℃ ５ ６.９５ꎬ 总 共 包 括 ３ １６２ 个 原 子ꎬ 不 稳 定 指 数 为
ｍｉｎꎻ９５ ℃ ５ ｓꎬ５６ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃ ４８ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ ２７.４６ꎬ属于稳 定 蛋 白ꎮ 总 平 均 亲 疏 水 性 指 数 为
７２ ℃ １０ ｍｉｎꎬ４ ℃ 保存ꎮ ＰＣＲ 产物经回收纯化后ꎬ ０.４０５ꎬ表明该蛋白为疏水性蛋白ꎮ 利用 ＳＭＡＲＴ 分
与载体 ｐＭＤ１９￣Ｔ 连接ꎬ转化 ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ最 析发 现 ＩｕＡＢＰ 含 有 一 个 典 型 的 Ｃｕｐｉｎ￣１ 结 构 域

后挑选阳性菌液送生工测序ꎮ (１４７ 个氨基酸)ꎬＥ￣ｖａｌｕｅ 为 ７.８５ｅ￣３６ꎬ 并含有一个
１.３ 滇水金凤 ＡＢＰ 基因序列分析 ２０ ａａ 的信号肽ꎬ 说明该基因属于 Ｃｕｐｉｎ 超家族成

运用 ＥｘＰａｓｙ 在 线 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. 员(图 ２:Ｂ)ꎮ 滇水金凤 ＡＢＰ 基因不存在跨膜结构
ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )对滇水金凤 ＩｕＡＢＰ 基因的基本理 域ꎬ亚 细 胞 定 位 于 细 胞 壁ꎮ 此 外ꎬ 借 助 ＳＷＩＳＳ￣
化特性进行分析ꎻ借助 ＳＭＡＲＴ 在线工具( ｈｔｔｐ: / / ＭＯＤＥＬ 对滇水金凤 ＡＢＰ 基因进行三维空间结构