Page 35 - 《广西植物》2023年第7期
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７ 期 田甲佳等: 云南三个地区马铃薯内生真菌多样性研究 １ ２ ０ ３
小麦之后的第四大粮食作物( 马雪等ꎬ２０１４ꎻ邬时 １.２ 内生真菌的分离纯化
民ꎬ２０１５)ꎬ其营养价值高、粮菜兼用ꎬ并且马铃薯 消毒:将马铃薯根、茎、块茎表面杂物用自来
面粉储备时间长ꎬ是国家粮食安全的重要保障ꎮ 水反复冲洗 ３ ~ ４ 次后ꎬ用无菌水冲洗干净ꎬ沥干水
云南是我国西南地区主要的马铃薯产地ꎬ马铃薯 分ꎮ 将材料用无菌刀切成小段ꎬ置于 ５０ ｍＬ 无菌
产业已成为云南贫困地区农民脱贫致富的重要支 离心管中ꎬ依次用 ７５％乙醇、无菌水和 １０ ｍＬ 配置
柱产业( 卢丽丽等ꎬ２０１８)ꎮ 马铃薯产量及品质受 好的 ５％ Ｈ Ｏ 浸泡 ３ ｍｉｎꎬ期间不断震荡ꎬ用无菌
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真菌病害影响很大ꎬ目前主要使用化学农药对真 水冲洗 ３ 次ꎮ 将经消毒后的组织置于无菌滤纸上ꎬ
菌病害进行防治ꎬ由于化学药剂会对环境及人畜 吸干表面多余水分后将根、茎、块茎切成 ５ ｍｍ × ５
健康造成极大威胁ꎬ因此生物防治已成为马铃薯 ｍｍ 的小块ꎮ 为检验消毒是否彻底ꎬ依次设置 ２ 组
真菌病害防控的研究热点ꎮ 有研究发现ꎬ马铃薯 对照:(１)吸取 １００ μＬ 最后一次清洗组织块的无
菌水至新鲜无菌 ＰＤＡ 培养皿上ꎬ用无菌涂布器涂
内生菌对真菌病原体( 尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、
禾谷镰刀菌、灰葡萄孢菌等)、细菌病原体( 疮痂链 布均匀ꎻ(２) 使用按压法ꎬ将消毒的组织块放至新
鲜无菌 ＰＤＡ 平板上ꎬ稍加按压ꎬ放置 ２０ ｍｉｎ 后移
霉菌、黄单孢菌)和内生毒素龙葵碱等有抑制作用
去组织块ꎬ每组处理设置 ３ 个平行ꎮ 将以上 ２ 种不
(Ｓｅｓｓｉｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４ꎻ王 剑 峰ꎬ２０１２ꎻ艾 洪 莲 等ꎬ
同方法处理的对照置于 ２６ ℃ 培养箱中进行培养ꎬ
２０１７ꎻ郑旭ꎬ２０１９ꎻ张家欣ꎬ２０２２)ꎮ
本研究对云南省 ３ 个地区马铃薯的根、茎、块 观察有无菌落长出ꎬ以明确组织块消毒是否彻底ꎮ
分离纯化:将准备好的小组织块采用组织块
茎中内生真菌进行分离纯化ꎬ通过观察其微观形
接种法(韦艳梅等ꎬ２０１６)ꎬ等距离放在含有氨苄青
态和分析其 ＩＴＳ 序列鉴定真菌ꎬ并在此基础上对内
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霉素(５０ ｍｇｍＬ ) 和卡拉霉素(１０ ｍｇｍＬ ) 的
生真菌的组成及相关多样性指数进行分析和比
ＭＹ 培养皿中ꎬ每个培养皿放置 ８ ~ １０ 个组织块ꎬ
较ꎬ拟探讨:(１) 马铃薯内生真菌种群的多样性ꎻ
待培养皿做好标记后倒置ꎬ放于 ２６ ℃ 生化培养箱
(２)马铃薯不同组织部位内生真菌的分离率和定
中培养ꎬ培养 ７ ｄ 左右ꎬ期间不定期观察组织下方
殖率ꎻ(３)不同地区内生真菌的优势菌属及不同部
或边缘处是否有菌落出现ꎻ根据菌落生长形态、颜
位内生真菌的多样性指数ꎮ 本研究旨在丰富马铃
色和时间 等ꎬ 采 用 尖 端 菌 丝 挑 取 法 ( 吴 小 平 等ꎬ
薯内生真菌种群ꎬ为进一步深入研究这些内生真
２００９)ꎬ及时将单个菌落的新鲜菌丝挑出ꎬ转接到
菌及代谢产物对马铃薯真菌病害的抑制作用提供
３０ ｍｍ ＰＤＡ 培养皿中ꎬ倒置于 ２６ ℃ 生化培养箱中
物质基础ꎮ
培养观察ꎮ 反复多次转接培养以获得形态一致的
单一菌落ꎬ即为纯化好的内生真菌菌株ꎮ 将其转
１ 材料与方法
接到 ６０ ｍｍ 培养皿中ꎬ标记名称及转接日期ꎬ放置
在 ２６ ℃ 培养箱中培养 ３ ~ １０ ｄꎬ平板没有污染ꎬ待
１.１ 材料
长满培养皿后于 ４ ℃ 冰箱保存ꎮ
１.１.１ 供试植物 马铃薯健康植株于 ２０２０ 年 ５ 月 １.３ 内生真菌的鉴定
采自云南省德宏芒市、大理喜洲和临沧双江ꎮ 在 １.３.１ 形态学鉴定 挑取少量各菌种菌丝体置于
盛花期采集完整植株ꎬ包括地上部分及地下部分ꎮ
载玻片上ꎬ添加乳酸酚棉兰染色液ꎬ使菌丝染色ꎬ
选取地上部分的主茎( 冠层以下 １０ ｃｍ 及露出土 同时使用接种针将菌丝挑拨松散后从一侧缓慢盖
层外的上 １０ ｃｍ)及地下部分根( 须状根) 和块茎ꎬ 上盖玻片ꎬ并在蔡司显微镜下观察ꎬ记录显微镜下
主根长约 ４０ ｃｍꎬ茎长 ８０ ~ １００ ｃｍꎬ块茎大小为 ８ 各菌株菌丝的形态特征ꎮ 根据传统的形态学鉴定
ｃｍ × ５ ｃｍꎮ 采集完毕后ꎬ立即带回实验室进行后 方法ꎬ结合«真菌鉴定手册» ( 魏景超ꎬ１９７９) 和« 真
续马铃薯内生真菌的分离ꎮ 菌的形态和分类»(戴芳澜ꎬ１９８７)等参考资料对内
１.１.２ 试 验 培 养 基 马 铃 薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 生真菌菌株进行初步鉴定ꎮ
(ＰＤＡ):成品培养基ꎮ ＭＹ 培养基:２１ ｇ 酵母麦芽 １.３.２ 分子生物学鉴定 用改良的 ＣＴＡＢ 法对马铃
浸粉肉汤ꎬ１５ ｇ 琼脂ꎬ加蒸馏水至 １ ０００ ｍＬꎬ１２１ ℃ 薯内生真菌菌株进行 ＤＮＡ 提取(张妙彬等ꎬ２００９)ꎮ
下灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ 参考易天凤等(２０１９)的方法ꎬ利用内生真菌通用引
