Page 78 - 《广西植物》2024年第7期

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Ｇｕｉｈａｉａ Ｊｕｌ. ２０２４ꎬ ４４(７): １２７８－１２８８

ＤＯＩ: １０.１１９３１/ ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０２３０６０５０
曾婉俐ꎬ 梁岗ꎬ 高茜ꎬ 等ꎬ ２０２４. 烟草香气相关基因 ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ 编辑突变体库的构建 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ４４(７): １２７８－１２８８.
ＺＥＮＧ ＷＬꎬ ＬＩＡＮＧ Ｇꎬ ＧＡＯ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２４. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｒｏｍａ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｕｓｉｎｇ
ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ４４(７): １２７８－１２８８.

烟草香气相关基因 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑突变体库的构建

曾婉俐 ꎬ 梁 岗 ꎬ 高 茜 ꎬ 李元川 ꎬ 许 力 ꎬ 蒋佳芮 ꎬ 许 永 ꎬ 向海英 １∗
１
２
１
１
１
３
１
( １. 云南中烟工业有限责任公司技术中心ꎬ 云南省烟草化学重点实验室ꎬ 昆明 ６５０２３１ꎻ ２. 中国科学院西双版纳热带植物园ꎬ
热带植物资源可持续利用重点实验室ꎬ 昆明 ６５０２２３ꎻ ３. 云南农业大学ꎬ 昆明 ６５０２０１ )
摘 要: 为探究 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑技术构建烟草突变体库的可行性ꎬ该研究以烤烟品种‘红花大金元’
为实验材料筛选了 １００ 个可能参与烟草香气代谢的基因ꎬ设计相应的 １００ 个 ｓｇＲＮＡ 并构建了由 １００ 个
ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ 编辑载体组成的质粒库ꎬ获得转基因材料后分析了载体的共转化率、靶向编辑率和脱靶编辑
情况ꎮ 结果表明:(１)通过农杆菌介导 １００ 个 ｓｇＲＮＡ 的共转化后ꎬ在 １７２ 个阳性转化株中检测到了其中的
７７ 个 ｓｇＲＮＡꎬ共转化率为 ７７％ꎮ (２)在 ７７ 个携带 ｓｇＲＮＡ 的转基因后代中ꎬ６９ 个 ｓｇＲＮＡ 对目标基因进行了
靶向编辑ꎬ编辑率为 ８９.６％ꎮ (３)脱靶位点测序检测发现ꎬ只有 １ 个 ｓｇＲＮＡ 在非目标靶位点产生了脱靶编
辑ꎬ表明 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑技术在烟草中的脱靶概率非常低ꎮ 综上所述ꎬ利用 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 载体库共
转化对烟草基因进行高通量靶向编辑以构建突变体库的方法切实可行ꎬ并且该方法有共转化率高、编辑率
高和脱靶编辑概率低等特点ꎮ
关键词: 烟草ꎬ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ꎬ 烟草香气ꎬ 靶向编辑ꎬ 脱靶编辑
中图分类号: Ｑ９４３ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０２４)０７￣１２７８￣１１

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ

ａｒｏｍａ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９

１ ２ １ ３ １
ＺＥＮＧ Ｗａｎｌｉ ꎬ ＬＩＡＮＧ Ｇａｎｇ ꎬ ＧＡＯ Ｑｉａｎ ꎬ ＬＩ Ｙｕａｎｃｈｕａｎ ꎬ ＸＵ Ｌｉ ꎬ
１ １ １∗
ＪＩＡＮＧ Ｊｉａｒｕｉ ꎬ ＸＵ Ｙｏｎｇ ꎬ ＸＩＡＮＧ Ｈａｉｙｉｎｇ

( １. Ｙｕｎｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ Ｒ ＆ Ｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｙｕｎｎａｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ.ꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２３１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. ＣＡＳ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ Ｕｓｅꎬ Ｘｉｓｈｕａｎｇｂａｎｎａ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａ )

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ｗｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｇＲＮＡｓ ｏｆ １００ ａｒｏｍａ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏꎬ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ １００
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ ｅｄｉｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓꎬ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｅ ｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅꎬ ｏｎ￣ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒａｔｅꎬ ａｎｄ ｏｆｆ￣

收稿日期: ２０２３－１０－２２ 接受日期: ２０２３－１２－０６
基金项目: 云南省烟草化学重点实验室开放课题(２０２１５３９２００３４０２４８)ꎻ 中国烟草总公司重大科技项目(１１０２０２１０１０３４[ＪＹ￣１１])ꎮ
第一作者: 曾婉俐(１９８３—)ꎬ博士ꎬ主要从事烟草育种研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)１６５６９１９７３＠ ｑｑ.ｃｏｍꎮ
∗
通信作者: 向海英ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事烟草育种研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｃａｓｅｘｈｙ＠ １２６.ｃｏｍꎮ