Page 111 - 《广西植物》2020年第5期

５ 期 张睿哲等: 人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶的纯化及其反应特性 ７ ０ ７

ｗａｓ １５％－２５％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｂｙ Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐ. ＧＲＢ３￣Ｘ８ｒ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
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ｗａｓ ６５.６ ｋｕ ｂｙ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ. Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ０.２３７ ｍｇｍＬ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ
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ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ａｔｔａｉｎａｂｌｅ ａｓ １６９ Ｕｍｇ ꎬ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｗａｓ １３.７０ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ｗａｓ
９.３９％. Ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ３￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｐＨ ５.０ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ. Ｔｈｅ ｅｎ￣
ｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＨ ３.０－５.０ꎬ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ４５ ℃ꎬ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｒａｎｇｅ ｏｆ ｐＨ ４.０－６.０. Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｅｎｔｅｒｅｄ ｔｈｅ ｍｉｘｅｄ￣ｏｒｄｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｔ ２０ ｍｉｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉ￣
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ｎｅｔｉｃｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｋ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ８.７７ ｍｍｏｌＬ ａｎｄ Ｖ ｗａｓ ５７.４４ ｍｍｏｌＬ ｈ . Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ
ｍ ｍａｘ
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ｍａｘｉｍｕｍ ａｔ ６０ ｍｉｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｅｄ ｔｅｎｄｅｄ ｔｏ ｂｅ ｓｔａｂｌｅꎬ ａｎｄ Ｖ ｗａｓ ６６.６３ ｍｍｏｌＬ ｈ . Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｎ ｃａｔａｌｙｔｉｃ
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ｍａｘ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｆｉｒｓｔｌｙ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｓ ２０￣Ｏ￣ｘｙｌｏｓｅ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ３ꎬ ｓｅｃｏｎｄｌｙ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｓ
３￣Ｏ￣ｇｌｕｃｏｓｙｌꎬ ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｈｅ ｆｏｒｍｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｆ２ ａｎｄ Ｃ￣Ｋ. Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙꎬ
ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ ｅｎｚｙｍｅ ｈａｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｏ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ３￣ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ Ｒｂ３￣ｇｌｕｃｏｓｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ３ꎬ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ３￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅꎬ ｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓꎬ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ｅｎｚｙｍｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ
我 国 高 产 量 的 人 参 属 植 物 是 人 参 ( Ｐａｎａｘ ２０１５)ꎻ但上述两种 Ａ. ｎｉｇｅｒ 所产的人参皂苷酶水

ｇｉｎｓｅｎｇ)、 三 七 ( Ｐ. ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ)、 西 洋 参 ( Ｐ. ｑｕ￣ 解的三 七 茎 叶 皂 苷 主 要 生 成 人 参 皂 苷 Ｃ￣Ｍｘ 和
ｉｎｇｕｅｆｏｌｕｓ)等ꎬ其 人 参 属 植 物 中 化 学 成 分 比 较 复 Ｃ￣Ｋꎬ并有越南参皂苷 Ｒ７ 和三七参皂苷 Ｆｃ 残留ꎬ
杂ꎬ主要的有效活性物质是人参皂苷( 宋亚会和姜 说明 Ａ. ｎｉｇｅｒ 菌产酶与三七茎叶复合皂苷反应时ꎬ
晓军ꎬ２００９)ꎮ 其主要活性成分为人参皂苷 Ｒｂ１、 很难水解 Ｃ￣Ｍｘ 或 Ｒｂ３ 皂苷的 ２０￣Ｏ￣末端木糖基ꎬ
Ｒｂ２、Ｒｂ３、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１ 等( 金凤燮ꎬ２００９)ꎮ 目 对 Ｒ７ 和 Ｆｃ 皂苷的 ３￣Ｏ￣末端木糖基无水解作用ꎬ
前ꎬ已分 离 鉴 定 出 １８２ 种 人 参 皂 苷 ( Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ 影响了高活性皂苷 Ｃ￣Ｋ 的产率ꎮ 为了解决酶很难
２０１７)ꎮ 现代药理学研究发现ꎬ某些稀有人参皂苷 水解 三 七 茎 叶 皂 苷 的 木 糖 基 问 题ꎬ 赵 信 平 等
具有很好的药理和临床方面的疗效ꎮ 因此ꎬ利用 (２０１８) 研究了 Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐ. ＧＲＢ３￣Ｘ８ｒ 菌产特异性
生物转化法ꎬ用含量较高的人参皂苷为底物ꎬ获得 人参皂苷 Ｒｂ３ 木糖苷酶( 分子量 ６６.７ ｋＤａ)ꎬ但是
产量大、纯度高的稀有人参皂苷ꎬ具有非常重要的 该酶仅能水解 Ｒｂ３ 的 ２０￣Ｏ￣木糖基ꎬ欠缺进一步水
科研意义和社会价值( 张怡轩等ꎬ２００８ꎻ吴红金和 解 ３￣Ｏ￣葡萄糖基生成 Ｆ２ 的酶活力ꎮ 因此ꎬ本文利

刘宇娜ꎬ２００８ꎻＪｉａꎬ２００９ꎻＪｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２ꎻ居乃香和 用生物 转 化 法 研 究 另 一 种 微 生 物 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ.
孙静ꎬ２０１４ꎻ韩淑娴和游云ꎬ２０１６ꎻ毛柳珺ꎬ２０１７)ꎮ Ｐ９０ｒ 菌所产的人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶ꎬ以期获
三七 茎 叶 皂 苷 以 Ｒｂ３ 为 主ꎬ Ｒｂ３ 分 子 带 有 得纯酶的相关性质和动力学等反应特性ꎮ
２０￣Ｏ￣Ｘｙｌ￣Ｇｌｃ￣糖链和 ３￣Ｏ￣Ｇｌｃ￣Ｇｌｃ￣糖链ꎬ活性低、难
吸收ꎬ因此三七茎叶利用率低( 金凤燮ꎬ２００９)ꎮ 为 １ 材料与方法
了提高三七茎叶皂苷的利用价值ꎬ将 Ｒｂ３ 转化为
高活性、低糖基的 Ｆ２、Ｃ￣Ｋ 皂苷ꎬ是提高三七茎叶 １.１ 材料、试剂和仪器
皂苷利用度的可行途径ꎮ 为此ꎬ本实验室研究了 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌ꎬ本实验室从大曲中筛

Ｒｂ３ 的生物转化ꎬＡｓｐｅｒｇｉｎｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｇ.４８ 菌产人参 选分离得到ꎮ 人参皂苷 Ｒｂ３、Ｒｄ、Ｆ２、Ｃ￣Ｋꎬ由天乐
皂苷酶 Ｉ 型( 分子量为 ７４ ｋＤ)ꎬ同时水解 Ｒｂ３ 的 集团提供ꎮ 标准蛋白(齐崴等ꎬ２００５)ꎬ购于大连宝
２０￣Ｏ￣木糖基和 ３￣Ｏ￣葡萄糖基ꎬ通过 Ｒｂ３→Ｃ￣Ｍｘ１→ 生物公司ꎮ 柠檬酸、过硫酸铵为天津市大茂化学
Ｃ￣Ｍｘ→Ｃ￣Ｋ 途径和 Ｒｂ３→Ｒｄ→Ｆ２→Ｃ￣Ｋ 的两个途 试剂厂产品ꎻ丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为北京化
径水解 Ｒｂ３(Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎻ还有 Ａ. ｎｉｇｅｒ ｇ.８４８ 工厂产品ꎻ甘氨酸、溴酚蓝、考马斯亮兰 Ｇ２５０、四
菌所产的人参皂苷酶 Ｉ 型( 分子量为 ７５ｋＤ)ꎬ水解 甲基乙二胺(ＴＥＭＥＤ)购置于国药集团化学试剂有
Ｒｂ３ 的糖基ꎬ生成 Ｒｄ、Ｆ２、Ｃ￣Ｋ 等皂苷( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ 限公司ꎻ十二烷基硫酸钠为北京鼎国生物技术发