Page 137 - 《广西植物》2020年第6期

６ 期 张梦佳等: 夏枯草 ＰｖＧＧＰＰＳ 基因的克隆和诱导表达分析 ８ ８ ３

ｄｏｎｅ. ｑＰＣＲ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰｖＧＧＰＰＳ ｇｅｎｅ ｉｎ ｅａｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｎｄ
ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｓ ｉｎ Ｐ. ｖｕｌｇａｒｉｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰｖＧＧＰＰＳ ｇｅｎｅ ｈａｄ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ １ ０９２ ｂｐ ａｎｄ
ｅｎｃｏｄｅｄ ３６３ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ｗｉｔｈ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ３８ ８１５.６８ Ｄ ａｎｄ ａｎ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ５.６９. ＰｖＧＧＰＰＳ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆａｍｉｌｙ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰｖＧＧ￣
ＰＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ａｎｄ Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ ＧＧＰＰＳ ｐｒｏｔｅｉｎ. ｑＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰｖＧＧＰＰＳ ｇｅｎｅ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｅａｒｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ. Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＰｖＧＧＰＰＳ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒ ａｆｔｅｒ ＧＡ３ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ２４ ｈꎬ ｏｎｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｔｒｅａｔｅｄ. Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰｖＧ￣
ＧＰＰＳ ｇｅｎｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｐｒｕｎｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｗａｓ ｑｕｉｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｄ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｔｒｅａｔ￣
ｍｅｎｔ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｌａｙ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｖＧＧＰＰＳ
ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｐ. ｖｕｌｇａｒｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｒｕｎｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓꎬ ＰｖＧＧＰＰＳꎬ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ

夏枯草( Ｐｒｕｎｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ) 为唇形科植物夏枯 敏ꎬ２０１５ꎻ梁敏华等ꎬ２０１８)ꎮ 本研究在前期获得的
草的干燥成熟果穗ꎬ始载于« 神农本草经»ꎬ具有清 夏枯草转录组数据库的基础上ꎬ克隆得到夏枯草

肝明目、消 肿 散 结 的 功 效 (« 中 华 人 民 共 和 国 药 ＧＧＰＰＳ 基因ꎬ通过诱导表达的分析探讨 ＧＧＰＰＳ 基
典»ꎬ２０１５)ꎬ广泛分布于全国各地ꎮ 夏枯草中含有 因对夏枯草中萜类成分合成的影响ꎮ
三萜类、黄酮类、有机酸类、香豆素类、甾体类等多
种化学成分( 汪晓河等ꎬ２０１９)ꎮ 夏枯草中次生代 １ 材料与方法
谢成分齐墩果酸和熊果酸具有明显的消炎、抗肿
瘤和抗 ＨＩＶ 等药理作用(张金华等ꎬ２０１８)ꎬ应用前 １.１ 材料、仪器

景巨大ꎮ 夏枯草作为药食两用之品ꎬ具有重要的 夏枯草样品采自河南省确山县夏枯草 ＧＡＰ 种
药用价值和经济价值ꎬ尤其是作为凉茶原材料的 植基地ꎬ由河南中医药大学董诚明教授鉴定为夏
需求量巨大ꎬ使得夏枯草市场需求量呈增加态势ꎬ 枯草(Ｐｒｕｎｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ)ꎮ
夏枯草资源逐渐变得紧张ꎮ 快速发展的高通量测 总 ＲＮＡ 提取试剂盒( 北京康为世纪生物科技
序技术和生物信息学分析方法为基因的鉴定和功 有限公司)ꎬ反转录试剂盒(Ｔｈｅｒｍｏ 公司)ꎬ荧光定量
能分析提供了更多的途径ꎬ吸引着越来越多的研 试剂盒(ＱＩＡＧＥＮ)ꎬＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ(ＴａＫａＲａ 公司)ꎬＰＣＲ
究者把目光投入到分子领域ꎮ 然而ꎬ目前已有的 产物回收试剂盒(上海生工)ꎬＰＣＲ 仪(美国 Ｂｉｏ￣Ｒａｄ
夏枯草分子水平相关研究还不够全面和准确ꎬ夏 公司 Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ)ꎬ荧光定量 ＰＣＲ 仪

枯草分子相关数据库也不够完善ꎮ (美国 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 公司 Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ)ꎮ
香叶基香叶基焦磷酸合酶( ｇｅｒａｎｙｌｇｅｒａｎｙｌ ｐｙ￣ １.２ 方法
ｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅꎬＧＧＰＰＳ)ꎬ是植物萜类物质合 １.２.１ 总 ＲＮＡ 提取与 ｃＤＮＡ 第一条链的合成 利
成的关键酶之一( 唐美琼等ꎬ２０１７ꎻ方洁ꎬ２０１７)ꎮ 用康为试剂植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒提取夏枯草
目前已经在拟南芥、丹参、地黄等多种植物中克隆 不同 组 织 的 总 ＲＮＡꎬ１％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 确 定
到 ＧＧＰＰＳ 基因(化文平ꎬ２００８ꎻＬｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１５ꎻ赵乐 ＲＮＡ 完整性ꎮ ｃＤＮＡ 的合成步骤按照 Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎ￣
等ꎬ２０１７ꎻ张艺丹ꎬ２０１８)ꎮ ＧＧＰＰＳ 在植 物 生 长 发 ｔｉｆｉｃ ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 进行

育过程中起着重要的作用ꎬＧＧＰＰＳ 通过催化三分 操作ꎬ反转录得到的 ｃＤＮＡ 置于－２０ ℃ 备用ꎮ
子 ＩＰＰ 和一分子 ＤＭＡＰＰ 反应生成 ＧＧＰＰꎮ ＧＧＰＰ １.２.２ ｃＤＮＡ 全长克隆 根据夏枯草转录组数据库
不仅是二萜类物质的前体物ꎬ还是类胡萝卜素、叶 基因 注 释 信 息ꎬ 选 取 表 达 丰 度 ( ＦＰＫＭ) 较 高、
绿素、生育酚、脱落酸、赤霉素等物质的共同前体 Ｅ￣ｖａｌｕｅ值较低且序列长度完整的 ＧＧＰＰＳ 基因的核
物ꎬ是植物多条重要次生代谢通路的节点( 韩立 苷 酸 序 列ꎬ 利 用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｅｒ ５. ０ 软 件 设 计