Page 117 - 《广西植物》2020年第8期
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１ １ ７ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
表 ２ 各种表达载体构建引物
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ
载体名称 正向引物 反向引物
Ｐｌａｓｍｉｄ ｎａｍｅ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ
ＡＤ￣ＭＹＢ９０ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＣＡＡＡＧＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣ
ＡＤ￣ＭＹＢ１１４ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＣＡＡＡＧＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＧＧＧＣ
ＡＤ￣ＭＹＢ７５ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＣＡＡＡＧＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣ
ＡＤ￣ＭＹＢ７５￣Ｎ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＣＡＡＡＧＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＡＣＡＡＣＡＣＧＧ
ＡＤ￣ＭＹＢ７５￣Ｃ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＣＣＧＴＧＴＴＧＴＡＡＧＡＴＡＡＡＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣ
ＭＹＢ７５￣ｎＹＦＰ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＧＴＣＣＡＡＡＧＧ ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣＧ
ＡＤ￣ＭＹＢ１１３ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＴＴＣＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡ
ＡＤ￣ＭＹＢ１１３￣Ｎ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＣＴＴＡＣＡＧＣＡＴＣ
ＡＤ￣ＭＹＢ１１３￣Ｃ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＡＣＧＡＴＧＡＡＣＧＡＴＧＣＴＧＴＡ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＴＴＣＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡ
ＭＹＢ１１３￣ｎＹＦＰ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＡＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧ ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣＡＧＴＴＣＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＣ
ＧＡＤ￣ＴＴ８ ＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＧ ＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＧ
ＧＡＤ￣ＴＴ８￣Ｎ ＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＧ ＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＡＧＣＣＴＣＴＴＡＴＣＴＴＴＡＧＴＧＴＴＧＴ
ＧＡＤ￣ＴＴ８￣Ｃ ＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＣ ＧＡＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＡＴＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＧ
ＴＴ８￣ｎＹＦＰ ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＧＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＧ ＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＴＡＴＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＧＧ
ＧＡＤ￣ ＴＴＧ１ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴ
ＧＡＤ￣ ＴＴＧ１￣Ｎ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＧＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＧ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＣＴＡＴＡＡＧＣＴＧＡＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＣ
ＧＡＤ￣ ＴＴＧ１￣Ｃ ＧＡＴＴＡＣＧＣＴＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＡＧＧＴＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴＴ ＡＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴ
ＴＴＧ１￣ｎＹＦＰ ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＧ ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＡＣＴＣＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＴＧＴＴＡＧ
ＧＵＳ￣ｎＹＦＰ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣ ＡＴＧＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣ ＧＣＴＣＴＡＧＡ ＴＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴ
ＧＵＳ￣ｃＹＦＰ ＧＣＴＣＴＡＧＡ ＡＴＧＧＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴ
ＢＤ￣ＡＢＩ５ ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＧＡＧＴＣＧＴＣＣ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＣ
１－１６４
ＢＤ￣ＡＢＩ５ ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＴＡＧＡＧＴＣＧＴＣＣ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＡＣＡＧ
ＢＤ￣ＡＢＩ５ １６５－２２０ ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＡＴ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＣＴＴ
ＢＤ￣ＡＢＩ５ １６５－４４２ ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＡＡＴ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＣ
２２１－３４９
ＢＤ￣ＡＢＩ５ ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＣＴＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＣＴＡＡＴＣＣＡＡＡ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣ
３５０－４４２
ＢＤ￣ＡＢＩ５ ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＡＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＣ
ＡＢＩ５￣ｃＹＦＰ ＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＴＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＡＣＧＡＡＧＴＴＧＡＣＧ ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧＧＧＴＴＣＣＴＣ
和 ＡＤ￣ＭＹＢ７５￣ＣꎻＭＹＢ１１３ 的第 １ ~ １２３ 个氨基酸为 ｃＹＦＰꎬ而 ＭＹＢ７５、ＭＹＢ９０、ＭＹＢ１１３、ＭＹＢ１１４、ＴＴ８ 和
Ｎ 端ꎬ第 １２４ ~ ２４７ 个氨基酸为 Ｃ 端ꎬ构建分段质粒 ＴＴＧ１ 的编码序列引入 ｐＦＧＣ￣ｎＹＦＰ 以与 ｎＹＦＰ 形成
ＡＤ￣ＭＹＢ１１３￣Ｎ 和 ＡＤ￣ＭＹＢ１１３￣ＣꎻＴＴ８ 的第 １ ~ ３５８ Ｎ 末端框内融合ꎮ 将得到的质粒导入根癌土壤杆菌
个氨基酸为 Ｎ 端ꎬ第 ３５９ ~ ５１９ 个氨基酸为 Ｃ 端ꎬ (菌株 ＧＶ３１０１)中ꎬ如 Ｈｕ ＆ Ｙｕ (２０１４)所述进行烟
构建分段质粒 ＡＤ￣ＴＴ８￣Ｎ 和 ＡＤ￣ＴＴ８￣ＣꎻＴＴＧ１ 的第 草浸润ꎬ将不同质粒融合注射烟草叶片ꎬ常温放置
１ ~ １７４ 个氨基酸为 Ｎ 端ꎬ第 １７５ ~ ３４２ 个氨基酸为 于暗处 ４８ ｈ 后用荧光染料染色ꎬ撕取注射叶片部分
Ｃ 端ꎬ 构 建 分 段 质 粒 ＡＤ￣ＴＴＧ１￣Ｎ 和 ＡＤ￣ＴＴＧ１￣Ｃꎮ 叶 肉 组 织 涂 片ꎬ 在 共 聚 焦 激 光 扫 描 显 微 镜
将融合于不同载体的质粒进行酵母双杂交实验ꎮ (ＯｌｙｍｐｕｓꎬＴｏｋｙｏꎬＪａｐａｎ)下观察 ＹＦＰ 和 ＤＡＰＩ 荧光ꎮ
用于构建各种克隆的引物见表 ２ꎮ 本实验中用于构建各种克隆的引物见表 ２ꎮ
１.６ 双分子荧光互补实验(ＢｉＦＣ Ａｓｓａｙｓ)
将 １７３ 个氨基酸 Ｎ 末端增强的 ＹＦＰ(ｎＹＦＰ)和 ２ 结果与分析
６４ 个氨基酸 Ｃ 末端片段(ｃＹＦＰ)的 ｃＤＮＡ 序列进行
ＰＣＲ 扩增并克隆到 ｐＦＧＣ５９４１ 中分别产生 ｐＦＧＣ￣ ２.１ ＡＢＡ 促进拟南芥幼苗中花青素的积累
ｎＹＦＰ 和 ｐＦＧＣ￣ｃＹＦＰ ( Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００８)ꎮ 将 ＡＢＩ５ 将 Ｃｏｌｕｍｂｉａ 生态型背景的野生型( ＷＴ) 种子
的编码序列融合于 ｐＦＧＣ￣ｃＹＦＰ 中构建质粒 ＡＢＩ５￣ 播种 在 含 有 不 同 浓 度 ＡＢＡ ( ０、 ０. ２５、 ０. ５０、 ０. ７５
