Page 151 - 《广西植物》2021年第6期

ᤃ 期 韩 丹 宇 等 ᧥ 水曲柳中 ᤹ɔଧᒦ԰ 基因表达特征分析 ँ ँ ँ
一ܦ良好的成熟水曲柳植株ྉ 共取自 ጢ 棵树ᖔ至少 品的 ኏શዶᤥ 利用反转录试剂盒将得到的 ኏શዶ 反转
重复三次ɯᤥ 在超净工作台中对材料进行消毒ᖔ以 录成 ዹ᧕શዶᖔ将其与本研究室前期所测得的水曲柳
待后续检测 ᤹ɔଧᒦ԰ 基因的表达量ᤥ 对照组除消毒 转录组数据进行比对ᖔ根据 ዹ᧕શዶ 序列设计引物ྉ表
外同样不做任何处理ᤥ 将消毒后的样品分别放入 ϟɯᖔ克隆 ᤹ɔଧᒦ԰ 基因编码区全长ྉ图 ϟɯᤥ 进行多次
液氮冷冻ᖔ置于ͱऐԡ ቩ 的冰箱中保存ᤥ ۪ऊ኏ྉ反应体系为 ԰ԡ ဂᓂᤥ 其中ᖔ模板 ዹ᧕શዶ ԰ ဂᓂᖔ正
ϓॹԣ 研究方法 反引物各 ϟဂᓂᖔ ʛશఋ۪ ϟ঎ᤃဂᓂᖔ ʢఋᑕी ԡ঎԰ဂᓂᖔ ାࣼ஦஦ᔀʢ ԰
ϟ঎԰঎ϟ 选用的内参基因和算法জ 引入在水曲柳中 ဂᓂᖔ ʛʛ̀ ᨃϟ԰঎԰ ဂᓂɯᖔ并通过凝胶回收纯化产物ᖔ应
԰
表达 量相对稳定的持家 基 因 ௴І ྉ 任小龙等ᖔ 用 ᡱᥘ᧕ϟऐ᥋ఋ 载体连接后转化进入 Ȯᥘϟԡँ 感受态细
԰ԡϟጢɯᖔ以便于获得更加准确的基因表达量ᖔ同时 胞ᖔ并在加有抗性的培养基上培养单菌落ᖔ选取多个
ͱσσ ऊఋ
也方便对数据进行比对校正ᤥ 算法使用 ԰ 菌落进行菌液验证ᖔ然后送至公司进行测序ᤥ
ྉσऊఋ 处理组ͱσऊఋ 对照组ɯᤥ ϟ঎԰঎ሕ Þቂ᤹ɔଧᒦ԰ 在响应逆境胁迫及激素信号表达下
ϟ঎԰঎԰ Þቂ᤹ɔଧᒦ԰ 基因克隆方法জ 应用 ఋʢᔽ༁᥋ऊఋዶା 法 的分析方法জ 根据 Þቂ᤹ɔଧᒦ԰ 基因序列设计荧光定
分别提取样品根ܦ 茎ܦ 叶ܦ 芽ܦ 雄花ܦ 雌花ܦ 种子的 量 ۪ऊ኏ 引物ྉ表 ϟɯᖔ应用荧光定量 ۪ऊ኏ 技术分别分
኏શዶྉ每次取各样品 ԡ঎ጢ ੫ɯᤥ 因 ऊఋዶା 与蛋白质和 析 Þቂ᤹ɔଧᒦ԰ 基因在 ࿗ቩ 低温胁迫ܦશᑕऊ᤟ 胁迫ܦ᧧ዶዶܦ
多糖类物质可结合形成复合物ᖔ利用有机溶剂分离 ዶାዶܦ᥈ዶ ܦȮዶܦ୩ዶ 激素诱导下的表达量ᤥ 样品均进行
ሕ
该复合物与核酸ᖔ并加入沉淀剂ᖔ可以得到不同样 ሕ 次重复检测ᤥ 利用 ԰ ͱσσऊఋ 法计算表达量ᤥ

表 ϓই Þቂ᤹ɔଧᒦԣ 基因序列克隆以及荧光定量 ۗࣷቴ 的引物序列设计
ఋᑕᤦ᤟ᔀ ϟজ ᧕ᔀ༁ᔽ੫Ⴟ ᡱʢᔽቝᔀʢ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ ஦ᆍʢ ዹ᤟ᆍႿᔽႿ੫ Þቂ᤹ɔଧᒦ԰ ੫ᔀႿᔀ ᑕႿʛ ीࣼᑕႿᡷᔽᡷᑕᡷᔽ׹ᔀ ʢᔀᑕ᤟᥋ᡷᔽቝᔀ ۪ऊ኏
引物名称 引物序列 备注
۪ʢᔽቝᔀʢ Ⴟᑕቝᔀ ۪ʢᔽቝᔀʢ ༁ᔀीࣼᔀႿዹᔀ ኏ᔀቝᑕʢҴ

èቝᥘɟାᓂ԰᥋è ጢࣕ᥋ఋఋ᥈᥈ऊఋऊዶዶఋ᥈᥈᥈ዶዶ᥈᥈ఋऊఋऊऊ᥋ሕࣕ 基因克隆 ᥈ᔀႿᔀ ዹ᤟ᆍႿᔽႿ੫
èቝᥘɟାᓂ԰᥋኏ ጢࣕ᥋ఋఋዶఋఋఋऊዶఋఋఋऊऊዶ᥈᥈ऊऊఋऊఋ᥈ఋዶ᥈ऊ᥋ሕࣕ 基因克隆 ᥈ᔀႿᔀ ዹ᤟ᆍႿᔽႿ੫
ीèቝᥘɟାᓂ԰᥋è ጢࣕ᥋ఋ᥈ऊఋ᥈᥈ऊ᥈ఋఋऊ᥈ऊఋఋऊऊఋዶዶ᥋ሕࣕ 定量 ͐ࣼᑕႿᡷᔽᡷᑕᡷᔽ׹ᔀ
ीèቝᥘɟାᓂ԰᥋኏ ጢࣕ᥋᥈ዶ᥈ዶऊऊዶఋఋఋ᥈ఋఋዶऊऊዶዶ᥈ዶዶ᥈ዶऊఋ᥈᥋ሕࣕ 定量 ͐ࣼᑕႿᡷᔽᡷᑕᡷᔽ׹ᔀ

表现在蛋白质的构型ܦ稳定性ܦ以及其功能ᤥ 应用
԰জ 结果与分析 ۪ʢᆍ༁ዹᑕ᤟ᔀ 在线工具对 èቝᥘɟାᓂ԰ 蛋白进行疏水性分
析ྉ图 ሕɯᤥ 分析表明ᖔèቝᥘɟାᓂ԰ 有 ԰ϟ 个亲水区
ԣॹϓ 基因克隆 域和 ϟԡ 个疏水区域ᖔ总平均疏水性为 ͱ ԡ঎ᤃᤃԡᖔ是
克隆获得了 Þቂ᤹ɔଧᒦ԰ 的基因序列ྉ 图 ϟɯᖔ可 亲水性蛋白ᤥèቝᥘɟାᓂ԰ 蛋白的疏水区域有利于
知该基因全长 Ꭾᤃ԰ ᤦᡱᖔ编码 ԰ጢሕ 个氨基酸ᤥ 蛋白质向内部折叠形成二级结构ᖔ进一步形成结
ԣॹԣ 氨基酸序列比对及构建基因进化树 构域ᖔ并有利于蛋白形成 ም 螺旋ᖔ保证其自身稳定
应用 શऊା᧧ 里的 ۪ʢᆍᡷᔀᔽႿ ାᓂዶ୩ఋ 对 èቝᥘɟାᓂ԰ 进 性ᤥ 应用在线软件 ጶ଴۪ዶ୩ᢃ 中的 ऊᆍቝᡱࣼᡷᔀ ᡱ᧧ ᣰ ᥘऔ
行同源序列比对ᖔ利用相似度较高的同源序列构建 得出 èቝᥘɟାᓂ԰ 蛋白质的等电点为 ँ঎ԡ԰ᖔ所以该蛋
基因进化树ྉ图 ԰ɯ发现 èቝᥘɟାᓂ԰ 与棉花ܦ巴旦木ܦ 白在 ۪̀ 为 ँ঎ԡ԰ 时最不稳定且溶解度最小ᖔ易于
可可ܦ梅花等的氨基酸序列相似性较高ᖔ说明它们 沉淀析出ᤥ 同时蛋白质的黏度ܦ渗透压ܦ膨胀性以

亲缘关系较近ᤥ 及导电能力均为最小ᤥ
ԣॹᇺ 氨基酸理化性质的分析及 Þቂ᤹ɔଧᒦԣ 的疏水 ԣॹ྽ Þቂ᤹ɔଧᒦԣ 表达量在 ྽቎低温胁迫ܓટᐹࣷᤀ 胁迫
性预测 下的变化趋势
应用 ۪ʢᆍᡷ۪ᑕʢᑕቝ 在线工具分析预测 èቝᥘɟାᓂ԰ 水曲柳幼苗经不同胁迫处理时ᖔÞቂ᤹ɔଧᒦ԰ 基
氨基酸的理化性质ᤥ 结果表明ᖔèቝᥘɟାᓂ԰ 由 ԰ጢሕ 因表达量均较对照ྉ ௴Іɯ 上调表达ᖔ表达量随时间
个氨基酸组成ᖔ其中有 ԰ँ 个带负电的氨基酸残基 的变化而波动明显ྉ 图 ࿗ɯᤥ 用 ࿗ቩ 低温处理水曲
ྉዶ༁ᡱ շ ᥈᤟ࣼɯᖔ有 ሕऐ 个带正电的氨基酸残基ྉዶʢ੫ շ 柳幼苗时ᖔÞቂ᤹ɔଧᒦ԰ 基因表达量在 ԡܦϟܦሕܦᤃܦϟ԰ܦ
ᓂᢃ༁ɯᤥ 不稳定指数为 ࿗ँ঎ ँ࿗ᖔ所以是不稳定蛋白 ԰࿗ܦ࿗ऐ ၤ 总体呈现先下降后上升的趋势ᤥ 在其被
质ᤥ 蛋白质的疏水性对蛋白质的影响巨大ᖔ主要 胁迫 ϟၤ 后 Þቂ᤹ɔଧᒦ԰ 相对表达量最高ᖔ 为对照组