Page 121 - 《广西植物》2022年第12期
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１２ 期 吴高殷等: 碳氮源对花榈木胚性愈伤组织诱导、发育及有机物积累的影响 ２ １ １ １
６ 组氮源添加至胚性愈伤组织、体细胞胚和体细胞 Ｌ 蔗糖(Ｃ４)ꎻ
￣１
胚分化诱导培养基中ꎬ通过分析不同碳氮源处理 (３)有机氮源:分别添加 ０.５ ｇＬ 谷氨酰胺
￣１
下胚性愈伤组织诱导率、体胚诱导率及有机物积 Ｇｌｎ(Ｎ１)、０.５ ｇＬ 水解酪蛋白 ＣＨ( Ｎ２)、０.５ ｇ
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累的差异ꎬ拟探讨以下问题:(１) 碳氮源对花榈木 Ｌ 水解乳蛋白 ＬＨ(Ｎ３)、０.２５ ｇＬ Ｇｌｎ ＋ ０.２５ ｇ
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体胚诱导率是否具显著影响ꎻ(２) 碳氮源是否影响 Ｌ ＣＨ ( Ｎ４)、 ０. ２５ ｇ Ｌ Ｇｌｎ ＋ ０. ２５ ｇ Ｌ ￣１ ＬＨ
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花榈木胚性愈伤组织有机物积累ꎬ从而对体胚诱 (Ｎ５)、０.２５ ｇＬ ＣＨ ＋０.２５ ｇＬ ＬＨ(Ｎ６) 和以不
导起作用ꎮ 旨在筛选花榈木体胚发生诱导适宜的 添加有机氮为对照(Ｎ０)ꎮ
碳氮源ꎬ进而为优化花榈木体胚再生体系提供参 上述各阶段每个处理重复 ３ 次ꎬ每个重复接种
考依据ꎮ ２０ 个外植体ꎮ 所有培养基在灭菌前( １２１ ℃ ꎬ２０
ｍｉｎ)ｐＨ 值均调节至 ５.９０ ± ０.２ꎬ培养条件为暗培
１ 材料与方法 养ꎬ(２５±２) ℃ ꎮ
１.２.３ 胚性愈伤组织的生长和有机物测定 接种
１.１ 试验材料 后第 ２５ 天ꎬ分别测定不同处理培养基的 ｐＨ 值( 雷
于 ２０１７ 年 １１ 月采摘贵州省孟关(２６°１４′２３" 磁 ＰＨＳ￣３Ｃ 型 ｐＨ 计ꎬ上 海)ꎻ 并 收 集 胚 性 愈 伤 组
Ｅꎬ１０６°２５′１２" Ｎꎬ海拔 １ １１２ ｍ)同一株花榈木种子ꎮ 织ꎬ使 用 万 分 之 一 天 平 ( 赛 多 利 斯 Ｐｒａｃｔｕｍ２２４￣
浓硫酸浸泡种子 １ ｈꎬ回收浓硫酸ꎬ自来水洗净种子ꎬ １ＣＮꎬ德国)测量单个成熟胚诱导获得的胚性愈伤
７５％乙醇处理 １ ｍｉｎꎬ２％ ＮａＣｌＯ 处理 ８ ｍｉｎꎬ无菌水 组织重量ꎬ装入 ５ ｍＬ 离心管ꎬ贮藏于－ ８０ ℃ 超低
清洗 ５ 次ꎬ无菌水浸泡种子 ２４ ｈꎬ使其吸胀ꎬ在超净 温冰箱ꎻ待样品收集完毕ꎬ对生理指标进行统一测
工作台上使用接种工具剥取成熟胚ꎬ备用ꎮ 定ꎮ 可溶性糖和淀粉含量的测定采用硫酸－蒽酮
１.２ 研究方法 法ꎬ可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法( 刘
１.２.１ 花榈木体胚发生诱导过程 (１) 胚性愈伤组 萍等ꎬ２０１６)ꎬ每个处理重复测定 ３ 次ꎮ
织诱导:以成熟胚为外植体ꎬ接种至胚性愈伤组织 １.３ 体胚诱导相关指标计算
诱导培养基中ꎮ 胚性愈伤诱导培养基参考 Ｗｕ 等 胚性愈伤组织诱导率、体细胞胚诱导率和体
￣１
(２０２０)的配方:Ｂ 培养基、０.２ ｍｇ Ｌ ６￣ＢＡ、２.０ 细胞胚分化率的计算公式如下:
５
￣１ ￣１ 胚性愈伤组织诱导率(％) ＝ ( 胚性愈伤组织
ｍｇＬ ２ꎬ４￣Ｄ 和 ２.５ ｇＬ 结冷胶ꎬ暗培养ꎬ(２５±
２) ℃ ꎮ 第 ２５ 天统计胚性愈伤组织诱导率ꎮ (２) 的数量 / 接种成熟胚数量) ×１００ꎻ
体细胞胚诱导:将(１)中胚性愈伤组织转接至体细 体细胞胚诱导率(％) ＝ ( 体细胞胚的数量 / 接
胞胚诱导培养基ꎬ体细胞胚诱导培养基参考 Ｗｕ 等 种胚性愈伤组织数量) ×１００ꎻ
￣１ 体细胞胚分化率(％) ＝ ( 体细胞胚的萌发数
(２０２０) 的 配 方: Ｂ５ 培 养 基、０. ５ ｍｇ Ｌ ＫＴ、１. ０
￣１ ￣１
ｍｇＬ ２ꎬ４￣Ｄ 和 ２.５ ｇＬ 结冷胶ꎬ暗培养ꎬ(２５± 量 / 接种体细胞胚数量) ×１００ꎮ
２) ℃ ꎮ 培养 ４ 周后统计体细胞胚诱导率ꎮ (３) 体 １.４ 数据处理
细胞胚分化诱导:将(２)中体细胞胚转接至体细胞 试验数据用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００７ 进行统
胚分化诱导培养基ꎬ体细胞胚分化诱导培养基参 计处理ꎬ使用 ＳＰＳＳ １８.０ 软件
￣１ 对数据进行单因素方差分析ꎬ通过 Ｔｕｒｋｅｙ 检
考 Ｗｕ 等(２０２０) 的配方:Ｂ５ 培养基ꎬ０.５ ｍｇＬ
￣１ ￣２ ￣１
ＴＤＺꎬ０.２ ｍｇＬ ＮＡＡꎬ光照强度 ２０ μｍｍ ｓ ꎬ１６ 验进行差异显著分析( Ｐ<０.０５)ꎬ最后使用 Ｏｒｉｇｉｎ
￣１
ｈｄ ꎻ６０ ｄ 后统计体细胞胚分化率ꎮ ２０１９ 作图ꎮ
１.２.２ 不同碳氮源添加的试验设计 在上述培养
的(１)(２)(３) 阶段均添加不同碳源、不同浓度蔗 ２ 结果与分析
糖和有机氮源ꎬ具体设计为:
￣１ ２.１ 花榈木体胚发生的诱导
(１)碳源:分别添加 ３０ ｇＬ 蔗糖( Ｔ１)、３０
￣１ ￣１ 成熟胚在胚性愈伤组织 诱 导 培 养 基 中 培 养
ｇＬ 葡萄糖 (Ｔ２)和 ３０ ｇＬ 麦芽糖(Ｔ３)ꎻ
￣１
(２)蔗糖浓度:分别添加 ２０ ｇＬ 蔗糖( Ｃ１)、 ７ ~ １０ ｄꎬ愈伤组织从成熟胚四周长出ꎮ 培养 ２５ ｄ
￣１ ￣１ 后ꎬ胚性愈伤组织为乳白色、黄白色或黄色ꎬ并在
３０ ｇＬ 蔗糖(Ｃ２)、４０ ｇＬ 蔗糖( Ｃ３) 和 ５０ ｇ
