Page 38 - 《广西植物》2023年第1期
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３ ４ 广 西 植 物 ４３ 卷
方法具有一定的局限性ꎬ尤其是近缘种、易混种在 基因的注释依据参考序列和开放阅读框确定起始
没有花和果等关键特征的情况下分类鉴定难度比 密码子和终止子位置ꎮ
较大ꎬ因此容易出现错误鉴定ꎮ 随着 ＤＮＡ 测序技 １.３ 系统发育分析
术的快速发展ꎬ分子鉴定方法因具有方便、快捷和 在 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ 软件中提取新测 ２９ 份样品的叶绿
准确等特点而被广泛应用于物种和药材鉴定( Ｙｕ 体基因片段 ｐｓｂＤ￣ｔｒｎＴ 和 ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦꎬ以及核糖体基因
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ 本研究以澄清傣药“ 傣百解” 基原 序列 ＩＴＳ ( 包 括 ＩＴＳ１、 ５. ８Ｓ、 ＩＴＳ２ 三 个 区)ꎬ 并 从
植物为目的ꎬ利用栽培的“傣百解” 基原植物材料、 ＧｅｎＢａｎｋ 上下载已有的牛奶菜属 ４２ 种、南山藤属 １
通光散以及牛奶菜族的其他植物样品ꎬ采用形态 种以及匙羹藤属 ２ 种的 ｐｓｂＤ￣ｔｒｎＴ、ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＴ 以及 ＩＴＳ
结合分子的方法ꎬ通过整合形态性状比较和系统 序列ꎬ 以 吊 灯 花 属 ( Ｃｅｒｏｐｅｇｉａ) 植 物 锥 顶 吊 灯 花
发育树分析ꎬ探讨以下问题:(１) “ 傣百解” 基原植 (Ｃｅｒｏｐｅｇｉａ ｎｉｌｏｔｉｃａ)作为外类群(表 ２)ꎮ 对 ３ 个基因
物是否为通光散ꎻ(２) “傣百解” 的近缘种有哪些ꎻ 片段的序列分别利用 ＭＡＦＦＴ ７.４５０ 软件进行多序
(３) 如何鉴别区分“傣百解”及其近缘种ꎮ 列自动比对 (Ｋａｔｏｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎬ输入到 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ
软件将模糊的区域或空位进行删除或调整ꎮ 使用
１ 材料与方法 贝叶斯推断法(Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅꎬ ＢＩ)、最大似然法
(ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄꎬ ＭＬ) 和最大简约法(ｍａｘｉｍｕｍ
１.１ 材料 ｐａｒｓｉｍｏｎｙꎬ ＭＰ)对 ３ 个片段分别进行单独和联合重
新收集了夹竹桃科牛奶菜属 ５ 种共 １７ 份样 建ꎮ 对 ３ 个基因 片 段 矩 阵 分 别 利 用 ｊＭｏｄｅｌｔｅｓｔ ２
品ꎬ包括栽培于中国医学科学院药用植物所云南 ２.１.６ꎬ选择贝叶斯信息量准则(Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
分所南药 园 “ 傣 百 解” 样 品 ４ 份ꎬ 以 及 南 山 藤 属 ｃｒｉｔｅｒｉｏｎꎬ ＢＩＣ)(Ｄａｒｒｉｂａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２) 筛选出序列矩
(Ｄｒｅｇｅａ) ２ 种 ７ 份样品和匙羹藤属( Ｇｙｍｎｅｍａ) １ 阵最 佳 核 苷 酸 替 代 模 型ꎬ 并 采 用 Ｍｒｂａｙｅｓ ３. ２. ７
种 １ 份样品ꎮ 具体样品来源和凭证信息如表 １ 所 (Ｈｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋ ＆ Ｒｏｎｑｕｉｓｔꎬ ２００１)进行贝叶斯系统发
示ꎮ 采集植物样品的新鲜叶片经变色硅胶进行快 生分析ꎮ 采用最大似然法时选用 ＲＡｘＭＬ￣ＨＰＣ２ ｏｎ
速干燥ꎬ并低温保存ꎬ以备实验所需ꎮ ＸＳＥＤＥ ８.２.１２ 工具(Ａｌｅｘａｎｄｒｏｓꎬ ２０１４) ꎬ选择 ＧＴＲ＋
１.２ ＤＮＡ 提取、测序和数据处理 ＣＡＴ 模型ꎬ并设置 １ ０００ 次靴带值估算分支的支持
对用硅胶干燥后的样品ꎬ先利用改良的十六 率(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｓｕｐｐｏｒｔ ｖａｌｕｅꎬ ＢＳ)ꎬ使用 ＣＩＰＲＥＳ 网站
烷基三甲基溴化铵(ＣＴＡＢ)法提取总 ＤＮＡ (Ｄｏｙｌｅ ＆ 在线构建 ＭＬ 树ꎮ 采用最大简约法时使用 ＭＥＧＡ
Ｄｏｙｌｅꎬ １９８７)ꎬ再使用琼脂糖凝胶电泳和 Ｎａｎｏｄｒｏｐ １０.２.６ 软件(Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎬ使用子树修剪和
分光光度计评估 ＤＮＡ 质量ꎮ 对检测合格的 ＤＮＡ 嫁接(Ｓｕｂｔｒｅｅ￣Ｐｒｕｎｉｎｇ￣Ｒｅｇｒａｆｉｔｉｎｇꎬ ＳＰＲ)算法进行分
样品ꎬ使用 Ｃｏｖａｒｉｓ 超声波破碎仪随机打断ꎬ随后通 析获得 ＭＰ 树(Ｎｅｉ ＆ Ｋｕｍａｒꎬ ２０００)ꎮ 构建系统进化
过末端修复、加 Ａ 尾、加测序接头、纯化、ＰＣＲ 扩 树时使用 ＦｉｇＴｒｅｅ １.４.１ (Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９) 进行美化ꎮ
增、片段筛选等步骤ꎬ完成片段长度为 ３５０ ｂｐ 的测 １.４ 形态特征比较
序文库制备ꎮ 对构建好的测序文库使用 Ｑｕｂｉｔ ２.０ 将采集到的“傣百解”样品与通光散的模式标
对浓度进行检测ꎬ定量范围为 ２ ~ １ ０００ ｎｇꎬ依据溶 本进行形态观察ꎬ并进一步比较分析在系统树上
度进行多样品混合ꎬ并利用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ６０００ 与“傣百解”亲缘关系最近的物种ꎬ观察和比较“ 傣
进行双向 １５０ ｂｐ 读长测序ꎮ 对测序原始数据( ｒａｗ 百解”基原植物与其姐妹种之间的形态特征差异ꎮ
ｄａｔａ) 直 接 使 用 ＧｅｔＯｒｇａｎｅｌｌｅ 软 件 包 ( Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ
２０２０) 进行叶绿体基因组和核糖体 ＤＮＡ 从头( ｄｅ ２ 结果与分析
ｎｏｖｏ)组装ꎮ 选取长春花( Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ) 的
叶 绿 体 基 因 组 ( ＫＣ５６１１３９ ) 和 核 糖 体 基 因 ２.１ 基因序列特征
(ＨＱ１３０６５７) 序 列 作 为 参 考 序 列ꎬ 借 助 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ 核糖体 ＩＴＳ 矩阵的长度为 ７６８ ｂｐꎬ包含 ３３４ 个
(Ｋｅａｒｓｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２) 对新测物种进行初步注释ꎬ 变异位点(ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｉｔｅｓ)ꎬ其中 ２０２ 个为位系统发
相似 性 参 数 设 置 为 ７０％ꎬ 并 结 合 ＯＲＦ ( ｏｐｅｎ 育信 息 位 点 ( ｐａｒｓｉｍｏｎｙ￣ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ ｓｉｔｅ)ꎮ 叶 绿 体
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ) 手工调整注释结果ꎬ其中蛋白编码 片段 ｐｓｂＤ￣ｔｒｎＴ 矩阵的长度为 １ ６７６ ｂｐꎬ 包含 ２４７
