Page 123 - 《广西植物》2023年第2期

２ 期 羽健宾等: 粉葛 ＰｔＣＨＩ 基因的克隆、原核表达和亚细胞定位 ３ １ ７

质网、过氧化物酶体和质体上也检测到荧光ꎮ 因 物公司测序ꎬ在 ＤＮＡＭＡＮ 软件中进行序列比对并
此ꎬＣＨＩ 基因在细胞中的定位是多样化的ꎬ并且同为 完成克隆ꎮ 用表 １ 中引物 ＰｔＣＨＩ￣ＤＬＦ、ＰｔＣＨＩ￣ＤＬＲ
ＣＨＩ 基因在不同物种中的定位存在差异ꎮ 对野葛和粉葛的 ＣＨＩ 基因做表达量检测ꎮ
基于本研究的前期研究结果ꎬ即在野葛和粉葛 １.４ 粉葛 ＰｔＣＨＩ 基因的生物信息学分析
中葛根素及总黄酮的含量存在显著差异ꎬ并根据前 利用在线工具 ＮＣＢＩ 中的 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 找到基
人在其他物种中发现查尔酮异构酶是黄酮代谢途 因的开放阅读框ꎻ利用在线工具 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 预测蛋
径中的关键酶且在黄酮类化合物合成中起重要作 白的 理 化 性 质ꎻ 利 用 在 线 工 具 ＳＯＰＭＡ、 ＳＷＩＳＳ￣
用ꎬ同 时 依 托 Ｔｅｒａｉ 等 ( １９９６) 在 野 葛 ( Ｐｕｅｒａｒｉａ ＭＯＤＥＬ 及 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ 分别进行蛋白二级、三级
ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ. ｌｏｂａｔａ)中成功克隆到一个长 ７５６ ｂｐ 的 结 构 预 测 和 亚 细 胞 定 位 的 预 测ꎻ 经 ＮｅｔＰｈｏｓ ３. １
ＣＨＩ 基因ꎬ该基因包含长 ６７５ ｂｐ 的 ＯＲＦ 框ꎬ编码 Ｓｅｒｖｅｒ 在线预测磷酸化位点ꎻ利用 ＳＴＲＩＮＧ 软件ꎬ
２２５ 个氨基酸ꎬ蛋白大小 ２３ ８０３ Ｄａꎮ 因此ꎬ本研究 以大豆蛋白数据库分析蛋白之间的互作关系ꎻ利
通过同源克隆的方法ꎬ用 ＩＰＴＧ 体外诱导和分离蛋 用 ＭＥＧＡ ７.０ 软件构建系统进化树ꎮ

白ꎬ同时通过拟南芥原生质体ꎬ拟探讨以下问题: １.５ 原核表达及 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测
(１)ＣＨＩ 基因在粉葛和野葛中是否存在差异ꎻ(２) 用表 １ 中 的 引 物 ＰｔＣＨＩ￣ＹＨＦ、 ＰｔＣＨＩ￣ＹＨＲ 将
ＣＨＩ 基因在野葛和粉葛中的表达量情况ꎻ(３)ＣＨＩ 基 克隆完成的目的基因的 ＯＲＦ 框纯化后与线性化载
因在细胞中的定位ꎮ 本研究结果将为野葛与粉葛 体 ｐｅｔ￣２８ａ 相 连 得 到 重 组 子 ｐｅｔ２８ａ￣ＰｔＣＨＩꎮ 用
中葛根素含量和总黄酮含量差异的探讨提供信息ꎬ ＩＰＴＧ 诱导后ꎬ经 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳分析后为可溶性
同时为进一步解析 ＰｔＣＨＩ 基因在粉葛中调控黄酮类 表达的蛋白ꎬ根据亲和层析原理ꎬ使用 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｉ￣
化合物积累的机制研究奠定基础ꎮ ＮＴＡ Ｒｅｓｉｎ 进行镍柱纯化ꎮ 对纯化后的蛋白进行
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测ꎬ使用的一抗为抗 Ｈｉｓ 标签鼠单
１ 材料与方法 克隆抗体ꎬ二抗为山羊抗小鼠 ＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)ꎮ
１.６ 亚细胞定位
１.１ 材料 用表 １ 中 的 引 物 ＰｔＣＨＩ￣ＹＸＢＦ、ＰｔＣＨＩ￣ＹＸＢＲ
供试材料为广西大学农 学 院 薯 类 课 题 组 选 将克隆完成的目的基因的 ＯＲＦ 框纯化后与线性
育ꎬ经 王 爱 勤 教 授 鉴 定 为 食 用 型 粉 葛 ( Ｐｕｅｒａｒｉａ 化载体 ｐＳＡＴ６￣ＥＹＦＰ￣Ｎ１ 相连得到 ｐＳＡＴ６￣ＥＹＦＰ￣
ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ. ｔｈｏｍｓｏｎｉｉ)‘桂葛 １ 号’ 和药食兼用型 Ｎ１￣ＰｔＣＨＩ 重组质粒ꎮ 选取苗龄在 ２５ ｄ 的拟南芥
野葛 ( Ｐ. ｍｏｎｔａｎａ ｖａｒ. ｌｏｂａｔａ) ‘ 桂 葛 ８ 号’ 品 种ꎬ 幼嫩叶 片ꎬ 通 过 酶 ( ２５％ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｒ１０ 和 ０. ３％
２０１６ 年种植于广西大学农学院教学科研基地ꎮ Ｍｅｃｅｒｏｚｙｍｅ Ｒ１０) 消化已切成细条的拟南芥叶片
１.２ 粉葛与野葛的葛根素和总黄酮的含量检测 ３ ~ ４ ｈꎬ经尼龙膜过滤后用洗涤液洗涤获取拟南
称取葛根粉样品 ０.１ ｇ 置于盛有 ５０ ｍＬ ３０％乙 芥原生质体ꎻ通过与原生质体和质粒总体积相等
醇的锥形瓶中ꎬ用保鲜膜封口并称重后于 ２５０ Ｗ 下 的 ２０％ ＰＥＧ４０００ 进行转化ꎬ转化结束后转移至
超声 ３０ ｍｉｎ ꎬ待室温冷却后再称重ꎬ用 ３０％乙醇补 ９６ 孔板中培养ꎬ待其培养结束即可制片ꎬ在共聚
足失去的重量ꎬ过滤后吸取 ５ ｍＬ 滤液于 ２５ ｍＬ 容量 焦显微镜下采集图像ꎮ
瓶且用 ３０％乙醇定容ꎬ即为 ２０ μｇｍＬ 的葛根素提
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２ 结果与分析
取液ꎮ 流动相为 Ｖ(甲醇) ∶ Ｖ(０.１％醋酸水)＝ ３０ ∶
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７０ꎬ流速为 １.０ ｍＬｍｉｎ ꎬ检测波长为 ２５０ ｎｍꎮ
葛根总黄酮的提取和检测均参照李增富和吴 ２.１ 粉葛和野葛的葛根素和总黄酮的含量测定

荣锋 (２００８) 的方法ꎮ 由图 １ 可知ꎬ野葛‘ 桂葛 ８ 号’ 中的葛根素含
１.３ 粉葛 ＰｔＣＨＩ 基因的克隆和表达量检测 量显著高于粉葛品种(‘桂葛 １ 号’)且是粉葛品种
提取‘桂葛 １ 号’ 的总 ＲＮＡꎬ并获得 ｃＤＮＡꎬ用 的 ３.５ 倍左右ꎬ野葛‘ 桂葛 ８ 号’ 的总黄酮含量也
表 １ 中引物 ＰｔＣＨＩ￣Ｆ、ＰｔＣＨＩ￣Ｒ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ纯 高于粉葛品种但差异不显著ꎮ
化后连接到 ｐＭＤ￣１９ Ｔ 载体ꎬ转入 ＤＨ５α 感受态细 ２.２ 粉葛 ＰｔＣＨＩ 基因的克隆与表达量分析
胞ꎬ挑选菌液扩增后将有特异条带的菌液送往生 根据已报道的野葛 ＣＨＩ 基因序列设计引物ꎬ